Hydrodynamisk hale vene injektion af transposon-baseret integration vektorer giver stabil Transfektion af murine hepatocytter in vivo. Vi præsenterer her, en praktisk protokol til Transfektion systemer, der giver mulighed for den langsigtede konstitutiv udtryk for en enkelt transgen eller kombinerede konstitutiv og doxycyclin-inducerbar udtryk for en transgen eller miR-shRNA i leveren.
I forskning modeller af leverkræft, regenerering, inflammation og fibrose er fleksible systemer for i vivo genekspression og silencing meget nyttig. Hydrodynamisk hale vene injektion af transposon-baserede konstruktioner er en effektiv metode til genetisk manipulation af hepatocytter i voksen mus. Ud over konstitutiv transgen udtryk, kan dette system bruges til mere avancerede applikationer, såsom shRNA-medieret gen knock-down, konsekvenser af CRISPR/Cas9-systemet til at fremkalde genmutationer eller inducerbar systemer. Her, er kombinationen af konstituerende CreER udtryk sammen med inducerbar udtryk for en transgen eller miR-shRNA valg præsenteret som et eksempel på denne teknik. Vi dækker Multi-trins procedure fra udarbejdelsen af Tornerose-transposon konstruktioner, injektion eller behandling af mus, og forberedelse af levervævet til analyse af immunfarvning. Systemet præsenteret er en pålidelig og effektiv tilgang til at opnå komplekse genetiske manipulationer i hepatocytter. Det er specielt nyttig i kombination med Cre/loxP-baserede mus stammer og kan anvendes til en bred vifte af modeller i forskning af leversygdom.
Kronisk leversygdom præsenterer en større sundhed byrde på verdensplan1. Dyreforskning modeller er uundværlige redskaber i studiet af leversygdom og har hjulpet med at besvare komplekse spørgsmål i leveren regenerering, hepatisk betændelse, og steatose samt leverkræft2. Et betydeligt antal af disse dyremodeller er afhængige af den genetiske modifikation af leverceller. Derfor, effektive værktøjer til at manipulere genekspression i hepatocytter er nyttigt3. Etablerede metoder såsom opdræt af gensplejsede mus stammer eller generation af virale vektorer for hepatocyt infektion er enten tidskrævende, harbor sikkerhedsproblemer, eller give fattige transgen udtryk i hepatocytter i vivo 4 , 5. hydrodynamiske hale vene injektion (HTVI) er en alternativ metode til i vivo Transfektion af hepatocytter giver mulighed for nem, hurtig og omkostningseffektiv forhør af genet fungerer i leveren. For HTVI opløses en vektor, bærer det ønskede DNA-sekvens i en mængde af saltvand svarende til 10% af kropsvægten af det injicerede dyr. Løsningen er derefter sprøjtet ind i halen vene inden for 5-10 s6. Overstiger minutvolumen, løber saltvand fra den ringere vena cava i leveren venerne, fører til udvidelse af leveren og Hydrodynamisk Transfektion af hepatocytter7. For at opnå stabil genomisk integration, har metoden været kombineret med transposon-baserede vektorer, som den sovende skønhed –transposon system. Denne systemer medierer rekombination af target vektorer med genomisk rekombination websteder katalyseret af en sovende skønhed –transposase8,9. Modeller af leverfibrose eller carcinogenese er det ofte ønskeligt at overexpress eller stilhed gener på visse tidspunkter af sygdom model. Til dette formål, værktøjer til inducerbar genekspression som Cre/LoxP-system eller tetracyklin-inducerbar gen expression system (Tet-On) kan være brugt10.
Her, beskriver vi en protokol for i vivo Transfektion af murine hepatocytter ved hjælp af HTVI af en sovende skønhed transposon-baseret system. Ud over en protokol for stabil, konstituerende udtryk for en transgen under kontrol af en lever-specifikke promotor, vi beskriver en mere avanceret vektorsystem, der kombinerer konstitutiv tamoxifen-afhængige Cre recombinase (CreER) udtryk med den inducerbar udtryk for en transgen eller mikroRNA-tilpasset shRNA (miR-shRNA), kaldet pTC TET-systemet11. I denne vektorsystem er inducerbar transgener eller miR-shRNAs for tetracyclin-afhængige udtryk klonet i rygraden vektor med en recombinational kloning ordning, tillade den hurtige og nem generation af nye vektorer12. Denne video-baserede vejledning omfatter udarbejdelsen af passende vektorer, injektion og behandling af musene at opnå inducerbar transgen/miR-shRNA udtryk, og endelig forberedelse af levervævet til analyse. De i denne protokol beskrevne metode var designet til at aktiverer kombinationen af enhver Cre/loxP medieret mus system med udtrykket eller knock-down af enhver gene af valg, hvilket gør det til et almindeligt gældende system i forskning af leversygdom.
Transfektion af hepatocytter med Hydrodynamisk hale vene injektion er blevet en etableret metode siden introduktionen mere end 15 år siden6. Den injicerede volumen overstiger minutvolumen og løber fra den ringere vena cava i sinusoids af leveren7, fører til Transfektion af ca 10-20%, i nogle tilfælde op til 40% af hepatocytter25,26. Prædiktorer for en vellykket Transfektion er den injicerede volumen pr. injicer…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Krebshilfe, Tyskland (tilskud antal 111289 til UE), Lucile Packard Foundation for børns sundhed (Ernest og Amelia Gallo begavet postdoc stipendium – CTSA tilskud antal UL1 RR025744 til UE). Vi takker Dr. Mark A. Kay for vektor konstruktioner og eksperimenterende rådgivning og Dr Julien Sage til mus og eksperimentel støtte.
General Material | |||
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Restriction Enzymes | |||
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
AscI | New England BioLabs | R0558S | |
FseI | New England BioLabs | R0588S | |
SacI | New England BioLabs | R0156S | |
SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits | |||
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials for Mouse Experiments | |||
Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |