Summary
Hydrodynamiska svans ven injektion av transposon-baserad integration vektorer möjliggör stabil transfection av murina hepatocyter invivo. Här presenterar vi ett praktiskt protokoll för transfection system som möjliggör långsiktiga konstitutiva uttryck för en enda transgenens eller kombinerade konstituerande och doxycyklin-inducerbara uttryck för en transgen eller miR-shRNA i levern.
Abstract
I forskningsmodeller av levercancer, förnyelse, inflammation och fibros är flexibla system för in-vivo genuttryck och ljuddämpning mycket användbar. Hydrodynamiska svans ven injektion av transposon-baserade konstruktioner är en effektiv metod för genmanipulation av hepatocyter som vuxna möss. Utöver konstituerande transgenens uttryck, kan detta system användas för mer avancerade applikationer, såsom shRNA-medierad gen knock-down, implikationen av CRISPR/Cas9 systemet inducerar genmutationer eller inducerbara system. Kombinationen av konstituerande CreER uttryck tillsammans med inducerbara uttryck av en transgen eller miR-shRNA val presenteras här, som ett exempel på denna teknik. Vi täcker det multi-steg förfarande start från beredning av Törnrosa-transposon konstruerar, till injektion och behandling av möss, och utarbetandet av levervävnad för analys av immunfärgning. Systemet presenteras är en tillförlitlig och effektiv metod att uppnå komplexa genetiska manipulationer i hepatocyter. Det är särskilt användbart i kombination med Cre/loxP-baserade mus stammar och kan tillämpas på en mängd olika modeller i forskningen av leversjukdom.
Introduction
Kronisk leversjukdom presenterar en större hälsa bördan i världen1. Forskning på djur modeller är viktiga verktyg i studiet av leversjukdom och har bidragit till att besvara komplexa frågor i levern regenerering, nedsatt inflammation, samt steatos och levercancer2. Ett betydande antal av dessa djurmodeller är beroende av den genetiska modifieringen av leverceller. Därför är effektiva verktyg för att manipulera genuttryck i hepatocyter bra3. Etablerade metoder såsom uppfödning av genmanipulerade mus stammar eller generationen av virala vektorer för hepatocyte infektion är antingen tidskrävande, harbor säkerhetsfrågor eller ge dålig transgenens uttryck i hepatocyter i vivo 4 , 5. hydrodynamiska svans ven injektion (HTVI) är en alternativ metod för in-vivo transfection av hepatocyter vilket möjliggör enkel, snabb och kostnadseffektiv förhör av geners funktion i levern. För HTVI löses en vektor som transporterar önskat DNA-sekvensen i en volym av saltlösning som motsvarar 10% av kroppsvikt injiceras djuret. Lösningen injiceras sedan i svansen ven inom 5-10 s6. Överstigande hjärtminutvolym, rinner saltlösning från den sämre vena cava lever venerna, vilket leder till expansion av levern och hydrodynamiska transfection av hepatocyter7. För att uppnå stabil genomisk integration, har metoden kombinerats med transposon-baserade vektorer, såsom det sovande skönhet -transposon-systemet. Detta system förmedlar rekombination av målet vektorer med genomiska rekombination platser katalyseras av en sovande skönhet -transposase8,9. För modeller av leverfibros eller carcinogenes är det ofta önskvärt att overexpress eller tystnad gener vid vissa tidpunkter av sjukdom modell. För detta ändamål, verktyg för inducerbara genuttryck såsom Cre/LoxP-systemet eller tetracyklin-inducerbara gen uttryck systemet (Tet-på) kan vara begagnade10.
Här beskriver vi ett protokoll för i vivo transfection av murina hepatocyter med HTVI av en Törnrosa transposon-baserat system. Förutom ett protokoll för stabil, konstitutiva uttryck av en transgen under kontroll av en lever-specifika promotorn, beskriver vi en mer avancerade vector-systemet som kombinerar konstituerande tamoxifen-beroende Cre recombinase (CreER) uttryck med den inducerbara uttryck av en transgen eller mikroRNA-anpassad shRNA (miR-shRNA), kallas pTC TET-system11. I denna vector systemet klonas inducerbara transgener eller miR-shRNAs för tetracyklin-beroende uttryck i ryggraden vektorn med ett recombinational kloning system, som tillåter snabb och enkel generering av nya vektorer12. Denna video-baserade guide omfattar utarbetandet av lämpliga vektorer, injektion och behandling av möss att uppnå inducerbara transgenens/miR-shRNA uttryck, och slutligen beredning av levervävnad för analys. Den metod som beskrivs i detta protokoll var utformad så att kombinationen av varje Cre/loxP medierad mus system med uttrycket eller knock-down av någon gen av val, vilket gör det till ett allmänt tillämpliga system i forskning av leversjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt riktlinjerna för skötsel och användning av laboratoriedjur och godkändes av ansvariga myndigheter (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland och Stanford institutionsvård djur och använda kommittén, Stanford, CA, USA). En lista över alla plasmider för kloning (steg 1 till 4) föreskrivs i kompletterande tabell S1.
