Summary
Denne studien etablerer en eksperimentell modell av ren lite fiber nevropati med resiniferatoxin (RTX). En unik dose RTX (50 µg/kg) er optimal for å utvikle en liten fiber nevropati modell som etterligner pasienten egenskaper og kunne hjelpe undersøke nociceptive molekylær betydning underliggende nevropatisk smerte.
Abstract
Pasienter med diabetes mellitus (DM) eller de opplever nevrotoksiske effekter av chemotherapeutic agenter kan utvikle følelsen lidelser degenerasjon og skade av liten diameter sensoriske neurons, kalt lite fiber nevropati. Nåværende dyr modeller av små fiber nevropati påvirker både store og små-diameter sensoriske fiber og dermed skape en neuropathology kompleks til riktig vurdere virkningene av skadde liten diameter sensoriske fiber. Derfor er det nødvendig å utvikle en eksperimentell modell av ren lite fiber nevropati tilstrekkelig undersøke disse spørsmålene. Denne protokollen beskriver en eksperimentell modell av små fiber nevropati påvirker spesielt liten diameter sensoriske nerve med resiniferatoxin (RTX), en ultrapotent Agonistiske forbigående reseptor potensielle vanilloid type 1 (TRPV1), gjennom en enkelt dose intraperitoneal injeksjon, kalt RTX nevropati. Denne RTX nevropati viste patologisk manifestasjoner og atferdsmessige abnormiteter som etterligner klinisk karakteristikkene av pasienter med lite fiber nevropati, inkludert intraepidermal nerve fiber (IENF) degenerasjon, spesielt skade i liten diameter neurons, og induksjon av termisk hypoalgesia og mekanisk allodynia. Denne protokollen testet tre doser av RTX (200, 50 og 10 µg/kg, henholdsvis) og konkluderte med en kritisk dose RTX (50 µg/kg) er nødvendig for utvikling av typiske små fiber nevropati manifestasjoner, og utarbeidet en modifisert immunostai-prosedyre for å undersøke IENF degenerasjon og neuronal soma skade. Endret prosedyren er rask, systematisk og økonomisk. Atferdsproblemer vurdering av nevropatisk smerte er avgjørende å avsløre funksjonen av liten diameter sensoriske nerver. Evalueringen av mekanisk terskler i eksperimentell gnagere er spesielt utfordrende og denne protokollen beskriver en tilpasset metallnett som passer for denne typen vurdering i gnagere. Oppsummert er RTX nevropati nye og lett etablerte eksperimentell modell å evaluere molekylær betydning og intervensjon underliggende nevropatisk smerte for utvikling av terapeutiske agenter.
Introduction
Lite fiber nevropati involverer nevropatisk smerten, som det fremgår av degenerering av IENFs, er vanlig i ulike forhold, som DM, og som et resultat av nevrotoksiske effekter av chemotherapeutic agenter1,2, 3,4,5. IENFs er de eksterne terminalene av liten diameter neurons i dorsal root Ganglion (DRG), og berøres parallelt i tilfeller av IENF degenerasjon6. For eksempel har endret oppstrøms genetisk transkripsjon av neuronal somata blitt demonstrert av oppregulering av aktivere transkripsjon faktor-3 (ATF3)6,7. Videre er evaluering av IENFs gir med huden biopsi nyttig for diagnosen lite fiber nevropati5,8,9. Tradisjonelt har profiler av IENFs på huden biopsi avhengig immunohistochemical demonstrasjon av protein gene produktet 9.5 (PGP 9,5)1,10,11. Samlet patologisk profiler av DRG og IENFs gjenspeiler funksjonelle tilstanden underliggende lite fiber nevropati og kan være en indikator for funksjonell konsekvensene av denne typen nevropati på liten diameter neurons.
Tidligere har flere eksperimentelle modeller adressert spørsmålet om IENF degenerasjon i tilfeller av kjemoterapi-indusert nevropati12,13 og nerve skader forårsaket av komprimering eller transection14,15 , 16. disse eksperimentelle modeller også påvirket stor-diameter nerver; Det var derfor, det er ikke mulig å ekskludere bidrag av berørte stor-diameter nerver i den observerte lite fiber nevropati; undersøkelse av thermosensation lidelse av skadelige uttak avhenger for eksempel funksjonelle motor nerve fiber17,18,19. Dermed er etablere en ren lite fiber nevropati modell og systematisk undersøke statusen patologisk neuronal somata og deres eksterne cutaneous nerve fiber i tynne neurons nødvendig og avgjørende.
RTX er en capsaicin analog og en potent Agonistiske å forbigående reseptor potensielle vanilloid reseptor 1 (TRPV1), som formidler nociceptive behandling20,21,22. Nylig perifere RTX behandling lettet neurogenic smerte23,24,25 og en intraganglionic injeksjon av RTX indusert irreversibel tap av DRG neurons22. Effekten av eksterne RTX administrasjon er doseavhengig20,26,27, som resulterte i forbigående desensitization eller degenerasjon av IENFs. Intriguingly, systematisk høydose RTX behandling førte til nevropatisk smerte28, et symptom på små fiber nevropati. Disse funnene tyder på at behandling modus og dose RTX produsere forskjellige patologisk effekter og neuronal svar; nemlig, ekstern administrasjon forhindret smerte overføring av lokale effekter29 og påvirket de neuronal somata som utviklet nevropatisk atferd6. Samlet viser disse funnene at RTX har en multipotency effekt og reist spørsmålet om det er en bestemt dose RTX som systematisk kan påvirke eksterne nervene, som eksterne IENFs og sentrale neuronal somata. I så fall kan RTX være en potensiell agent spesielt påvirker liten diameter nevroner og etterligne små fiber nevropati i klinikken. For eksempel er DM i klinikken en komplisert sak inkludert stoffskiftesykdom og neuropathology av eksterne nerver, som er sammensatt av små fiber nevropati. Mekanismer for DM-assosiert lite fiber nevropati kunne ikke utelukke bidrag av stoffskiftesykdom som ikke kanskje er den viktigste agenten påvirker perifere nerver. Derfor krever DM-assosiert lite fiber nevropati en ren dyr modell som kan utelukke effekten av systematisk stoffskiftesykdom. Denne protokollen beskriver arbeider dosen av RTX å utvikle en typisk liten fiber nevropati modellen, inkludert IENF degenerasjon og tynne Nevron skade, som demonstrert av endrede immunostai-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle fremgangsmåtene er etiske retningslinjer for laboratoriet dyr30protokollen er godkjent av dyr komiteen av Kaohsiung medisinsk universitetet, Spikkestad, Norge.
1. etablering av RTX nevropati
Forsiktig: RTX er neurotoxic og farlig. Kontakt fungerer det som en irriterende for øyne, slimhinner, og øvre luftveier. Unngå innånding og ha lab briller og frakker under RTX forberedelse. Skyll med rikelig med vann ved hudkontakt eller etter håndtering.
- Legge til 1 mg RTX pulver i en 200 µL av blanding av like volum i Tween 80 og absolutt etanol (100 µL for hver løsemiddel).
- Aliquot RTX løsningen (12 µL/medisinglass) og lagre på 20 ° C, for inntil 3 måneder. Dette utgjør RTX aksjen; forkaste gjenværende RTX løsningen ved utløp.
- Fortynne RTX aksjen med vanlig saltvann til et endelig antall 600 µL. Siste konsentrasjonen av RTX løsningen skal 0,01%, som tilsvarer 1 µg RTX i 10 µL kjøretøy løsningen.
- Bruke 8-uke-gamle voksne mannlige ICR mus (35-40 g) som eksperimentelle dyr og administrere en enkelt dose av RTX løsning (dose: 200, 50 og 10 µg/kg, henholdsvis) intraperitoneally (IP) med en microinjection sprøyte til mus. Mus var anesthetized av inhalator med 5% isoflurane for dyp anestesi. Hvis mus viste uttak handlinger i ekstremitetene under RTX injeksjon, bør mus ta lengre innånding av anestesi.
Eksempel: Hvis musen veier 40 g, så det vil motta 20 µL av RTX løsningen, som representerer dosen av 50 µg/kg. - Gi en gruppe mus en lik mengde kjøretøy (10% Tween 80 og 10% absolutt etanol i saltvann), som en kontroll.
- Etter RTX injeksjon, kan du returnere mus å en plast bur på en 12-h lys/12-h mørke syklus og gi mat og vann ad libitum.
2. evaluering av nevropatisk atferd
Merk: Opprettholde dyrene i et komfortabelt miljø (trinn 1.6) som tillater gjenoppretting etter injeksjon. På dag 7 innlegg RTX injeksjon (D7) utfører hvert dyr kokeplate og von Frey hår filament testene på samme dag til redusere tidsforskjell og fremme effektiviteten av atferdsmessige testene. Ta dyrene i et stille rom som vedlikeholdes på en stabil luftfuktighet (40%) og temperatur (27 ° C) for optimalisering dyr Akklimatisering og redusere miljøkonsekvensene under atferdsmessige testing. Ikke forstyrr dyrene test perioder; atferdsmessige testene er planlagt ukentlig.
- Måling av termisk latencies med kokeplate test
- Plassere dyret forsiktig på en varm metallplate (27 cm x 29 cm) med en gjennomsiktig PLEXIGLASS bur (Lengde × bredde × høyde: 22 cm x 22 cm × 25 cm; Figur 1A). Angi temperaturen på varme metallplaten til 52 ° C.
- Start måling varigheten av dyrets termisk ventetid på kokeplate med trinn-, innebygd timer av kokeplate når dyr hindpaws touch kokeplate og observere svarene på dyr hindpaws. Hvis dyret viser rister, licking av hindpaws, eller hoppe på kokeplate, fjerne den og registrerer varigheten som dyret forble på kokeplate. Denne varighet definerer termisk ventetiden på en individuell dyr. Registrere termisk ventetid til nærmeste 0,1 s.
- For hver test økt, utføre tre forsøk med 30 minutters intervaller for svar normalisering etter siste kokeplate testen. Hvis dyret viser ingen respons på kokeplate, stoppe økten etter 25 s å unngå potensiell skade på vev.
- Måling av mekanisk terskelen med von Frey hår filament teste
- Sette dyret på den tilpassede metallnett (maske størrelse: 5 mm × 5 mm) med et halvt gjennomsiktige sylinder plexiglass bur (diameter: 13 cm, høyde: 12 cm) (figur 1B) for Akklimatisering minst 2 h.
- Bruke forskjellige kalibre av von Frey hår filamenter plantar regionen hindpaw med de opp metode31. Starte første søknad fra midten styrke av von Frey hår filamenter varighet filament anvendelse av 5-8 s.
- Bruk et 2 min intervall mellom filament programmer for å optimalisere dyr normalisering. Endre anvendt filament kraft basert på dyrets siste svar.
Merk: Et sett med von Frey hår filamenter består av 0.064, 0.085, 0.145, 0,32, 0,39, 1.1 og 1,7 g force søknad. For eksempel hvis hindpaw uttak oppstod med en første kraft 0.32 g, deretter bruke 0.145 g. I fravær av pote uttak brukes deretter en 0.39 g-kraft. Deretter fire ekstra filamenter av varierende styrker brukes basert på de forrige svarene og mekanisk terskelen beregnes en publisert formel31. - For hver test økt, Inkluder den bilaterale hindpaws. Utføre tre forsøk for hver hindpaw. Uttrykke gjennomsnittet av disse seks mekanisk terskler som mener mekanisk terskelen (mg) hvert dyr.
Figur 1. Skreddersydd plexiglass bur og metall maske for vurdering av nevropatisk smerte i musemodell av resiniferatoxin (RTX)-indusert lite fiber nevropati. (A, B) Disse grafene viser utstyret brukes til å måle (A) den termiske latencies av en varm metallplate (27 cm x 29 cm) med en gjennomsiktig PLEXIGLASS bur (Lengde × bredde × høyde: 22 cm x 22 cm × 25 cm) og evaluere (B) mekanisk terskelen av en tilpasset meta l mesh (maske størrelse: 5 mm × 5 mm) med et halvt gjennomsiktige sylinder plexiglass bur (diameter: 13 cm, høyde: 12 cm) i mus med RTX-indusert lite fiber nevropati. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. skin biopsi forberedelse og evaluering av IENFs gir
- Etter atferd testing, bedøve dyrene med 5% isoflurane og ofre dyr av intracardiac perfusjon med 0.1 M fosfatbuffer (PB) (pH 7.4) etterfulgt av 4% paraformaldehyde (4P) i 0.1 M PB.
- Cut første footpads av de to hindpaws etter perfusjon og post fixate dem i 4 P for en annen 6 h. overføring footpad vevet til 0.1 M PB 4 ° c for langtidslagring.
- Cryoprotect Skosåler med 30% sukrose i PB over natten og skåret i vertikale til plantar overflaten måte i 30-µm tykke skiver. Etiketten footpad deler sekvensielt, og deretter lagre i frostvæske på 20 ° C.
Merk: Frostvæske sammensetningen er som følger: destillert vann, etylen glyserol, glyserol og 2 x PB i 3:3:3:1 forholdet. - For å sikre tilstrekkelig prøvetaking, velger du hver tredje delen av footpad.
- Sette delene valgte footpad på tonet glass lysbilder og air-dry dem.
- Dekk en plast coverplate på lysbildet og prosessen med standard immunostai-prosedyrer.
- Slukke footpad avsnittene med 1% H2O2 i metanol i 30 min og blokkere med 0,5% nonfat tørr melk og 0,1% Triton X-100 0,5 M Tris buffer (Tris) 1t.
- Inkuber footpad seksjoner med antisera mot pan axonal markør, PGP 9.5 (oppvokst i kanin, 1:1, 000), overnatting på 4 ° C.
- Ruge footpad deler med et biotinylated geit anti-kanin IgG sekundære antistoff ved romtemperatur (RT) 1t, og deretter ruge med avidin-biotin komplekset på RT i 45 minutter.
- Visualisere reaksjon produktet med 0,05% 3, 3-diaminobenzidine (DAB) løsning for 45 s. Deretter vaske footpad seksjoner med destillert vann og air-dry dem for montering.
Merk: De primære og sekundære antisera er fortynnet med 0,5% nonfat tørr melk i 0,5 M Tris.
4. DRG delen forberedelse og evaluering av skadde liten diameter nerveceller
- Dissekere den 4th og 5th lumbale DRG og etter-posisjonsavlesning for en annen 2 timer.
- Cryoprotect DRG vev med 30% sukrose i PB over natten og kuttet til en 8-µm tykkelse sekvensielt, plassere på objektglass og etikett. Lagre DRG delene i-80 ° C fryser.
- Immunostain DRG inndelinger i 80 µm-intervaller å sikre tilstrekkelig prøvetaking.
- Utføre DRG immunostai-prosedyrer som delene footpad, bortsett fra dobbel-merking immunofluorescent prosedyrer. Alternativt, inkluderer ATF3 (oppvokst i kanin, 1: 100), en skade markør, og peripherin (oppvokst i mus, 1:800), en liten diameter neuronal markør i de primære antisera.
- Inkuber DRG deler med blanding av primære antisera overnatting på 4 ° C.
- Inkuber DRG seksjoner med enten Texas rød eller fluorescein isothiocyanate (FITC)-konjugert sekundære antisera (1:200), tilsvarer de aktuelle primære antisera på RT 1t, og deretter montere for kvantifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver en ny musemodell RTX nevropati, som påvirker spesielt liten diameter neurons, inkludert IENF degenerasjon, tilknyttet sensoriske forstyrrelser (figur 2). Etter protokoll beskrevet her, utstilt dyr termisk hypoalgesia og mekaniske allodynia på D7 innlegget RTX injeksjon. Å etablere denne lite fiber nevropati modellen, tre doser av RTX: 200, 50 og 10 µg/kg var administrert av IP ruten. RTX dosen (50 µg/kg) ble ansett som kritisk og innledende studien viste at høydose RTX (200 µg/kg) forårsaket høy musen dødelighet (Figur 3).
Figur 2. Ordningen av musemodell av resiniferatoxin (RTX)-indusert lite fiber nevropati. Ordningen viser protokollen for etablerte RTX-indusert lite fiber nevropati. For systematisk vurdering, atferd evaluering og neuropathological eksamen inkludert den kokeplate og von Frey tester, og dobbel-merket immunostai-studier, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Dose-effekten av resiniferatoxin (RTX) på dyr dødelighet og atferdsmessige dysfunksjon. (A) mangfoldig doser av RTX ble administrert av intraperitoneal (IP) injeksjon. Lethality av dose effekten var doseavhengig; for eksempel en høy dose av RTX (200 µg/kg) forårsaket 100% dødelighet. (B, C) Termisk latencies og mekanisk terskler ble evaluert med kokeplate (B) og von Frey filament tester (C), henholdsvis. En 50 µg/kg dose RTX indusert termisk hypoalgesia og mekanisk allodynia sammenlignet med bilen og 10 µg/kg-administrert gruppen. Åpne kvadrat kjøretøy; Åpne sirkel, 50 µg/kg; Åpne diamant, 10 µg/kg. Stiplet linje med (B), cutoff punkt kokeplate test. p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Patologisk, var det IENF degenerasjon og merket ATF3 induksjon. Dobbel-merking studier viste at skadet neurons var spesielt peripherin(+) liten diameter neurons. I kontrast, lav-dose av RTX (10 µg/kg) ikke innsatte lite fiber nevropati, inkludert endringer i IENF gir (Figur 4) og ingen neuronal skade (ATF3 induksjon) (figur 5). Derfor vurderer denne protokollen 50 µg/kg dosen kritisk å etablere musemodell av små fiber nevropati.
I sammendraget påvirket systematisk RTX administrasjon med en 50 µg/kg dose spesielt liten nerve fibre. For eksempel førte det til nevronale soma skade og eksterne IENF degenerasjon, som er assosiert med sensoriske forstyrrelser.
Figur 4. Degenerasjon av intraepidermal nerve fiber (IENFs) i resiniferatoxin (RTX) nevropati. (A-C) Vev delene fra footpad huden av mus var immunostained med anti-protein gene produktet 9.5 (PGP 9,5) antisera i bilen (en), 50 µg/kg-(B), og 10 µg/kg-administrert (C) grupper. PGP 9.5(+) IENFs oppstår fra subepidermal nerve plexus med en typisk varicose utseende. PGP 9.5 (+) IENFs redusert markant i 50 µg/kg, men ikke i gruppen 10 µg/kg. (D) IENFs ble quantitated ifølge immunohistochemical resultatene av Vekselstrøm. Åpne kvadrat kjøretøy; Åpne sirkel, 50 µg/kg; Åpne diamant, 10 µg/kg. p < 0,001 sammenlignet med gruppen kjøretøy. Skala bar, 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Spesifisitet av liten diameter Nevron skade i resiniferatoxin (RTX) nevropati. (A-C) Dobbel-merking immunofluorescent flekker ble utført med anti-aktivering transkripsjon faktor-3 (ATF3; Vekselstrøm, i grønt) og peripherin (Vekselstrøm, i rødt) i bilen (A), 50 µg/kg-(B), og 10 µg/kg-administrert (C) grupper. (D) diagrammet angir tetthet endringer av ATF3(+) neurons. ATF3(+) neurons økte i de 50 µg/kg, men ikke i bilen og 10 µg/kg grupper. Åpne kvadrat kjøretøy; Åpne sirkel, 50 µg/kg; Åpne diamant, 10 µg/kg. p < 0,001 sammenlignet med gruppen kjøretøy. Skala bar, 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv behandling av små fiber nevropati i klinikken er nødvendig for å fremme funksjonelle utvinning og livskvalitet pasienter. Foreløpig er det mangel på en terapeutisk guide målretting sensoriske lidelse forbundet med lite fiber nevropati skyldes mangel på omfattende forståelse av molekylære mekanismer underliggende liten diameter neuronal skade. Tidligere modeller av neuropathy påvirkes vanligvis både store og små-diameter sensoriske nerver; for eksempel modeller av kjemoterapi-indusert nevropati12,32,33 og mekanisk-indusert nevropati34,35. Dermed kan bidrag av motor svakhet og stor-diameter sensoriske nerveskader ikke være helt utelukket i atferdsdata testing av modellene nevropati. Nåværende protokollen beskriver en ny modell av små fiber nevropati i mus, som påvirker bare liten diameter sensoriske nerve ved å gi patologiske og funksjonelle bevis av IENFs degenerasjon.
RTX er en ultrapotent Agonistiske TRPV1 og en capsaicin analog, som kan forårsake tap av peptidergic DRG nerveceller i kultur36 og i vivo systemer18,19. Tidligere studier på RTX og capsaicin har hovedsakelig fokusert på morfologiske eller funksjonelle tap av DRG neuronal cellen legemer, som viste rollen TRPV1 i termisk overføring svar37,38,39. Dessuten, en tidligere studie vist systematisk høydose RTX behandling (200 µg/kg) i rotter, indusert mekanisk allodynia og termisk hypoalgesia, muligens på grunn av patologi av stor-diameter nervefibre28. Dosen av 200 µg/kg, derimot, er en dødelig dose i mus og denne gjeldende protokollen utviklet en ren lite fiber nevropati modell ved å redusere RTX dosen (50 µg/kg). Denne dose RTX (50 µg/kg) er avgjørende for å etablere en ren lite fiber nevropati modell, som er bedre enn den tidligere rapporterte28, som det deler store fiber18. Dvs påvirker det bare små nervefibre; nemlig, ble bare liten diameter neurons skadet, som bekreftes av induksjon av ATF3 oppregulering6,40 på liten diameter DRG neurons og IENFs degenerasjon6,18,19 ,41, knyttet sensoriske lidelser. Disse patologisk manifestasjoner etterligne omfattende kliniske symptomene på små fiber nevropati. Videre denne dagens modell indusert i typisk neuropathology og nevropatisk smerte profil lite fiber nevropati og effekten varte for 8 uker innlegget RTX behandling6,18,19. Varighetene for neuropathology og nevropatisk smerte var tilsvarende og kunne reverseres ved å fremme syntese av nerve vekst faktor (NGF)18,40,41. Kollektivt denne protokollen både etablert en ren lite fiber nevropati modell og markerte mulig terapeutiske potensialet for NGF.
Klinisk, er gullstandarden for å undersøke neuropathies påvirker liten diameter nociceptive nerver8,9 biopsying lem hud for å vurdere huden gir. Våre gjeldende rapport brukt denne teknikken footpad huden av forsøksdyr å vurdere huden gir en liten fiber nevropati modell som kunne gjengi patologi IENFs i klinikken, og også undersøkt morfologiske profiler av DRG deler med skade markøren, ATF3, å avsløre patologisk status for neuronal somata. Spesielt, romlig distribusjonen av IENFs i epidermis er svært forgrening og opptellingskriteriene er hovedfaktoren fører til statistisk forskjeller mellom grupper. For eksempel regnet våre nåværende protokollen hver IENF med forgrening poeng bare i dermis og IENFs med forgrening poeng i overhuden som en enkelt IENF14,18,19. Dette kriteriet kan ha forårsaket lavere tetthet av IENFs i våre undersøkelser enn i de andre grupper. Vi forberedt og behandlet huden og DRG deler av forsøksdyr på en systematisk og bulk-evaluering måte med våre nåværende endret protokollen. Følgelig kunne disse systematisk undersøkelser av IENF degenerasjon og neuronal skade unngå stereological skjevhet av funksjonelle og patologiske forhold av liten diameter nerveceller i små fiber nevropati.
Funksjonell evalueringen av liten diameter nerver med opptreden brukes testing, spesielt med innoxious von Frey hår filament program, tradisjonelt på pasientens hud for diagnostisering av mekaniske følsomhet underliggende lite fiber Nevropati. Observasjon av mekaniske allodynia i forsøksdyr er utfordrende på grunn av foten jording på metallnett, som anses å være eksogene mekanisk stimulering, og dyrene er svært aktiv under tester. Gjeldende protokollen optimert en bestemt størrelse mesh wire gulvet (5 mm × 5 mm) i et delvis gjennomsiktig plast bur for miljømessige tilpasning av forsøksdyr for atferdsdata tester. Denne størrelsen på mesh gulvet kan redusere eksogene stimulering av foten jording og unngå fot-slippe.
Denne RTX musemodell nevropati kan brukes til forskjellige typer lite fiber nevropati, slik som diabetes, som er forbundet med IENF degenerasjon1,42. Men fortsatt denne modellen begrenset. For eksempel kan dyr modell av spinal nerve ligation43 med karakteristikker av små fiber nevropati, kalles radikulopati i klinikken, påvirke stor fibrene i spinal rootlet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi (106-2320-B-037-024), Kaohsiung medisinske universitet (KMU-M106028, KMU-S105034) og målet for topp universiteter stipend (TP105PR15), Kaohsiung medisinske universitet, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
- Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
- Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
- Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
- Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
- Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
- Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
- Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
- Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
- Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
- Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
- Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
- Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
- Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
- Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
- Neubert, J. K., et al.
- Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
- Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
- Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Jr Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), table of contents 1253-1258 (2002).
- Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
- Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
- Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
- Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
- Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
- Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
- Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
- Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
- Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
- Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
- Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
- Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
