Summary

डीएनए डबल-किनारा टूट के गठन और मरंमत के विश्लेषण के लिए γH2AX और 53BP1 की इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

Published: November 03, 2017
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Summary

इस पांडुलिपि γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा डीएनए डबल किनारा टूटता के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है ।

Abstract

डीएनए डबल-किनारा टूटता (DSB) गंभीर डीएनए घावों हैं । गठन और DSB की मरंमत का विश्लेषण जीनोम अखंडता, genotoxicity, विकिरण जीवविज्ञान, उंर बढ़ने, कैंसर, और नशीली दवाओं के विकास सहित अनुसंधान क्षेत्रों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में प्रासंगिक है । DSB के जवाब में, citrullinated H2AX Serine माइक्रोस्कोपी द्वारा detectable परमाणु घावों का गठन कई megabase जोड़े के एक क्षेत्र में इम्यूनोफ्लोरेसेंस १३९ पर phosphorylated है । इसके अलावा, 53BP1 (p53 बाइंडिंग प्रोटीन 1) एक और महत्वपूर्ण DSB-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन nonhomologous के अंत में शामिल होने से DSB की मरंमत को बढ़ावा देने है, जबकि मुताबिक़ पुनर्संयोजन को रोकने । γH2AX और 53BP1 के विशिष्ट कार्यों के अनुसार, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा γH2AX और 53BP1 के संयुक्त विश्लेषण DSB का एक विस्तृत विश्लेषण के लिए एक उचित दृष्टिकोण हो सकता है । इस पांडुलिपि तकनीक प्रदर्शन के लिए व्यवस्थित नोटों के साथ पूरक एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है. विशेष रूप से, γH2AX घावों पैटर्न पर कोशिका चक्र के प्रभाव को सेल लाइन NHDF के सामान्य fibroblasts में प्रदर्शित किया जाता है । इसके अलावा, एक γH2AX के रूप में घावों के मूल्य एक स्वस्थ व्यक्ति के एक्स-रे विकिरणित लिम्फोसाइटों में दर्शाया गया है । अंत में, आनुवंशिक अस्थिरता γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया के साथ एक रोगी के CD34 + कोशिकाओं में जांच की है ।

Introduction

डीएनए लगातार अंतर्जात (जैसे, प्रतिकृति तनाव, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, डीएनए की आंतरिक अस्थिरता) और exogenous (जैसे, रासायनिक कण, विकिरण) स्रोतों (चित्रा 1)1,2 से क्षतिग्रस्त है ,3,4. डीएनए में क्षति के अलावा, डीएनए डबल-किनारा टूटता (DSB) विशेष रूप से गंभीर घावों हैं और कोशिका मृत्यु या कैंसरजनन को प्रेरित कर सकते हैं । प्रति सेल और सेल चक्र5के बारे में ५० DSB पैदा हो सकता है । स्तनधारी कोशिकाओं में, मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) और nonhomologous अंत में शामिल होने (NHEJ) DSB (चित्रा 2) की मरंमत के लिए प्रमुख रास्ते के रूप में विकसित की है । HR देर S/G2 चरण में होता है और संभावित रूप से त्रुटि मुक्त मरंमत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में एक बरकरार बहन chromatid का उपयोग करता है । इसकी तुलना में, NHEJ सेल चक्र भर में सक्रिय है और संभावित mutagenic के रूप में आधार जोड़े जोड़ा जा सकता है या टूट समाप्त होता है की बंधाव से पहले प्रतिप्रदाय । इसके अलावा, वैकल्पिक अंत में शामिल होने के NHEJ कमी6,7के मामले में एक धीमी mutagenic बैक-अप मरंमत तंत्र के रूप में लगे हो सकता है ।

DSB एक Serine के आसपास कई megabase जोड़े के एक क्षेत्र में DSB १३९ पर citrullinated H2AX के फास्फारिलीकरण प्रेरित । गठन परमाणु घावों γH2AX घावों का नाम है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी8द्वारा detectable हैं । γH2AX आगे DSB-उत्तरदायी प्रोटीन की भर्ती को बढ़ावा देता है और क्रोमेटिन remodeling में शामिल है, डीएनए की मरंमत, और संकेत transduction9। प्रत्येक γH2AX ध्यान के रूप में एक एकल DSB का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा DSB के ठहराव संभव है, जो कैंसर सेल लाइनों और रोगी नमूनों में प्रदर्शन किया गया है10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 बाइंडिंग प्रोटीन 1) DSB मरंमत मध्यस्थता में एक और महत्वपूर्ण प्रोटीन है । यह DSB-उत्तरदायी प्रोटीन, चेकपॉइंट सिग्नलिंग की भर्ती में शामिल है, और DSB के synapsis15समाप्त होता है । इसके अलावा, 53BP1 DSB मरंमत मार्ग विकल्प में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यह NHEJ की ओर DSB की मरंमत ट्रिगर जबकि एचआर16रोका है । DSB मरम्मत में γH2AX और 53BP1 के वास्तविक कार्यों को ध्यान में रखते हुए, 53BP1 माइक्रोस्कोपी द्वारा γH2AX और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के एक साथ विश्लेषण के गठन और DSB की मरंमत के सटीक विश्लेषण के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है ।

इस पांडुलिपि सेल नाभिक में γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है । विशेष रूप से, तकनीक सेल लाइन NHDF के सामान्य fibroblasts में लागू किया जाता है, एक स्वस्थ व्यक्ति के एक्स-रे विकिरणित लिम्फोसाइटों में और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया के साथ एक रोगी की CD34 + कोशिकाओं में । विधि के विवरण प्रस्तुत परिणामों के संदर्भ में बताया जाता है ।

Protocol

यहाँ वर्णित सभी विधियों को हीडलबर्ग विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय मैनहेम की एथिक्स कमेटी द्वितीय द्वारा अनुमोदित किया गया है । लिखित सूचित सहमति सभी व्यक्तियों से प्राप्त की गई थी.

1. ?…

Representative Results

कोशिकाओं में γH2AX घावों का विश्लेषण G0/G1 चरण और G2 चरण में सबसे सटीक है जब γH2AX घावों के रूप में अलग फ्लोरोसेंट डॉट्स (चित्र 5 ए) दिखाई देते हैं । इसके विपरीत, एस चरण के दौरान कोशिकाओं में γH2A…

Discussion

γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी अनुसंधान क्षेत्रों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम में गठन और DSB की मरंमत के विश्लेषण के लिए एक उपयोगी तरीका है । महत्वपूर्ण मापदंडों है कि प्रयोगों के परिणाम को प्…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस परियोजना को जर्मन जोस Carreras ल्यूकेमिया फाउंडेशन (DJCLS 14 आर/2017) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

RPMI medium Sigma-Aldrich R0883 Medium for cell culture
Heparin sodium ratiopharm PZN 3029843  Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9% B. Braun PZN 1957154 Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X Sigma-Aldrich 59427C Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-046-702 Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides Thermo Scientific ER-203B-CE24 Microscope slides
Megafuge 1.0 R Heraeus 75003060  Tabletop centrifuge 
Cytospin device
Lid Heraeus 76003422 Lid for working without micro-tubes
Cyto container Heraeus 75003416 Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier Heraeus 75003414 Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert Heraeus 75003417 Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9) Thermo Scientific 85112 Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M Merck Millipore 109107 Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Fixation agent
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 Balanced salt solution
Chemiblocker Merck Millipore 2170 Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) Merck Millipore 05-636 Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) Novus Biologicals NB100-304 Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody Invitrogen A-11001 Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody Invitrogen A-21428 Secondary antibody
Vectashield mounting medium Vector Laboratories H-1200 Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1 Zeiss 490035 Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera Metasystems H-0310-010-MS Camera system for digital recording
Isis software Metasystems Not applicable Microscope software

References

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Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J. Vis. Exp. (129), e56617, doi:10.3791/56617 (2017).

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