Эта рукопись обеспечивает протокол для анализа двухнитевые разрывы ДНК, иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.
Двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются серьезные повреждения ДНК. Анализ формирования и ремонт DSB актуальна в широком спектре областей исследований, включая целостности генома, генотоксичности, радиационной биологии, старение, рак и разработки лекарственных средств. В ответ на DSB гистон H2AX фосфорилированных 139 Серина в регионе несколько пар megabase, образуя дискретных ядерной очагов обнаружено в иммунофлуоресценции. Кроме того, 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другим важным DSB-отзывчивым белком, поощрение ремонт DSB nonhomologous конце-присоединиться к предотвращая гомологичная рекомбинация. Согласно конкретных функций γH2AX и 53BP1 совокупный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть разумный подход для детального анализа DSB. Эта рукопись предоставляет пошаговые протокол дополнена Методические заметки для выполнения метода. В частности влияние клеточный цикл на γH2AX очагов модели проявляется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF. Кроме того значение очагов γH2AX качестве биомаркера изображен в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека. Наконец генетическая нестабильность в CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемии расследуется иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.
ДНК постоянно разрушен эндогенных (например, стресс репликации, реактивнооксигенных видов, внутренняя нестабильность ДНК) и внешних (например, химических радикалов, облучение) источников (рис. 1)1,2 ,3,4. Среди повреждения ДНК двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются особенно серьезных поражений и может вызвать смерть клетки или канцерогенеза. Около 50 ОУС могут возникнуть за5клеток и клеточного цикла. В клетках млекопитающих гомологичная рекомбинация (HR) и nonhomologous конце присоединение (NHEJ) разработан как основных путей для ремонта ДГЖД (рис. 2). HR происходит в конце S/G2 фазе и использует нетронутыми сестра хроматиды как шаблон для ремонта потенциально без ошибок. В сравнении NHEJ активным на протяжении клеточного цикла и потенциально мутагенных как пар могут быть добавлены или резецируется перед лигирование сломанной заканчивается. Кроме того альтернативные присоединения конца могут привлекаться в качестве механизма медленно мутагенных резервного восстановления в случае NHEJ дефицит6,7.
DSB побудить фосфорилирование гистон H2AX 139 Серина в регионе несколько пар megabase вокруг каждого DSB. Формируя ядерной очагов названы γH2AX очагов и поддаются обнаружению с помощью микроскопии иммунофлуоресценции8. ΓH2AX способствует набору далее DSB-отзывчивым белков и участвует в chromatin remodeling, репарации ДНК и трансдукции сигнала9. Как считается, что каждый γH2AX фокус представляют единый DSB, количественная оценка DSB, иммунофлуоресценции возможно, которая была продемонстрирована в рак клеточных линий и пациентов образцов10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другой ключевой белок в посредничестве DSB ремонт. Он участвует в наборе DSB-отзывчивым белков, контрольно-пропускной пункт сигнализации и Синапсис DSB заканчивается15. Кроме того 53BP1 играет решающую роль в выборе пути ремонт DSB. Это вызывает ремонт DSB к NHEJ время HR16. С учетом подлинных функций γH2AX и 53BP1 в ремонт DSB одновременный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть полезным методом для точного анализа формирования и ремонт DSB.
Эта рукопись содержит пошаговые протокол для выполнения иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 в клеточных ядер. В частности техника применяется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF, в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека и CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемией. Подробности метода указано в контексте представленных результатов.
Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 является полезным методом для анализа формирования и ремонт ДГЖД в широком спектре областей исследований. Критические параметры, которые влияют на результаты экспериментов являются фазы клеточного цикла, агенты, используемые для фиксации и permeabilization клет…
The authors have nothing to disclose.
Проект был поддержан фондом немецкого Хосе Каррерас лейкемии (DJCLS 14 R/2017).
RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
Cytospin device | |||
Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |