Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية

Published: February 2, 2018 doi: 10.3791/56613
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine, Medical Center University of Freiburg

Summary

حقن الوريد ذيل هيدرودينامية نواقل التكامل على أساس ينقول تمكن تعداء مستقرة من خلايا الكبد مورين المجراة في. نقدم هنا، بروتوكول عملي لنظم تعداء تمكن التعبير التأسيسي طويل الأجل للتحوير مفردة أو مجتمعة التعبير التأسيسي والدوكسيسيكلين إيندوسيبلي للتحوير أو مير-شرنا في الكبد.

Abstract

في نماذج أبحاث سرطان الكبد والتجدد، والالتهاب والتليف، نظم مرنة للتعبير الجيني في فيفو وإسكات مفيدة للغاية. حقن الوريد ذيل هيدرودينامية بني على أساس ينقول طريقة فعالة للتحوير الوراثي لخلايا الكبد في الفئران الكبار. وبالإضافة إلى التعبير التحوير التأسيسي، ويمكن استخدام هذا النظام لتطبيقات أكثر تقدما، مثل الجينات شرنا بوساطة تدق لأسفل، المترتبة على نظام كريسبر/Cas9 للحث على الطفرات الجينية، أو أنظمة إيندوسيبلي. هنا، يقدم مزيج التعبير كرير التأسيسي جنبا إلى جنب مع إيندوسيبلي التعبير التحوير أو مير-شرنا للاختيار كمثال لهذا الأسلوب. نحن تغطي إجراءات متعددة الخطوات بدءاً من إعداد الجمال النائم-يبني ينقول، إلى حقن وعلاج فئران، وإعداد أنسجة الكبد للتحليل قبل إيمونوستينينج. نظام عرض نهج موثوقة وفعالة لتحقيق معقدة التلاعب الجيني في خلايا الكبد. هي مفيدة على وجه الخصوص في تركيبة مع سلالات الماوس Cre/لوكسب-تعتمد ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من نماذج في البحوث المتعلقة بأمراض الكبد.

Introduction

ويعرض أمراض الكبد المزمنة في العالم أعباء صحية رئيسية1. نماذج حيوانية للبحث هي أدوات لا غنى عنها في دراسة أمراض الكبد، وساعدت على الإجابة على أسئلة معقدة في تجديد الكبد، والتهاب الكبد، وذلك فضلا عن سرطان الكبد2. أن عددا كبيرا من هذه النماذج الحيوانية تعتمد على التحوير الوراثي لخلايا الكبد. ومن ثم، هي أدوات فعالة التعامل مع التعبير الجيني في خلايا الكبد مفيدة3. أساليب محددة مثل تربية السلالات المهندسة وراثيا الماوس أو توليد النواقل الفيروسية للإصابة تتمثل هي الميناء تستغرق وقتاً طويلاً، أما الشواغل المتعلقة بالسلامة، أو تسفر عن التعبير التحوير الفقراء في خلايا الكبد في فيفو 4 , 5. حقن الوريد هيدرودينامية الذيل (هتفي) أسلوب بديل تعداء في الجسم الحي من خلايا الكبد مما يسمح للاستجواب سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة من وظيفة الجينات في الكبد. هتفي، يحل ناقل يحمل تسلسل الحمض النووي المطلوب في مجلد من المقابلة إلى 10% وزن الجسم الحيوان حقن المحلول الملحي. الحل ثم حقن الوريد الذيل ضمن 5-10 ق6. تتجاوز الناتج القلب، تدفقات المياه المالحة من الأجوف فينا أقل شأنا في عروق الكبد، مما أدى إلى التوسع في الكبد وتعداء الهيدروديناميكي لخلايا الكبد7. لتحقيق التكامل الجينوم مستقرة، اقترن الأسلوب ناقلات القائم على ينقول، مثل نظام ينقول النوم الجمال. هذه النظم يتوسط جزئ من ناقلات الأمراض المستهدفة مع مواقع جزئ الجينوم تحفزها8،ترانسبوساسي النوم الجمال-9. لنماذج من تليف الكبد أو التسرطن، من المستصوب غالباً للجينات أوفيريكسبريس أو الصمت في بعض النقاط الزمنية لنموذج المرض. لهذا الغرض، وأدوات للتعبير الجيني إيندوسيبلي مثل Cre/لوكسب-النظام أو نظام التعبير الجيني التتراسيكلين إيندوسيبلي (تيت في) قد تكون تستخدم10.

هنا، نحن وصف بروتوكول في فيفو تعداء لخلايا الكبد مورين استخدام هتفي نظام قائم على أساس ينقول الجمال النائم . بالإضافة إلى وضع بروتوكول للتعبير مستقرة، والمكونة من التحوير تحت سيطرة أحد المروجين الخاصة بالكبد، يمكننا وصف نظام ناقل أكثر تقدما الذي يجمع بين تعتمد على تاموكسيفن التأسيسي لجنة المساواة العرقية recombinase (كرير) التعبير التعبير إيندوسيبلي للتحوير أو تكييفها microRNA شرنا (مير-شرنا)، دعا صوغ نظام تيت11. في هذا النظام متجه، يتم استنساخ المتسلسلات إيندوسيبلي أو مير-شرناس للتعبير تعتمد على التتراسكلين في ناقلات العمود الفقري مع وجود نظام استنساخ ريكومبيناشونال، يسمح لتوليد سريعة وسهلة ل ناقلات جديدة12. ويغطي هذا الدليل القائم على الفيديو إعداد متجهات مناسبة والحقن والعلاج من الفئران لتحقيق التعبير التحوير/مير-شرنا إيندوسيبلي، وأخيراً إعداد أنسجة الكبد للتحليل. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يهدف إلى تمكين المزيج من أي نظام الماوس Cre/لوكسب بوساطة مع التعبير أو تدق لأسفل أي الجينات في الاختيار، مما يجعل من نظام التطبيق على نطاق واسع في البحوث المتعلقة بأمراض الكبد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، ووافقت عليها السلطات المسؤولة (ريجيرونج فون أوبيرباييرن، ميونيخ، ألمانيا وجامعة ستانفورد، الرعاية المؤسسية على الحيوان واستخدام اللجنة، ستانفورد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). قائمة بجميع والبلازميدات للاستنساخ (الخطوة 1 إلى 4) يرد في الجدول التكميلي S1.

1-استنساخ التحوير للتعبير الجيني التأسيسي

  1. تصميم كبسولة تفجير للتحوير التضخيم13،14.
  2. إضافة مواقع التقييد باشي (تاتا) إلى 5 ' نهاية التمهيدي إلى الأمام. إضافة مواقع التقييد للإداريين (جكجكجكك) أو فسيي (جككجكك) إلى نهاية 5 ' عكس التمهيدي.
  3. تضخيم التحوير ببكر استخدام الظروف الأمثل ل التحوير المرغوب فيه14. تنقية باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي متاحة تجارياً.
    ملاحظة: الصلب الوقت يعتمد على كبسولة تفجير تصميم في الخطوة 1، 1.، استطالة الزمن يعتمد على طول مدة بناء. على سبيل المثال، لبناء 1,000 bp طول استخدام 60 ثانية وقت استطالة.
  4. هضم التحوير وناقل للجينات التأسيسي التعبير15 مع تقييد كل منهما نوكليسيس (راجع الخطوة 1، 2) ومخزن في إجمالي حجم 50 ميليلتر في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. هضم بناء مع 5 وحدات باشي و 5 وحدات فسيي على سبيل المثال، إذا كان ذلك مناسباً (راجع الخطوة 1، 2).
  5. هلام تطهير ناقلات هضمها وإدراج استخدام مجموعة أدوات استخراج جل تجاري وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. القيام عملية ربط قياسية 100 نانوغرام ناقلات والحرس الوطني 100 – 1,000 لإدراج استخدام 400 T4 يو إلغاء تنشيط ليجاسى في 14 درجة مئوية حاء 16 الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. تحويل البكتيريا المختصة استخدام الحرارة-الصدمة-بروتوكول قياسي16.
  7. لوحة على أجار لوحات تحتوي على 100 الأمبيسلّين ميكروغرام/مل. احتضان عند 30 درجة مئوية ح 24.
  8. اختيار واحدة من المستعمرات، وتنقية بلازميد الحمض النووي باستخدام مجموعة مينيبريب تجارية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة والتحقق من التسلسل سانغر التسلسل17 (التمهيدي التسلسل: تجكتجاجتكتكجكك 3 '5').
  9. استخدام إيجابي المستعمرات ماكسي مقياس تضخيم بلازميد الحمض النووي وتنقية باستخدام مجموعة أدوات إعداد بلازميد خالية من الذيفان18 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  10. بناء جاهز للحقن، ثم تابع مع الخطوة 5.

2-استنساخ التحوير للتعبير الجيني إيندوسيبلي

  1. تصميم كبسولة تفجير للتحوير التضخيم13،14.
  2. إضافة مواقع التقييد لمبادرة (جاجكتك)، سبيي (أكتاجت)، أو كبني (جتاكك) إلى 5 ' نهاية التمهيدي إلى الأمام. إضافة مواقع التقييد نوتي (جكجككجك) أو إكسهوي (كتكجاج) إلى نهاية 5 ' عكس التمهيدي.
  3. تضخيم التحوير ببكر استخدام الظروف الأمثل ل التحوير المرغوب فيه14. تنقية باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي تجاري.
  4. هضم التحوير المنقي وميكروغرام 4 ناقل الإدخال (pEN_TTmcs-ناقل، انظر الجدول للمواد)19 بشكل منفصل مع nucleases القيد المناسب (راجع الخطوة 2، 2) ومخزن في إجمالي حجم 50 ميليلتر في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. هلام تطهير ناقلات هضمها وإدراج استخدام مجموعة أدوات استخراج جل تجاري وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إجراء عملية ربط القياسية مع 100 نانوغرام ناقلات والحرس الوطني 100 – 1,000 لإدراج استخدام 400 T4 يو إلغاء تنشيط ليجاسى في 14 درجة مئوية حاء 16 الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. تحويل البكتيريا المختصة استخدام الحرارة-الصدمة-بروتوكول قياسي16.
  7. لوحة على أجار لوحات تحتوي على 15 ميكروغرام/مل الجنتاميسين. احتضان في 37 درجة مئوية ح 16.
  8. اختيار واحدة من المستعمرات وتنقية بلازميد الحمض النووي، والتحقق من إدراج تسلسل17 استخدام التمهيدي إلى الأمام بسب: أجاجكتكجتتاجتجاككج 3 '5'.
    ملاحظة: يمكن إجراء PCR في المستعمرات واحدة دون تنقية مسبقة مع كبسولة تفجير بسب إلى الأمام وعكس بسب (أغا AAG CTG الكبد كبار المستشارين التقنيين جات المنسوجات والملابس TCG 3 '5'). ويمكن هذه الخطوة مفيدة لاختيار مسبق للمستعمرات الإيجابية.
  9. انتقل إلى الخطوة 4.

3-الاستنساخ من مير شرنا للجينات تدق إيندوسيبلي إلى أسفل

  1. تصميم النوكليوتيد شرنا مير وفقا بسليك الاستنساخ لأغراض البروتوكول19. يصلب وتنقية النوكليوتيد وتمييع 01:20 في ddH2o.
  2. ثم تعطيل ميكروغرام 3 ملخص لناقل الإدخال مع بفواي يو 5 عند 50 درجة مئوية ح 3، رد فعل على 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: إذا كان المطلوب هو التعبير المشارك من البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، استخدم pEN_TTGmiRc19 متجه دخول، خلاف ذلك استخدام pEN_TTmiRc219.
  3. هلام تطهير ناقلات هضمها كما في الخطوة 2، 5. إجراء عملية ربط القياسية من 100 نانوغرام ناقلات 1 ميليلتر لتنقية وتضعف النوكليوتيد شرنا (الخطوة 3.1) استخدام 400 ش T4 إلغاء تنشيط ليجاسى في درجة حرارة الغرفة حاء 1 الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. تحويل البكتيريا المختصة استخدام الحرارة-الصدمة-بروتوكول قياسي16.
  5. لوحة على أجار لوحات تحتوي على 15 ميكروغرام/مل الجنتاميسين. احتضان في 37 درجة مئوية ح 16.
  6. اختيار واحدة من المستعمرات وتنقية بلازميد الحمض النووي، والتحقق من إدراج سانغر التسلسل17 (التمهيدي التسلسل: تاجتكجاكتاججاتاكاج 3 '5').
  7. انتقل إلى الخطوة 4.

4-ريكومبيناشونال الاستنساخ لتوليد جاهزة لحقن الحيوانات المستنسخة

  1. ميكس 150 نانوغرام من ناقلات الإدخال (من الخطوة 2 أو الخطوة 3) و 150 نانوغرام من المؤسسة العامة للاتصالات تيت-ناقلات20.
  2. إضافة المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات إلى إجمالي حجم ميليلتر 8 (pH = 8).
  3. تحويل المزيج الإنزيم كلوناسي LR الثاني (انظر الجدول للمواد) الجليد، احتضانها للحد الأدنى 2 دوامة مرتين.
  4. إضافة 2 ميليلتر من كلوناسي LR إنزيم ميكس الثاني إلى رد الفعل واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 1.
  5. وقف رد الفعل بإضافة 1 ميليلتر من البروتيناز كالحل. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. تحويل Stbl3 استخدام الحرارة-الصدمة-بروتوكول قياسي16مزيج البكتيريا المختصة مع 2 ميليلتر من استنساخ ريكومبيناشونال.
  7. لوحة على أجار لوحات تحتوي على 100 الأمبيسلّين ميكروغرام/مل. احتضان عند 30 درجة مئوية ح 24.
  8. اختيار واحدة من المستعمرات وتنقية بلازميد الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات إعداد بلازميد خالية من الذيفان18 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، وتأكيد سلامة ناقلات سانغر التسلسل17 (تسلسل التمهيدي 5 ' أججاكاجكاجاجاتككاجتتج 3 ').
  9. بناء جاهز للحقن، تابع مع الخطوة 5.

5-إعداد حل لحقن الوريد هيدرودينامية الذيل

ملاحظة: إعداد بنيات للتعبير الجيني التأسيسي وإيندوسيبلي موصوفة في الخطوة 1، 2، 3 و 4.

  1. تعد عقيمة المالحة 0.9% للحقن (هل عدم استخدام برنامج تلفزيوني). استخدام حجم المقابلة لحوالي 10% وزن الجسم الماوس. على سبيل المثال: لماوس وزنها 20 غراما، وإعداد 2 مل من محلول.
  2. إعداد ناقلات الحقن التي تم تنقيتها باستخدام أدوات تنقية بلازميد خالية من الذيفان18 (راجع الخطوة 1.8 أو 4.8، على التوالي).
  3. إضافة ميكروغرام 10 أو 15 ميكروغرام لبناء ناقلات خالية من الذيفان النوم الجمال (من الخطوة 1 استخدام 10 ميكروغرام، من الخطوة 4 استخدام 15 ميكروغرام، على التوالي) و 1 ميكروغرام خالية من الذيفان pc-HSB521 الواحد مل من المحلول الملحي المعقم.
  4. تخزين حل لما يصل إلى 4 س في 4 درجات مئوية. لا تجمده.

6-القيام بحقن الوريد هيدرودينامية الذيل

  1. استخدام ريستراينير لحقن الوريد الذيل (تجارية أو المعدة من أنبوب مخروطي 50 مل مع ثقوب للتنفس والذيل). ملء أسفل الأنبوبة مع المناديل الورقية.
  2. للحقن، استخدام الفئران لحوالي 8 – 10 أسابيع من العمر مع الأوزان 20-25 جرام.
  3. وزن الفئران قبل الحقن وإعداد حجم الحقن وفقا لوزن الجسم (المقابل لنسبة 10% وزن الجسم، راجع الخطوة 5، 1). إعداد عقيمة 3 مل-حقنه بإبرة ز 27 للحقن والتعبئة مع الحجم المطلوب.
  4. ضع الماوس في ريسترينير. ضبط الكمية من المناديل الورقية (راجع الخطوة رقم 6، 1) ترك الحد الأدنى فقط من الفضاء للحركة لكن مساحة كافية للتنفس.
  5. تأكد من أن الماوس هو التنفس بانتظام.
  6. الحارة الذيل استخدام مصباح الأشعة تحت حمراء ل 30-60 س. بعناية لمشاهدة علامات الانهاك.
  7. تنظيف الذيل مع مسحه الكحول.
  8. أدخل الإبرة تقريبا أفقياً في أحد شرايين الذيل الأفقي هما قريبة من قاعدة الذيل.
    ملاحظة: إذا وضع بنجاح، قد تدفق كمية صغيرة من الدم مرة أخرى في المخروط الإبرة. لا ينصح نضح بنشاط كما يمكن أن يؤدي أي حركة إضافية من الإبرة في التشرد و/أو إصابة الوريد.
  9. حقن الحجم الإجمالي في هذا السياق ذيل داخل s 8-10.
  10. من ريسترينير على الفور إزالة الماوس. ضغط حقن الجرح لمالا يقل عن 30 ثانية أو حتى أي نزيف ينحسر.
  11. ضع الماوس في قفص منفصل. وبمجرد الماوس تعافي من الإجراء (حوالي 30-60 دقيقة)، نقل الماوس مرة أخرى إلى قفصة الأصلي. تحقق من على الماوس بشكل منتظم ل 24 ساعة القادمة.
    ملاحظة: الملاحظ تخدير خفيف للماوس بشكل روتيني ليصل إلى 2 حاء بعد الحقن.
  12. قبل الشروع في مزيد من التجارب (أي، الخطوة 7)، انتظر 10 – 15 يوما لإزالة الألغام ناقلات غير متكامل.

7-تنظيم دورات تعريفية كرير Transfected مع تاموكسيفين

تنبيه: تاموكسيفين الضارة، قد تكون سرطانية أو الأضرار الخصوبة. يرجى الرجوع إلى صحيفة بيانات السلامة.

  1. خطة الحقن داخل تاموكسيفين على ثلاثة أيام متتالية.
  2. في اليوم الأول، حل 10 ملغ تاموكسيفين في 40 ميكروليتر الإيثانول. احتضان في 55 درجة مئوية للحد الأدنى 10 دوامة عدة مرات حتى التاموكسيفين قد حلت.
  3. إضافة 960 زيت الذرة ميليلتر. احتضان لمدة 5 دقائق في 55 درجة مئوية. دوامة عدة مرات للحصول على حل واضح.
  4. يعد الحل في حقنه الأنسولين 1 مل بإبرة ز 27.
  5. القفا الماوس بالاستيلاء على رقبة الماوس بعناية مع الإبهام والإصبع الثاني، تحديد الذيل بين قاعدة اليد والإصبع الرابع والخامس.
  6. حقن 0.1 مل (= 1 ملغ تاموكسيفين) الحل إينترابيريتونيلي في الربع السفلي الأيمن من البطن.
  7. تكرار الحقن في اليومين الثاني والثالث.

8-تنظيم دورات تعريفية للجينات تعتمد على التتراسكلين أو شرنا التعبير

تنبيه: قد تكون الدوكسي الضارة. يرجى الرجوع إلى صحيفة بيانات السلامة.

ملاحظة: اعتماداً على نوع ومدة التجربة، الدوكسيسيكلين يمكن توفيره في مياه الشرب (الخطوة 8، 1) أو تشاو (الخطوة 8.2)

  1. لإجراء التجارب على المدى القصير (< 10 أيام) إدارة الدوكسي عبر مياه الشرب باستخدام البروتوكول التالية.
    1. حل السكروز 5 غ في 100 مل ماء الصنبور. اﻷوتوكﻻف.
    2. حل 100 مغ من الدوكسيسيكلين-هيكلاتي في 5 مل محلول السكروز (الخطوة 8.1.1) في أنبوب مخروطي 15 مل.
    3. استخدام حقنه 10 مل، تصفية العقيمة الحل عن طريق فلتر 0.2 ميكرون. إضافة إلى محلول السكروز إعدادها في الخطوة 8.1.1.
    4. إمداد محلول السكروز الدوكسي كمياه الشرب للماوس. تحقق يوميا واستبدال عندما يصبح الحل غائم تشير إلى فرط البكتيرية (استبدال الحل واضح بعد ثلاثة أيام على أقصى تقدير).
  2. لإجراء التجارب على المدى الطويل (> 10 أيام) أو تجارب الحساسية للتغيرات الاستقلابية، استخدم الدوكسي التجارية-تشو (مثلاً، الدوكسيسيكلين هيكلاتي تشو 0.625 غ/كغ) لتجنب الجفاف و/أو التغيرات التي يسببها السكروز في كبد الحيوانات المعالجة.

9-إعداد الماوس الكبد للتحليل حسب إيمونوستينينج

تنبيه: بارافورمالدهيد قد تكون ضارة. يرجى الرجوع إلى صحيفة بيانات السلامة.

ملاحظة: تيميبوينت عند الفئران وسيتم تحليل يعتمد على التجربة. من المستحسن لتحليل أنسجة الكبد بعد لا يقل عن ثلاثة أيام معاملة الدوكسي ضمان تعريفية كافية للتعبير التحوير أو شرنا.

  1. إعداد 1 مل حقنه بإبرة ز 27 مع 1 مل محلول بارافورمالدهيد 4% (منهاج عمل بيجين).
  2. Euthanize الماوس بطريقة مناسبة وفقا لوضع بروتوكول حيوانية معتمدة.
    ملاحظة: قد تختلف عن المبادئ التوجيهية للأساليب المناسبة للقتل الرحيم المؤسسة.
  3. باستخدام مقص تشريح والملقط التشريحية، بعناية فتح تجويف البطن فتح البطن وسيط لفضح الكبد. تحريك الأمعاء بالحق في فضح الوريد البابي والاجوف فينا أدنى (IVC).
  4. أدخل إبرة المحاقن استعداد (راجع الخطوة 9، 1) في IVC وقطع الوريد البابي. حقن 1 مل من منهاج عمل بيجين ببطء في IVC نتخلل نسيج الكبد وإزالة خلايا الدم الحمراء الفلورسنت السيارات (مرغوب فيه إذا كان سيتم إجراء تلطيخ إيممونوفلوريسسينت).
  5. إزالة الكبد. شطف في الماء ونقل إلى 5 – 10 مل محلول منهاج العمل 4%.
  6. لمقاطع البارافين، إصلاح الأنسجة ل h. 36 – 48 الأنسجة جاهزة للجفاف وتضمينها البارافين.
  7. للمقاطع المجمدة، إصلاح الأنسجة في 4% منهاج عمل بيجين ح 1.
    1. كريوبروتيكشن، نقل إلى محلول السكروز 10%. احتضان 60 دقيقة.
    2. نقل إلى محلول السكروز 20%. احتضان 60 دقيقة.
    3. نقل إلى محلول السكروز 30%. احتضان 12 – 16 حاء Embed في تضمين مجمع للأجزاء المجمدة، وتجميد في-20 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فعالية تعداء بحقن الوريد هيدرودينامية الذيل: النسبة المئوية لخلايا الكبد مورين التي هي ترانسفيكتيد هيدروديناميكالي بحقنه واحدة هو متغير ويعتمد على معلمات متعددة مثل حجم الحقن، حقن الوقت، كمية من حقن الحمض النووي، وحجم بناء حقن6، ،من 2223. بالإضافة إلى ذلك، كفاءة تعداء أقل بصفة عامة في الحيوانات الكبيرة، حيث أكبر قطر الأوعية الدموية، فضلا عن منطقة جيبية أكبر يؤدي إلى انخفاض في الضغط العام. بتصور الكفاءة تعداء، أنجز هتفي بنية ينقول كرير في الفئران إيواء جين مراسل Rosa26متمج يليه تفعيل تاموكسيفين بوساطة بناء كرير. حجم الحقن منخفضة أو وقت حقن طويلة لأسباب فنية من نتائج في تعداء انخفاض الكفاءة مع فقط بضعة transfected خلايا الكبد يمكن اكتشافها في الكبد كله، بينما تؤدي ظروف الحقن الأمثل في أعلى تعداء الكفاءة كما هو مبين بمراسل تلطيخ بعد هتفي ينقول كرير (الشكل 1A). لتقييم فعالية تعداء، ينصح بشدة إيمونوستينينج من التحوير transfected-أو كما في حالة كرير-الجينات مراسل مناسبة. بدلاً من ذلك، قد يمكن تقدير كفاءة تعداء من تحليل التعبير مرناً للتحوير transfected.

تعداء من خلايا الكبد بيريسينترال: بعد حقن هيدرودينامية، تدرج ضغط على طول المساحة جيبية-حيث الضغط أعلى قريبة من الوريد المركزي وأقل في بيريبورتال مساحية-قد تؤدي إلى تعداء المفضل في منطقة بيريسينترال. نحن تحليل كبد مع نسبة منخفضة من خلايا الكبد معربا عن التحوير ويقيمها مركزها النسبي في الفصيص الكبد إيمونوستينينج co الجلوتامين سينثاتيز (خ ع)، علامة لخلايا الكبد بيريسينترال. من المثير للاهتمام، أن الغالبية من خلايا الكبد التي أظهرت مراسل التعبير الجيني بعد هتفي بناء كرير تتجمع حول الوريد المركزي ولكن ليس منطقة مدخل (الشكل 1B) تشير إلى مستوى أعلى من الكفاءة تعداء حولها الاتجاه المركزي.

في فيفو التصوير بعد هتفي ينقول لوسيفراس: تقييم ما إذا كان دمج نسخة واحدة لاحظت بعد بنيات هتفي ينقول24 كافية في فيفو التصوير، نحن حقن بناء ينقول إيواء كاسيت تعبير لوسيفراس الخاضعة لسيطرة كبد محددة بناء المروج. تم حقن لوسيفرين الفئران وتصويرها باستخدام في فيفو نظام التصوير أسبوعين بعد هتفي (الشكل 2A). أظهر تصوير الإضاءة الحيوية لوسيفراس قوية ومستقرة في الكبد 15 يوما بعد الحقن، وفي وقت لاحق النقاط الزمنية (الشكل 2B والمعطيات غير معروضة). وتظهر هذه النتائج أن النظام يمكن استخدام بنجاح لتتبع وجود transfected الخلايا في الجسم الحي بتصوير الإضاءة الحيوية.

"كرير جنبا إلى جنب" والتعبير التحوير أو شرنا إيندوسيبلي: نحن سابقا إنشاء بنية ينقول الذي يجمع بين التعبير التأسيسي من ريكومبيناسي إيندوسيبلي لجنة المساواة العرقية (كرير) مع إيندوسيبلي التعبير التحوير أو شرنا لاختيار20 (الشكل 3A). حقن من هذا البناء في Rosa26متمج-مراسل الفئران وتفعيل كرير تاموكسيفين أظهر تعبير قوي عن الجينات مراسل مماثلة للنتائج التي تحققت مع بنية ينقول للتحوير واحدة التعبير ( الشكل 3B). بعد العلاج الدوكسي، يمكن تصور التحوير إيندوسيبلي التعبير بأجسام مضادة مناسبة في transfected خلايا الكبد (الشكل 3). للتعبير شرنا إيندوسيبلي، وهو يوصي باستخدام بنية التجارة والنقل-شرنا كما يمكن استخدام تعبير بروتينات فلورية خضراء هيولى الكشف عنها بواسطة immunostaining كعلامة بديلة للتعبير شرنا (الشكل 3D). من المذكرة، التعبير التحوير أو شرنا، على التوالي، فقط يمكن اكتشافها في مجموعة فرعية من خلايا الكبد، الذي قد يكون بسبب الارتفاع النسبي لمستوى التعبير البروتين اللازمة للكشف عن إيمونوستاينينج20.