1. kloning av en transgen för konstituerande genuttryck
- Design primers för transgenens förstärkning13,14.
- Lägg till begränsning platser för PacI (TTAATTAA) i 5' slutet av forward primer. Lägga till begränsning platser för AscI (GGCGCGCC) eller FseI (GGCCGGCC) till 5' slutet av reverse primer.
- Förstärka transgenens med PCR använder villkor optimerad för önskad transgenens14. Rena med en kommersiellt tillgänglig DNA rening kit.
Obs: Glödgning tid beror på primers utformad i steg 1.1., töjning tid beror på längden på konstruktionen. Till exempel för en konstruktion av 1000 bp längd Använd 60 s töjning tid. - Smälta transgenens och vektor för konstituerande gen uttryck15 med respektive begränsning nukleaser (se steg 1.2) och buffert i en total volym på 50 µL vid 37 ° C under natten. Till exempel smälta konstruera med 5 enheter PacI och 5 enheter FseI om lämpliga (se steg 1.2).
- Gel rena smält vektor och infoga med hjälp av en kommersiell gel utvinning kit enligt tillverkarens anvisningar. Utföra en standard ligering av 100 ng av vektor och 100 – 1000 ng av infoga med 400 U T4 ligase vid 14 ° C i 16 h. värme inaktivera vid 65 ° C i 10 min.
- Omvandla behöriga bakterier använder en standard värme-chock-protokoll-16.
- Plattan på agar plattor innehållande 100 µg/mL ampicillin. Inkubera vid 30 ° C under 24 h.
- Plocka enstaka kolonier, rena plasmid DNA med en kommersiell miniprep enligt tillverkarens anvisningar och kontrollera sekvensen av Sanger sekvensering17 (sekvensering primer: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
- Använd positiva kolonier för maxi skala amplifiering av plasmid DNA och rena med hjälp av en endotoxinfria plasmid förberedelser kit18 enligt tillverkarens anvisningar.
- Konstruktionen är redo för injektion, således fortsätta med steg 5.
2. kloning av en transgen för inducerbara genuttryck
- Design primers för transgenens förstärkning13,14.
- Lägga till begränsning platser för SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) eller KpnI (GGTACC) 5' ände framåt primer. Lägga till begränsning platser för NotI (GCGGCCGC) eller XhoI (CTCGAG) till 5' slutet av reverse primer.
- Förstärka transgenens med PCR använder villkor optimerad för önskad transgenens14. Rena med en kommersiell DNA rening kit.
- Smälta den renade transgenens och 4 µg av posten vektor (pEN_TTmcs-vektor, se Tabell för material)19 separat med lämplig begränsning nukleaser (se steg 2.2) och buffert i en total volym på 50 µL vid 37 ° C under natten.
- Gel rena smält vektor och infoga med hjälp av en kommersiell gel utvinning kit enligt tillverkarens anvisningar. Utföra vanliga ligering med 100 ng av vektor och 100 – 1000 ng av infoga med 400 U T4 ligase vid 14 ° C i 16 h. värme inaktivera vid 65 ° C i 10 min.
- Omvandla behöriga bakterier använder en standard värme-chock-protokoll-16.
- Plattan på agar plattor som innehåller 15 µg/mL gentamicin. Inkubera vid 37 ° C i 16 h.
- Plocka enstaka kolonier, rena plasmid DNA och verifiera infoga genom sekvensering17 med pCEP framåt primer: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
Obs: PCR på enstaka kolonier kan utföras utan föregående rening med primers pCEP fram och pCEP omvänd (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC-TCG 3'). Detta steg kan användbar för förval av positiva kolonier. - Fortsätt till steg 4.
3. kloning av en miR-shRNA för inducerbara gen Knock-down
- Design miR-shRNA oligonukleotider enligt den pSLIK som kloning protokoll19. Glödga och rena oligonukleotider och späd 1:20 i ddH2O.
- Digest 3 µg av posten vector med 5 U BfuAI vid 50 ° C för 3 h, inaktivera sedan reaktionen vid 65 ° C i 20 min.
Obs: Om samtidig uttryck av grönt fluorescerande protein (GFP) önskas, användning pEN_TTGmiRc19 som en post vektor, annars använder pEN_TTmiRc219. - Gel rena smält vektor som i steg 2.5. Utföra vanliga ligering av 100 ng av vektor och 1 µL renas och utspädd shRNA oligonukleotider (steg 3.1) med 400 U T4 ligase i rumstemperatur i 1 h. värme inaktivera vid 65 ° C i 10 min.
- Omvandla behöriga bakterier använder en standard värme-chock-protokoll-16.
- Plattan på agar plattor som innehåller 15 µg/mL gentamicin. Inkubera vid 37 ° C i 16 h.
- Plocka enstaka kolonier, rena plasmid DNA och verifiera infoga genom Sanger sekvensering17 (sekvensering primer: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
- Fortsätt till steg 4.
4. recombinational kloning för att generera klar-för-injektion kloner
- Blanda 150 ng av posten vektor (från steg 2 eller steg 3) och 150 ng av pTC TET-vektor20.
- Lägg TE buffert till en total volym på 8 µL (pH = 8).
- Överföra LR-clonase enzym mixen II (se Tabell för material) för att is, inkubera i 2 min. Vortex två gånger.
- Tillsätt 2 µL av LR-clonase enzym blandning II till reaktion och inkubera vid 25 ° C i 1 h.
- Stoppa reaktionen genom att lägga till 1 µL av proteinas K-lösning. Inkubera vid 37 ° C i 10 min.
- Omvandla Stbl3 behöriga bakterier med 2 µL av recombinational kloning blanda med en standard värme-chock-protokoll-16.
- Plattan på agar plattor innehållande 100 µg/mL ampicillin. Inkubera vid 30 ° C under 24 h.
- Plocka enstaka kolonier, rena plasmid DNA använder en endotoxinfria plasmid förberedelser kit18 enligt tillverkarens anvisningar och bekräfta vektor integritet genom Sanger sekvensering17 (sekvensering primer 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
- Konstruktionen är redo för injektion, fortsätter du med steg 5.
5. beredning för hydrodynamiska svans ven injektion
Obs: Beredning av konstruktioner för konstituerande och inducerbara genuttryck beskrivs i steg 1, 2, 3 och 4.
- Förbereda steril 0,9% koksaltlösning för injektion (gör inte använda PBS). Använda volym motsvarar ca 10% av musens kroppsvikt. Exempel: för en mus väger 20 gram, förbereda 2 mL lösning.
- Förbered injektionsstället vektorer som blev renat med hjälp av en endotoxinfria plasmid rening kit18 (se steg 1,8 eller 4.8, respektive).
- Lägga till 10 µg eller 15 µg av endotoxinfria Törnrosa vektorn konstruktion (från steg 1 Använd 10 µg, från steg 4 användning 15 µg, respektive) och 1 µg av endotoxinfria pc-HSB521 per mL steril koksaltlösning.
- Förvaras i upp till 4 h vid 4 ° C. Får ej frysas.
6. utföra hydrodynamiska svans ven injektion
- Använd en fasthållning injektionsvätska svans ven (kommersiella eller beredda från en 50 mL konisk tub med hål för andning och svansen). Fyll botten av röret med läskpapper.
- Injektionsvätska, använda möss av ca 8 – 10 veckors ålder med en vikt på 20 – 25 g.
- Väga möss före injektion och förbereda injektionsvolym enligt kroppsvikt (motsvarande 10% av kroppsvikt, se steg 5.1). Förbereda en steril 3 mL-sprutan med en 27 G-nål för injektion och fyll på med önskad volym.
- Placera musen i fasthållning. Justera mängden vävnad papper (se steg 6.1) att lämna endast minimalt utrymme för rörelse men tillräckligt utrymme för att andas.
- Se till att musen andas regelbundet.
- Varma svansen med en infraröd lampa för 30-60 s. noga uppmärksam på tecken på överhettning.
- Ren stjärten med en spritsudd.
- Stick in nålen nästan horisontellt i endera av två laterala svans venerna nära basen av svansen.
Obs: Om placerade framgångsrikt, en liten mängd blod kan flöda tillbaka in konen av nålen. Det är inte rekommenderat att aktivt aspirera eftersom någon ytterligare förflyttning av nålen kan resultera i dess förskjutning eller skada av venen. - Injicera den totala volymen i svansen ven inom 8-10 s.
- Omedelbart ta bort musen från fasthållning. Komprimera injektion sår för minst 30 s eller tills någon blödning avtar.
- Placera musen i en separat bur. När musen har återhämtat sig från förfarandet (ca 30 – 60 min), flytta musen tillbaka till sin ursprungliga bur. Kolla på musen regelbundet för nästa 24 h.
Obs: Mild sedering av musen observeras rutinmässigt för upp till 2 h efter injektionen. - Innan ytterligare experiment (dvs, steg 7), vänta 10 – 15 dagar för clearance av icke-integrerade vektorer.
7. induktion av transfekterade CreER med Tamoxifen
FÖRSIKTIGHET: Tamoxifen är skadlig kan, vara cancerogena eller skada fertiliteten. Hänvisas till säkerhetsdatabladet.
- Planera intraperitoneal tamoxifen injektioner under tre följande dagar.
- Dag 1, lös 10 mg tamoxifen i 40 µL etanol. Inkubera vid 55 ° C i 10 min. Vortex flera gånger tills tamoxifen har upplöst.
- Lägg till 960 µL majsolja. Inkubera i 5 minuter vid 55 ° C. Vortex flera gånger för att få en klar lösning.
- Förbered en lösning i en 1 mL insulinspruta med en 27 G nål.
- Kragen med musen genom att ta tag i musen försiktigt med tummen och andra fingret, hals fastställande svansen mellan basen av handen och fjärde och femte fingret.
- Injicera 0,1 mL (= 1 mg tamoxifen) av lösningen intraperitonealt i den vänstra nedre kvadranten av buken.
- Upprepa injektionerna på dag två och tre.
8. induktion av tetracyklin-beroende gen eller shRNA uttryck
FÖRSIKTIGHET: Doxycyklin kan vara skadligt. Hänvisas till säkerhetsdatabladet.
Obs: Beroende på typ och längd av experimentet, doxycyklin kan levereras i dricksvatten (steg 8,1) eller chow (8,2 steg)
-
För kort sikt experiment (< 10 dagar) administrera doxycyklin via dricksvattnet använder följande protokoll.
- Lös upp 5 g sackaros i 100 mL kranvatten. Autoklav.
- Lös 100 mg doxycyklinhyklat i 5 mL sackaroslösning (steg 8.1.1) i en 15 mL koniska rör.
- Med en 10 mL spruta, sterila filter lösningen genom ett 0,2 µm filter. Lägga till sackaros lösningen bereddes i steg 8.1.1.
- Leverera doxycyklin-sackaroslösning som dricksvatten till musen. Kontrollera dagligen och ersätt när lösningen blir grumlig vilket indikerar bakteriell överväxt (Ersätt klar lösning efter tre dagar).
- För långsiktiga experiment (> 10 dagar) eller experiment känsliga för metabola förändringar, använda kommersiella doxycyklin-chow (t.ex.doxycyklin Hyclate Chow 0,625 g/kg) att undvika uttorkning och/eller sackaros-inducerade förändringar i levern hos behandlade djur.
9. beredning av mus lever för analys av immunfärgning
FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD kan vara skadligt. Hänvisas till säkerhetsdatabladet.
Obs: Tidpunkt när möss kommer att analyseras beror på experimentet. Det rekommenderas att analysera levervävnad efter inte mindre än tre dagar av doxycyklin behandling att säkerställa tillräcklig induktion av transgenens eller shRNA uttryck.
- Förbereda en 1 mL spruta med en 27 G nål med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA).
- Avliva musen genom en lämplig metod enligt en godkänd djur protokoll.
Obs: Riktlinjer för lämpliga metoder för dödshjälp kan variera beroende på institutionen. - Använda dissekera saxen och anatomiska pincetten, öppna försiktigt bukhålan med en median laparotomi att exponera levern. Flytta tunntarmen till rätten att avslöja portalen ven och den sämre vena cava (IVC).
- Stick in nålen i den förberedda sprutan (se steg 9,1) in i IVC och cut portalen ven. Injicera 1 mL av PFA långsamt i IVC att BEGJUTA levern vävnad och ta bort auto-fluorescerande röda blodkroppar (önskvärt om Immunofluorescerande färgning ska utföras).
- Ta bort levern. Skölj i vatten och överföra till 5 – 10 mL 4% PFA lösning.
- För paraffin avsnitt är fix vävnad för 36 – 48 h. vävnad redo för dehydrering och inbäddning av paraffin.
-
För frusna snitt, fixa vävnad i 4% PFA för 1 h.
- För cryoprotection, över till 10% sackaroslösning. Inkubera 60 min.
- Överföra till 20% sackaroslösning. Inkubera 60 min.
- Överföra till 30% sackaroslösning. Inkubera 12 – 16 h. Embed i inbäddning förening för frusna snitt och frysa vid-20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transfection effekt hydrodynamic svans ven injektion: Procentandelen av murina hepatocyter som är transfekterade hydrodynamiskt av en enda injektion varierar och beror på flera parametrar såsom injektionsvolym, injektion tid, mängden injicerad DNA, och storleken på den injicerade konstruera6, 22,23. Dessutom är transfection effektiviteten generellt lägre i större djur, där en större vaskulära diameter samt större sinusformad område leder till en minskning av totala trycket. För att visualisera transfection effektivitet, utfördes HTVI av en CreER transposon konstruktion hos möss som härbärgerat en Rosa26mTmG reporter gen följt av tamoxifen-medierad aktivering av den CreER konstruktion. Låg volym eller långvarig injektion tid för tekniska skäl resulterar i minskad transfection effektivitet med endast några transfekterade hepatocyter detekterbara i hela levern, medan optimal injektion villkor resultera i högre transfection effektivitetsvinster som skildras av reporter färgning efter HTVI av en CreER transposon (figur 1A). För att bedöma transfection effekt, rekommenderas immunfärgning av de transfekterade transgenens eller – som i fallet med CreER - av en lämplig reporter gen. Transfection effektivitet kan alternativt beräknas från mRNA uttryck analys av de transfekterade transgenens.
Transfection av pericentral hepatocyter: Efter hydrodynamiska injektion, kan en tryckgradient längs den sinusformade utrymme - där trycket är störst nära central ven och minst i de areala periportal - leda till Rekommenderad transfection i området pericentral. Vi analyserade lever med en låg andel av transgenens-uttryckande hepatocyter och bedömt deras relativa position i den levern LOB av co-immunfärgning för glutamin kväveoxidsyntas (GS), en markör för pericentral hepatocyter. Intressant, flesta av hepatocyter som visade reporter genuttryck efter HTVI av en CreER konstruktion hopade runt central ven men inte portal området (figur 1B) som anger högre transfection effektivitet runt central ven.
In vivo imaging efter HTVI av ett luciferas transposon: För att bedöma om den enda kopia integration observerats efter HTVI av transposon konstruktioner24 är tillräcklig för i vivo imaging, vi injiceras en transposon konstruktion härbärgerat en luciferas uttryck kassett under kontroll av en lever som är specifika Arrangören konstruktion. Möss injicerades med luciferin och avbildas med en in-vivo imaging system två veckor efter HTVI (figur 2A). Imaging visade robust och stabil luciferas mareld i levern 15 dagar efter injektion och vid senare tidpunkter (figur 2B och data som inte visas). Dessa resultat visar att systemet kan framgångsrikt användas att följa förekomsten av transfekterade celler i vivo av Mareld imaging.
Kombinerade CreER och inducerbara transgenens eller shRNA uttryck: Tidigare genererade vi en transposon-konstruktion som kombinerar det konstitutiva uttrycket för en inducerbara Cre-recombinase (CreER) med inducerbara uttryck av en transgen eller en shRNA val20 (figur 3A). Injektion av denna konstruktion i Rosa26mTmG-reporter möss och CreER aktivering av tamoxifen visade robust uttryck av genen reporter jämförbara med de resultat som erhålls med en transposon-konstruktion för enkel transgenens uttryck ( Figur 3B). Efter doxycyklin behandling, kan inducerbara transgenens uttryck visualiseras genom lämplig antikroppar i transfekterade hepatocyter (figur 3 c). För inducerbara shRNA uttryck rekommenderas användning av en GFP-shRNA konstruktion som cytoplasmiska GFP uttryck upptäcks av immunfärgning kan användas som en surrogatmarkör för shRNA uttryck (figur 3D). Notera är transgenens eller shRNA uttryck, respektive, endast upptäckas i en delmängd av hepatocyter, vilket kan bero på den relativt höga andelen proteinuttryck krävs för detektion av immunfärgning20.
Figur 1: Transfection av hepatocyter av HTVI. (A) variabel transfection effektivitet efter HTVI av en CreER-transposon in möss härbärgerat en Rosa26mTmG / + reporter och följt av behandling med tamoxifen. Transfekterade hepatocyter är positiva för membran-bundna grönt fluorescerande protein (GFP, grön). (B) samarbete färgning för CreER aktiveras hepatocyter (grön) hos möss som härbärgerat Rosa26mTmG reporter med den central ven markör glutamin kväveoxidsyntas (GS, röd). Här PV: portvenen, CV: central ven. Skala staplarna representerar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: In vivo imaging av luciferas. (A) Transposon konstruera innehållande en luciferas uttryck kassett (inte dras till skala). Injektion och behandling system för visualisering av nedsatt luciferas uttryck. SB: sovande skönhet erkännande platser, HTVI: hydrodynamiska svans ven injektion. (B) representativ bild av nedsatt luciferas Mareld 15 dagar efter HTVI av en transposon-luciferas konstruktion tillsammans med pHSB5 använder en i vivo imaging system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kombinerade CreER och inducerbara gen/shRNA uttryck. (A) Transposon konstruera uttryck för inducerbara Cre recombinase tillsammans med uttryck av tetracyklin-inducerbara transgenens eller shRNA (pTC Tet), inte dras att skala. (B) grön membran färgning indikerar transfekterade hepatocyter efter injektion av pTC Tet bygga in Rosa26mTmG / + reporter möss och CreER aktiveringen med tamoxifen. Skalstapeln representerar 100 µm. (C) inducerbara genuttryck 5 dagar efter doxycyklin behandling kan visualiseras genom immunfärgning för transgenens (YAP, röd) i transfekterade hepatocyter. (D) inducerbara miR-shRNA uttryck 5 dagar efter doxycyklin behandling anges av cytoplasmisk grönt fluorescerande protein (GFP) färgning av den GFP-shRNA konstruktion. Transfekterade hepatocyter skildras av membran-bundna GFP. Skala barer i C) och D) representerar 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfection av hepatocyter med hydrodynamiska svans ven injektion har blivit en etablerad metod sedan introduktionen mer än 15 år sedan6. Den injicerade volymen överstiger hjärtminutvolym och flöden från den sämre vena cava in sinusoider av levern7, leder till transfection på cirka 10-20%, i vissa fall upp till 40% av hepatocyter25,26. Prediktorer för en framgångsrik transfection är den injicerade volymen per injicerade tid22,23. En låg transfection effektivitet (figur 1A, vänstra panelen) är därför oftast på grund av misslyckandet med att upprätthålla den injektion-hastigheten under den procedur7. Men även med en optimal teknik kvar transfection effektivitet som uppnås genom HTVI nedanför den räntesats som erhållits av virusinfektion med adenoviruses eller adeno-associerade virus som kan nå nästan 100%5,27 . För att uppnå framgångsrika svans ven injektioner, är det viktigt att säkerställa en stabil positionering av nålen i blodkärlet. Detta uppnås enkelt i venerna med större diameter närmare till basen av svansen. Dilatation av ven genom att värma upp svansen rekommenderas dessutom. Bästa resultat uppnås med hjälp av en infraröd lampa, men en icke-Infraröd värmelampa eller nedsänkning av svansen i varmt vatten kan också användas. I vissa fall komplettera upp till 200 µL saltlösning av intraperitoneal injektion cirka 30 minuter innan HTVI kommer att förbättra vätskestatus djuren vilket resulterar i utvidgning av blodkärl. För att bibehålla en konstant injektion-hastigheten, bör svansen av musen hållas ordentligt tillbaka för att undvika varje förflyttning av svansen, vilket kan resultera i förskjutning av nålen. Vi föreslår att du använder en konstruktion som kan upptäckas genom immunfärgning för validering. Alternativt, transfection effekt kan uppskattas av mRNA uttryck analys eller sekvensering av integrerade DNA28.
Våra data indikerar att transposon integration observeras företrädesvis i området pericentral i den levern lobule. Den dominerande transfection av hepatocyter runt central ven beror sannolikt på den unika hemodynamiken av HTVI som det är också observerats i icke-transposon baserat transfection29. Detta konstaterande kan vara av relevans för vissa program, såsom induktion av akut leverskada av CCl4, som främst drabbar pericentral hepatocyter. I samband med låg transfection effektivitet, kunde CCl4 behandling därför leda till betydande minskning av antalet transfekterade hepatocyter. HTVI är dessutom begränsad till periportal målceller inklusive gallgången celler15.
Utöver system som använder HTVI av transposon konstruktioner för att uppnå stabil uttryck för en enda transgenens, vi nyligen lagt fram ett system som tillåter samtidig uttrycket av CreER och inducerbara uttryck av en gen eller en miR-shRNA från en enda vektor11 . Detta system är särskilt användbar för att förhöra specifika gener i Cre/LoxP-baserade mus stammar. Som transgener eller shRNA konstruktioner införs genom en snabb och tillförlitlig recombinational kloning förfarande kan systemet enkelt anpassas för screening metoder. Vector systemet förmedlar tillförlitlig inducerbara uttryck i vivo som är helt beroende av leverans av doxycyklin11,30. Denna praktiska video-baserade guide ger instruktioner från kloning av lämpliga vektorer över induktion av genuttryck analys av levervävnad.
Dock för att säkerställa systemets effektivitet, flera aspekter bör hållas i åtanke: för att upprätthålla långsiktigt uttryck, genomisk integration medieras på TA-platser av Törnrosa transposase8,11. Eftersom integrationen effektivitet är beroende av transposon storlek, är det viktigt att hålla storleken på transgenens bygga i åtanke när man utformar den vektor31. Uttryck effektivitet av produktens inducerbara genen i levern är dessutom beroende av rtTA3-promotorn11. För optimal uttryck resultat, Använd av en vektor konstruktion med en lever specifika ApoE.HCR.hAAT-arrangören rekommenderas (Addgene #85578), eftersom det visar högsta effektivitet i en jämförelse av tre promotorer11. Med en optimerad arrangören konstruktion, kan inducerbara transgenens/shRNA uttryck upptäckas genom immunfärgning i upp till 30% av transfekterade celler20. Om inducerbara proteinnivåer finns under ett visst tröskelvärde som krävs för detektion av immunfärgning, måste detta fastställas. Viktigast av allt, kan ingen transgenens/shRNA uttryck upptäckas genom immunfärgning hos möss som inte behandlades med doxycyklin. Slutligen är uttrycket av gener under kontroll av tetracyklin svar elementet (TRE) beroende av dosen av doxycyklin32,33. För kort sikt experiment är doxycyklin administrering via dricksvattnet väl etablerad34,35. Sackaros är vanligen till att ge en bättre smak. Dock kan detta leda till polydipsi och uttorkning, och användningen av doxycyklin chow rekommenderas för långsiktiga experiment36,37.
Sammanfattningsvis är hydrodynamisk svans ven injektion en allmänt etablerad metod i levern forskning. Dess tillämpning varierar från studier av hepatit B till lever fibros eller hepatocellulära carcinom modeller38,39,40,41. Systemet beskrivs i detta manuskript är särskilt användbart i förhör av specifika gener i Cre/LoxP-baserade modeller av leversjukdom. Dessutom kan överuttryck i levern också användas för forskning av hematologiska sjukdomar42,43 eller ta itu med immunologisk frågor44,45. Utöver analysen av specifika gener av intresse, kan presenterade systemet också enkelt anpassas till screening eller multiplexing metoder. Denna video-baserade guide kommer därför vara till hjälp för en stor gemenskap av forskare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Deutsche Krebshilfe, Tyskland (licensnummer 111289 till UE), den Lucile Packard Foundation för barns hälsa (Ernest och Amelia Gallo begåvat postdoktorala gemenskap - CTSA licensnummer UL1 RR025744 till UE). Vi tackar Dr Mark A. Kay för vektor konstruktioner och experimentella råd och Dr Julien Sage för möss och experimentell support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
References
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
