डीएनए डबल-किनारा टूट के गठन और मरंमत के विश्लेषण के लिए γH2AX और 53BP1 की इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी
Summary
इस पांडुलिपि γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा डीएनए डबल किनारा टूटता के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है ।
Abstract
डीएनए डबल-किनारा टूटता (DSB) गंभीर डीएनए घावों हैं । गठन और DSB की मरंमत का विश्लेषण जीनोम अखंडता, genotoxicity, विकिरण जीवविज्ञान, उंर बढ़ने, कैंसर, और नशीली दवाओं के विकास सहित अनुसंधान क्षेत्रों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में प्रासंगिक है । DSB के जवाब में, citrullinated H2AX Serine माइक्रोस्कोपी द्वारा detectable परमाणु घावों का गठन कई megabase जोड़े के एक क्षेत्र में इम्यूनोफ्लोरेसेंस १३९ पर phosphorylated है । इसके अलावा, 53BP1 (p53 बाइंडिंग प्रोटीन 1) एक और महत्वपूर्ण DSB-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन nonhomologous के अंत में शामिल होने से DSB की मरंमत को बढ़ावा देने है, जबकि मुताबिक़ पुनर्संयोजन को रोकने । γH2AX और 53BP1 के विशिष्ट कार्यों के अनुसार, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा γH2AX और 53BP1 के संयुक्त विश्लेषण DSB का एक विस्तृत विश्लेषण के लिए एक उचित दृष्टिकोण हो सकता है । इस पांडुलिपि तकनीक प्रदर्शन के लिए व्यवस्थित नोटों के साथ पूरक एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है. विशेष रूप से, γH2AX घावों पैटर्न पर कोशिका चक्र के प्रभाव को सेल लाइन NHDF के सामान्य fibroblasts में प्रदर्शित किया जाता है । इसके अलावा, एक γH2AX के रूप में घावों के मूल्य एक स्वस्थ व्यक्ति के एक्स-रे विकिरणित लिम्फोसाइटों में दर्शाया गया है । अंत में, आनुवंशिक अस्थिरता γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया के साथ एक रोगी के CD34 + कोशिकाओं में जांच की है ।
Introduction
डीएनए लगातार अंतर्जात (जैसे, प्रतिकृति तनाव, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, डीएनए की आंतरिक अस्थिरता) और exogenous (जैसे, रासायनिक कण, विकिरण) स्रोतों (चित्रा 1)1,2 से क्षतिग्रस्त है ,3,4. डीएनए में क्षति के अलावा, डीएनए डबल-किनारा टूटता (DSB) विशेष रूप से गंभीर घावों हैं और कोशिका मृत्यु या कैंसरजनन को प्रेरित कर सकते हैं । प्रति सेल और सेल चक्र5के बारे में ५० DSB पैदा हो सकता है । स्तनधारी कोशिकाओं में, मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) और nonhomologous अंत में शामिल होने (NHEJ) DSB (चित्रा 2) की मरंमत के लिए प्रमुख रास्ते के रूप में विकसित की है । HR देर S/G2 चरण में होता है और संभावित रूप से त्रुटि मुक्त मरंमत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में एक बरकरार बहन chromatid का उपयोग करता है । इसकी तुलना में, NHEJ सेल चक्र भर में सक्रिय है और संभावित mutagenic के रूप में आधार जोड़े जोड़ा जा सकता है या टूट समाप्त होता है की बंधाव से पहले प्रतिप्रदाय । इसके अलावा, वैकल्पिक अंत में शामिल होने के NHEJ कमी6,7के मामले में एक धीमी mutagenic बैक-अप मरंमत तंत्र के रूप में लगे हो सकता है ।
DSB एक Serine के आसपास कई megabase जोड़े के एक क्षेत्र में DSB १३९ पर citrullinated H2AX के फास्फारिलीकरण प्रेरित । गठन परमाणु घावों γH2AX घावों का नाम है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी8द्वारा detectable हैं । γH2AX आगे DSB-उत्तरदायी प्रोटीन की भर्ती को बढ़ावा देता है और क्रोमेटिन remodeling में शामिल है, डीएनए की मरंमत, और संकेत transduction9। प्रत्येक γH2AX ध्यान के रूप में एक एकल DSB का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा DSB के ठहराव संभव है, जो कैंसर सेल लाइनों और रोगी नमूनों में प्रदर्शन किया गया है10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 बाइंडिंग प्रोटीन 1) DSB मरंमत मध्यस्थता में एक और महत्वपूर्ण प्रोटीन है । यह DSB-उत्तरदायी प्रोटीन, चेकपॉइंट सिग्नलिंग की भर्ती में शामिल है, और DSB के synapsis15समाप्त होता है । इसके अलावा, 53BP1 DSB मरंमत मार्ग विकल्प में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यह NHEJ की ओर DSB की मरंमत ट्रिगर जबकि एचआर16रोका है । DSB मरम्मत में γH2AX और 53BP1 के वास्तविक कार्यों को ध्यान में रखते हुए, 53BP1 माइक्रोस्कोपी द्वारा γH2AX और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के एक साथ विश्लेषण के गठन और DSB की मरंमत के सटीक विश्लेषण के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है ।
इस पांडुलिपि सेल नाभिक में γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है । विशेष रूप से, तकनीक सेल लाइन NHDF के सामान्य fibroblasts में लागू किया जाता है, एक स्वस्थ व्यक्ति के एक्स-रे विकिरणित लिम्फोसाइटों में और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया के साथ एक रोगी की CD34 + कोशिकाओं में । विधि के विवरण प्रस्तुत परिणामों के संदर्भ में बताया जाता है ।
Protocol
यहाँ वर्णित सभी विधियों को हीडलबर्ग विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय मैनहेम की एथिक्स कमेटी द्वितीय द्वारा अनुमोदित किया गया है । लिखित सूचित सहमति सभी व्यक्तियों से प्राप्त की गई थी.
1. ?…
Representative Results
Discussion
γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी अनुसंधान क्षेत्रों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम में गठन और DSB की मरंमत के विश्लेषण के लिए एक उपयोगी तरीका है । महत्वपूर्ण मापदंडों है कि प्रयोगों के परिणाम को प्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को जर्मन जोस Carreras ल्यूकेमिया फाउंडेशन (DJCLS 14 आर/2017) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
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