Figure 1
رقم 1: تعداء لخلايا الكبد هتفي. (أ) كفاءة تعداء متغير بعد هتفي كرير-ينقول في الفئران إيواء Rosa26متمج/+ مراسل ومتبوعاً بالعلاج بعقار تاموكسيفين. Transfected خلايا الكبد إيجابية لربط غشاء بروتين الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء، خضراء). (ب) شارك تلطيخ كرير تنشيط خلايا الكبد (الأخضر) في الفئران إيواء مراسل Rosa26متمج سينثاتيز الجلوتامين ماركر الوريد المركزي (فئة الخدمات العامة، أحمر). هنا PV: الوريد البابي، السيرة الذاتية: الوريد المركزي. تمثل أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: في فيفو تصوير من لوسيفراس. (أ) ينقول بناء يحتوي على كاسيت تعبير لوسيفراس (عدم الانتباه إلى الجدول). نظام الحقن والعلاج للتصور التعبير لوسيفراس كبدي. س: النوم الجمال الاعتراف بالمواقع، هتفي: حقن الوريد هيدرودينامية الذيل. (ب) صورة تمثيلية لوسيفراس كبدي الإضاءة الحيوية 15 يوما بعد هتفي بناء ينقول لوسيفراس جنبا إلى جنب مع pHSB5 باستخدام في فيفو نظام التصوير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الجمع بين كرير والتعبير الجيني إيندوسيبلي/شرنا. (أ) بنية ينقول للتعبير عن إيندوسيبلي ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية إلى جانب التعبير التحوير التتراسيكلين إيندوسيبلي أو شرنا (المؤسسة العامة للاتصالات تيت)، وعدم الانتباه إلى مقياس. يلطخ الغشاء الخضراء (ب) يشير إلى transfected خلايا الكبد بعد الحقن بالمؤسسة العامة للاتصالات بناء تيت في Rosa26متمج/+ مراسل الفئران وتفعيل كرير مع تاموكسيفين. مقياس بار يمثل 100 ميكرومتر. 5 أيام بعد يمكن تصور الدوكسي المعاملة التي إيمونوستينينج للتحوير (ياب، الأحمر) في خلايا الكبد ترانسفيكتيد التعبير الجيني إيندوسيبلي ((ج)) . (د) التعبير شرنا مير إيندوسيبلي 5 أيام بعد العلاج الدوكسي المؤشرة تلطيخ هيولى البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) بناء بروتينات فلورية خضراء-شرنا. ويرد transfected خلايا الكبد بربط غشاء بروتينات فلورية خضراء. تغيير حجم أشرطة في C) ود) تمثل 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعداء لخلايا الكبد مع حقن الوريد ذيل هيدرودينامية أصبح أسلوب المنشأة منذ إطلاقها منذ أكثر من 15 عاماً6. حجم حقن يتجاوز الناتج القلب ويتدفق من الأجوف فينا أقل شأنا في الجيوب من الكبد7، مما يؤدي إلى تعداء حوالي 10-20%، وفي بعض الحالات تصل إلى 40 في المائة من خلايا الكبد،من2526. تنبئ تعداء الناجحة هي حجم حقن كل الوقت حقن22،23. ومن ثم، كفاءة تعداء منخفضة (الشكل 1A، اللوحة اليمنى) يحدث عادة بسبب الفشل في الحفاظ على سرعة الحقن أثناء الإجراء7. بيد حتى مع أسلوب أمثل، ستظل كفاءة تعداء الذي يمكن أن تحققه هتفي دون المعدل الذي حصل بالعدوى الفيروسية مع غدية أو الفيروسات المرتبطة بالغدة يمكن أن تصل إلى قرابة 100%5،27 . ولتحقيق حقن الوريد ذيل ناجحة، من أهمية حاسمة لضمان وضع مستقر من الإبرة في الأوعية الدموية. ويتحقق هذا بسهولة في الأوردة مع قطرها أكبر أقرب إلى قاعدة الذيل. بالإضافة إلى ذلك، ينصح بشدة تمدد الوريد بالاحماء الذيل. هي تحقيق أفضل النتائج باستخدام مصباح الأشعة تحت حمراء، ولكن يمكن أيضا استخدام أي مصباح الحرارة غير الأشعة تحت الحمراء أو الغمر الذيل في المياه الدافئة. وفي بعض الحالات، المكمل ميليلتر يصل إلى 200 من المحلول الملحي بالحقن داخل حوالي 30 دقيقة قبل هتفي سيحسن حالة ترطيب الحيوانات أدى إلى تمدد الأوعية الدموية. للمحافظة على سرعة حقن مستمر، ينبغي تقييد ذيل الماوس تماما لتجنب أي حركة الذيل، الذي يمكن أن يسفر عن تشريد الإبرة. لأغراض التحقق من الصحة، فإننا نقترح استخدام بنية يمكن الكشف عنها بواسطة إيمونوستينينج. وبدلاً من ذلك، يمكن تقدير فعالية تعداء بتحليل التعبير مرناً أو متكاملة تسلسل الحمض النووي28.

البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن التكامل ينقول يفضل أن يلاحظ في مجال بيريسينترال الفصيص الكبد. من المرجح تعداء الغالبة لخلايا الكبد حولها الاتجاه المركزي سبب الهليوكبتر فريدة من هتفي كما لوحظ أيضا في غير ينقول تعداء استناداً إلى29. قد يكون هذا الاستنتاج أهمية بالنسبة لبعض التطبيقات، مثل تنظيم دورات تعريفية لتلف الكبد الحاد بشركة CCl4، التي تؤثر أساسا على خلايا الكبد بيريسينترال. في سياق تعداء منخفضة الكفاءة، ولذلك يمكن أن يؤدي العلاج4 CCl إلى تخفيض كبير في عدد خلايا الكبد ترانسفيكتيد. بالإضافة إلى ذلك، هتفي من الاستخدام المحدود للخلايا بيريبورتال الهدف بما في ذلك الخلايا الصفراوية15.

بالإضافة إلى النظم التي تستخدم هتفي من بنيات ينقول لتحقيق التعبير مستقرة للتحوير مفردة، قدمنا مؤخرا نظام يتيح التعبير المشترك عن كرير والتعبير إيندوسيبلي من جينات أو مير شرنا من ناقل واحد11 . هذا النظام مفيد بشكل خاص استجواب جينات محددة في سلالات الماوس Cre/لوكسب-تعتمد. كما يتم إدخال ثوابت المتسلسلات أو شرنا بإجراء استنساخ ريكومبيناشونال سريعة وموثوق بها، يمكن بسهولة تكييف لفحص نهج النظام. ناقل النظام يتوسط التعبير إيندوسيبلي موثوقة في فيفو التي تعتمد كلياً على إيصال الدوكسي11،30. هذا الدليل العملي القائم على الفيديو يوفر إرشادات خطوة بخطوة من استنساخ متجهات مناسبة عبر تنظيم دورات تعريفية للتعبير الجيني لتحليل أنسجة الكبد.

ومع ذلك، لضمان كفاءة النظام، عدة جوانب ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار: للحفاظ على المدى الطويل التعبير، التكامل الجينوم هو توسط في تا-مواقع الجمال النائم ترانسبوساسي8،11. نظراً لكفاءة التكامل اعتماداً على حجم ينقول، من المهم الاحتفاظ بحجم بنية التحوير في الاعتبار عند تصميم ناقل31. وعلاوة على ذلك، التعبير كفاءة المنتج الجين إيندوسيبلي في الكبد تعتمد على مروج rtTA311. لنتائج التعبير الأمثل، واستخدام لبناء ناقلات مع كبد مروج ApoE.HCR.hAAT محددة ينصح (85578 # أدجيني)، كما أنه يظهر كفاءة أعلى في المقارنة بين ثلاثة بروموتورس11. مع بناء مروج أمثل، يمكن الكشف عن التعبير التحوير/شرنا إيندوسيبلي التي إيمونوستاينينج في تصل إلى 30 في المائة من خلايا transfected20. في حالة وجود مستويات البروتين إيندوسيبلي أدنى من عتبة معينة مطلوب للكشف عن طريق إيمونوستينينج، هذا يحتاج إلى تحديد. الأهم من ذلك، يمكن اكتشاف أي تعبير التحوير/شرنا إيمونوستينينج في الفئران التي لا يعاملون مع الدوكسيسيكلين. أخيرا، التعبير عن الجينات تحت عنصر تحكم لعنصر الاستجابة التتراسيكلين (TRE) تعتمد على الجرعة من الدوكسي32،33. لإجراء التجارب على المدى القصير، هو الإدارة الدوكسي عبر مياه الشرب راسخة34،35. عادة ما يتم إضافة السكروز تعطي مذاقا أفضل. ومع ذلك، قد يؤدي هذا إلى عطاش والجفاف، واستخدام تشاو الدوكسي ينصح بشدة للتجارب الطويلة الأجل36،37.

وخلاصة القول، حقن الوريد ذيل هيدرودينامية أسلوب المنشأة على نطاق واسع في بحوث الكبد. نماذج في التطبيق تتراوح بين الدراسات من التهاب الكبد باء لسرطان الكبد في التليف أو سرطانه الخلية38،39،،من4041. النظام المذكور في هذه المخطوطة مفيدة بشكل خاص في استجواب الجينات المستهدفة المحددة في لجنة المساواة العرقية/لوكسب-تعتمد نماذج من أمراض الكبد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا لبحوث الأمراض الدموية42،43 ، أو لمعالجة المسائل المناعية44،45أوفيريكسبريشن في الكبد. بعد تحليل جينات محددة من الفائدة، قدم النظام يمكن أيضا بسهولة تكييفها للفحص أو الإرسال المتعدد النهج. ولذلك سيكون من المفيد لمجتمع كبير من الباحثين هذا الدليل القائم على الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

وأيد هذا العمل Deutsche كريبشيلفي، ألمانيا (رقم المنحة 111289 لرق)، ولوسيل باكارد لصحة الأطفال (إرنست واميليا جالو وهبت ما بعد الدكتوراه زمالة-كتسا المنحة رقم UL1 RR025744 لرق). ونشكر الدكتور مارك أ كاي لناقلات الأمراض بنيات ودعم المشورة التجريبية والدكتور جوليان حكيم للفئران والتجريبية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher #SM1331 DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583 embedding of cryo-sections
Biozym LE Agarose Biozym 840004
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
D(+)-Saccharose Carl Roth 4621.1 For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium Salt AppliChem A0839,0010 For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller) Carl Roth X969.1
LB Broth (Luria/Miller) Carl Roth X968.1
S.O.C. Medium Thermo Fischer 15544034
Gentamicin sulfate AppliChem A1492,0001 For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 % Fa. Roth P087.6 para-formaldehyde solution
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix invitrogen/ThermoFisher 11791-020 contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent Cells Thermo Fisher 11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher C737303
Name Company Catalog Number Comments
Restriction Enzymes
PacI New England BioLabs R0547S
AscI New England BioLabs R0558S
FseI New England BioLabs R0588S
SacI New England BioLabs R0156S
SpeI New England BioLabs R0133S
KpnI New England BioLabs R0142S
NotI New England BioLabs R0189S
XhoI New England BioLabs R0146S
BfuAI New England BioLabs R0701S
Name Company Catalog Number Comments
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up Macherey & Nagel 740609.10
NucleoBond PC20 Macherey & Nagel 740571 Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500 Macherey & Nagel 740574 Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F530S
Name Company Catalog Number Comments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 ml Braun 9166017V For intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 ml Braun 4616025V For intravenous injection
Sterican Cannula 24G Braun 4657675
Sterican Cannula 27G Braun 4657705
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G For CreER activation
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML Carrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclate AppliChem A2951,0025 Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml Syringe Braun 4606108V
Filtropur S 0.2 Sarstedt 831,826,001 For filtration of doxycycline
NaCl 0,9% Braun 3200905 Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50ml Corning Life Science 352095
Infrared Lamp N/A N/A For warming of mouse tail
IVIS Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTC n/a Vector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcs Addgene #25755 Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753 Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2 Addgene #25752 Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-Tet Addgene #85578 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-Tet Addgene #85577 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

Tags

علم الوراثة، 132 قضية، والكبد، ونظم ينقول، النائمة، ذيل على تيت هيدرودينامية حقن الوريد، في فيفو تعداء، ودليل الفيديو.
نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي <em>في فيفو </em>من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hubner, E. K., Lechler, C.,… More

Hubner, E. K., Lechler, C., Rösner, T. N., Kohnke-Ertel, B., Schmid, R. M., Ehmer, U. Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection. J. Vis. Exp. (132), e56613, doi:10.3791/56613 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter