Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.
Roturas de DNA doble cadena (DSB) son graves lesiones de ADN. Análisis de la formación y reparación de DSB es relevante en un amplio espectro de áreas de investigación incluyendo la integridad del genoma, genotoxicidad, Radiobiología, envejecimiento, cáncer y desarrollo de medicamentos. En respuesta a OSD, la histona H2AX es fosforilada en serina 139 en una región de varios pares de megabase formando discretos focos nucleares detectables por microscopia de la inmunofluorescencia. Además, 53BP1 (proteína 1 de Unión p53) es otra proteína sensible al OSD importante promover la reparación de DSB por nonhomologous end-joining evitando la recombinación homóloga. Según las funciones específicas de γH2AX y 53BP1, el análisis combinado de γH2AX y 53BP1 por microscopia de la inmunofluorescencia puede ser un enfoque razonable para un análisis detallado del OSD. Este manuscrito ofrece un protocolo paso a paso con notas metódicas para la realización de la técnica. Específicamente, se demuestra la influencia del ciclo celular en patrones de focos γH2AX en fibroblastos normales de la línea celular NHDF. Además, el valor de los focos de γH2AX como un biomarcador es representado en los linfocitos de rayos x irradiada de un individuo sano. Finalmente, se investiga inestabilidad genética en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.
DNA se daña continuamente por endógeno (p. ej., estrés de replicación, especies reactivas de oxígeno, la inestabilidad intrínseca del ADN) y exógenos (por ejemplo, los radicales químicos, irradiación) fuentes (figura 1)1,2 ,3,4. Entre los daños en el ADN, roturas de DNA doble cadena (DSB) son particularmente graves lesiones y pueden inducir la muerte celular o carcinogénesis. Cerca de 50 OSD puede surgir por célula y ciclo celular5. En células de mamífero, recombinación homóloga (HR) y nonhomologous end-joining (NHEJ) desarrollados como principales vías para la reparación de DSB (figura 2). HR se produce en la fase de finales S/G2 y utiliza una hermana intacta cromátide como plantilla para la reparación potencialmente libre de errores. En comparación, el NHEJ es activa durante todo el ciclo de la célula y potencialmente mutagénicos como pares de bases puede ser añadidos o resecados antes de la ligadura de los extremos rotos. Además, unirse a final alternativo se podrá contratarse como un mecanismo de lenta reparación mutagénica de respaldo en caso de deficiencia NHEJ6,7.
DSB inducen la fosforilación de la histona H2AX en 139 de serina en una región de varios megabase pares alrededor de cada OSD. Los focos nucleares formando se denominan focos de γH2AX y son detectables por inmunofluorescencia microscopia8. ΓH2AX promueve el reclutamiento de proteínas más sensible al OSD y participa en la remodelación de la cromatina, la reparación del ADN y de transducción de señal9. Como cada enfoque γH2AX se considera representar un OSD único, la cuantificación del OSD por microscopia de la inmunofluorescencia es posible, que se ha demostrado en líneas celulares de cáncer y muestras de los pacientes10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (proteína 1 de Unión p53) es otra proteína clave en la mediación reparación DSB. Está implicado en el reclutamiento de DSB-responsivo proteínas, puesto de control las señales y la sinapsis de OSD extremos15. Además, 53BP1 desempeña un papel fundamental en la elección de vía de reparación DSB. Activa la reparación de DSB hacia NHEJ mientras que HR es prevenido16. Teniendo en cuenta las funciones originales de γH2AX y 53BP1 en reparación DSB, el análisis simultáneo de γH2AX y 53BP1 por microscopia de la inmunofluorescencia puede ser un método útil para el análisis exacto de la formación y reparación de DSB.
Este manuscrito proporciona un protocolo paso a paso para realizar microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 en núcleos celulares. Específicamente, la técnica se aplica en fibroblastos normales de la línea celular NHDF, en linfocitos de rayos x irradiada de un individuo sano y en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda. Los detalles del método se señalan en el contexto de los resultados presentados.
Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 es un método útil para el análisis de la formación y reparación de DSB en un amplio espectro de áreas de investigación. Los parámetros críticos que influyen en el resultado de los experimentos son la fase del ciclo celular, los agentes utilizados para la fijación y permeabilización de las células, la elección de los anticuerpos y el hardware y el software del microscopio de fluorescencia.
La influencia del ciclo celular en pa…
The authors have nothing to disclose.
El proyecto fue apoyado por la Fundación alemana José Carreras de leucemia (14 DJCLS R/2017).
RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
Cytospin device | |||
Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |