Summary
Ectopically manifestámos NR1 subunidade do receptor NMDA marcado com proteína verde fluorescente em células embrionárias humanas (HEK293) como antígeno para detectar anticorpos contra o receptor NMDA no sangue de pacientes suspeitado com encefalite auto-imune. Este método simples pode ser adequado para fins em situações clínicas de triagem.
Abstract
A presença de auto-anticorpos de anti-NMDA receptor pode causar vários sintomas neuropsiquiátricos nos pacientes afetados, denominados encefalite auto-imune do anti-NMDA receptor. Detecção dos auto-anticorpos específicos contra o receptor NMDA no sangue ou no líquido cerebrospinal (CSF) é essencial para o diagnóstico preciso desta condição. O receptor NMDA é um íon canaleta complexo proteico que contém quatro subunidades, incluindo dois subunidade obrigatória de receptores NMDA 1 (NR1) e um ou dois receptores NMDA 2A subunidade (NR2A), 2B de subunidade do receptor NMDA (NR2B), subunidade do receptor NMDA 2C (NR2C), ou o receptor NMDA subunidade 2D (NR2D). O epítopo de auto-anticorpos de receptor NMDA-anti foi relatado para estar presentes no domínio N-terminal extracelular de NR1 subunidade do receptor NMDA. O objetivo deste estudo é desenvolver um ensaio de imunofluorescência baseada em célula simples que pode ser usado como um teste de triagem para detectar a presença de auto-anticorpos contra NR1 subunidade do receptor NMDA no sangue para facilitar a pesquisa clínica e básica de encefalite auto-imune do receptor NMDA-anti.
Introduction
Anti-NMDA receptor auto-imune encefalite é uma entidade de doença recentemente reconhecidas que pode ocorrer em pacientes de todas as idades e afeta predominantemente feminino pacientes1,2. É um da encefalite mais frequentemente diagnosticada entre os pacientes com etiologia desconhecida inicial de encefalite3. Pacientes afetados com encefalite do receptor NMDA anti geralmente têm sintomas prodrômicos de uma dor de cabeça ou febre, seguida pelo rápido desenvolvimento de mudança de nível de consciência e de uma variedade de sintomas neuropsiquiátricos agudas, incluindo agitação, irritabilidade , ansiedade, insônia, alucinações, delírios, agressividade, comportamentos bizarros, anormalidades do movimento, desregulação autonômica e apreensão ataca4,5. Reconhecimento precoce desta condição e tratamento atempado com imunoterapia são importantes para um resultado melhor e até completa recuperação em doentes afectados6. Portanto, sugere-se que a encefalite auto-imune do anti-NMDA receptor deve ser considerada como um importante diagnóstico diferencial de pacientes que apresentam com características psicóticas agudas ou novo-início7,8.
Além de características clínicas, a detecção de auto-anticorpos contra os receptores NMDA no sangue ou CSF é essencial para o diagnóstico preciso de anti-NMDA receptor encefalite auto-imune9. A maioria dos testes imunológicos para detectar os auto-anticorpos de receptor NMDA anti estão disponíveis em algumas pesquisa laboratórios10,11, e há apenas um ensaio de imunofluorescência baseada em célula comercialmente disponível para rastreio do anti-NMDA receptor auto-anticorpos12. O objetivo deste estudo é desenvolver um ensaio imunofluorescência de baseada em célula interna simples que pode ser convenientemente usado em laboratório para a tela a presença de auto-anticorpos de receptor NMDA anti para facilitar a pesquisa clínica do receptor NMDA anti encefalite auto-imune. O receptor NMDA é um heterotetramer íon canaleta complexo proteico especificamente expressado no cérebro. É feito de duas subunidades de NR1 obrigatórias e a combinação de uma ou duas subunidades de NR2A e NR2B, NR2C, NR2D13. Um estudo anterior relatou que o principal epítopo alvejado de anticorpos estava no domínio N-terminal extracelular do NR1 subunidade5. Daí, neste protocolo, podemos expressar a proteína NR1-subunidade recombinante humana do receptor NMDA com proteína verde fluorescente (GFP) na linha de células epiteliais de rim embrionário humano (HEK293) e desenvolver um ensaio imunofluorescência baseados em células para detectar a classe IgG de auto-anticorpos de receptor NMDA anti no sangue.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital em Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).
1. preparação do plasmídeo de expressão a NR1-GFP
- Mix 10 ng de plasmídeo NR1-GFP com 100 µ l de estirpe de células competentes de Escherichia coli DH5α em uma estéril 1,5 mL centrifugar o tubo, pipetar a mistura suavemente até e para baixo 4 - 6 vezes e incubar o tubo no gelo por 20 min.
- Incubar o tubo a 42 ° C por 1 min em um banho de água, retire o tubo do banho, adicionar 1 mL de meio de caldo de carne (LB) lisogenia no tubo e incubar o tubo a 37 ° C numa incubadora com agitação por 1h.
- A propagação de 50 µ l da mistura em uma placa de ágar LB contendo ampicilina (0,1 mg/mL) e incubar a placa de ágar LB a 37 ° C numa incubadora durante a noite.
- Escolher uma única colônia da placa de ágar LB durante a noite usando uma ponteira estéril, e agite a ponta em um em um tubo de cultura bacteriana contendo 5 mL de meio LB e ampicilina (0,1 mg/mL). Incube o tubo a 37 ° C numa incubadora com agitação durante a noite.
- Alíquota 3 mL de cultura bacteriana durante a noite para um balão de 500 mL que contém 250 mL de meio de LB estéril e ampicilina (0,1 mg/mL). Incube o frasco a 37 ° C, com agitação. Verifique regularmente se a densidade óptica (OD) da cultura bacteriana no comprimento de onda de 600 nm, utilizando um espectrômetro até o OD600 atinge 0,6-1,0.
Nota: Misture bem 800 µ l de cultura bacteriana durante a noite com 200 glicerol µ l para preparar o estoque de glicerol e armazenar o estoque de glicerol sob a-80 ° C para uso futuro. - Preparar o plasmídeo de expressão NR1-GFP da cultura bacteriana 250ml
- Coletar as células por centrifugação a 6.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.
- Ressuspender as bactérias em 10 mL de tampão de ressuspensão contendo RNase A; vórtice completamente até que nenhum grupo é visto.
- Adicionar 10 mL de tampão de lise da suspensão bacteriana, delicadamente inverter a mistura 4 - 6 vezes e incubar o lisado em temperatura ambiente (RT) por 5 min.
- Adicionar 10 mL de tampão de precipitação pre-refrigerados para o lisado, inverta suavemente a mistura 4 - 6 vezes.
- Despeje o lisado para o barril de um cartucho de filtro com a tampa Espere por 10 min a RT
- Retire a tampa do bocal de saída do cartucho, insira o cartucho de um atuador e pressione suavemente o êmbolo. Recolher o filtrado lisado em um tubo de 50 mL.
- Adicionar 2,5 mL proprietárias buffer do fabricante para o filtrado lisado, misture a mistura por inversão do tubo cerca de 10 vezes e incubar a mistura no gelo por 30 min.
- Aplique a mistura de lisado filtrada para uma coluna de filtro que foi previamente incubada com 10 mL de tampão de equilibração. Permita que a coluna de drenagem por gravidade.
- Lavar a coluna com 30 mL de tampão de lavagem duas vezes e, em seguida, Eluir o DNA da coluna usando 15 mL de tampão de eluição.
- Adicionar o isopropanol 10,5 mL (0,7 volumes) para o buffer de DNA eluted, misture bem e centrifugar a mistura a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C.
- Decante o sobrenadante cuidadosamente, lavar o sedimento de DNA com 5 mL de etanol a 70% livre de endotoxina, uma vez e centrifugar a 20.000 x g durante 10 minutos.
- Decante o sobrenadante, secar a pelota por 5-10 min numa vizinhança de química e dissolva a pelota em 300-500 µ l de buffer livre de endotoxinas.
- Determine a concentração de plasmídeo medindo-se a absorção da solução no UV 260/280 nm, utilizando um espectrofotômetro.
Nota: Prepare o plasmídeo de expressão usando o mesmo protocolo GFP.
2. transfecção de células HEK293 com plasmídeo de expressão NR1-GFP
- Alíquota 200 µ l de solução de 2% de gelatina para cada um bem de uma placa de cultura de 48-bem e incubar a placa a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
- Aspire a solução de gelatina das células de 5 x 104 HEK293 bem e sementes em 200 µ l de meio de cultura celular contendo 10% soro bovino fetal (FBS) em cada poço. Incube a placa a 37 ° C numa incubadora umidificado fornecido com 5% CO2 durante a noite.
Nota: As células foram contadas usando um hemocytometer. - No dia seguinte, substituir o gasto médio de cultura com 200 µ l de meio de cultura fresco contendo 10% FBS por bem.
- Para cada único bem, preparar solução A misturando 100 ng do plasmídeo NR1-tGFP com 20 µ l meio de cultura e a solução B pelo reagente de transfeccao 0,8 µ l de mistura com meio de cultura 20 µ l. Multiplique o número de poços necessários para preparar o volume total para cada experimento.
- Preparar a solução C, misturando a solução A e a solução B e incubar a mistura a RT para 20-30 min.
- Alíquota 40 μL de solução C para cada bem que contém as células HEK293, agitar suavemente o frasco a placa e incubar a placa a 37 ° C numa incubadora umidificado fornecido com 5% CO2 durante a noite.
- Verifique a expressão da proteína recombinante de NR1-GFP nas células hospedeiras microscópio fluorescente com ampliação de X-200 X 40 (excitação/emissão: 482/502 nm) e proceder ao ensaio de imunofluorescência baseada em célula.
Nota: Transfect o plasmídeo de expressão GFP nas células HEK293 usando o mesmo protocolo.
3. ensaio de imunofluorescência cell-based
- Aspire o gasto médio dos poços, Então lave cada poço com 200 µ l de fosfato tamponado salino (PBS), três vezes.
- Adicionar 200 µ l de solução de paraformaldeído 4% a cada poço; incube a placa na RT por 15 min.
- Aspirar a solução de paraformaldeído dos poços e cada um Lave bem com 200 µ l de PBS três vezes.
- Adicionar 200 µ l de 10% de leite desnatado em PBST (0.1% Tween-20 em PBS) solução para cada bem e incube a placa na RT para 1 h com agitação suave.
- Aspirar o leite desnatado de 10% em solução PBST do poço e, em seguida, lavar os poços com 200 µ l de PBST uma vez.
- Incube os poços com plasma diluído (1: 100 em PBST) como o anticorpo primário com agitação suave em RT por 1h.
Nota: O Plasma é obtido de sangue de doentes com suspeita de ter encefalite auto-imune. - Aspire o plasma diluído dos poços e lavar cada bem com 200 µ l de PBST três vezes.
- Adicionar 200 µ l de anti-humana de cabra IgG conjugada com Alexa Fluor 594 (1:1, 000 diluição em PBST) a cada poço e incubar a placa de cultura em RT com agitação suave por 1h.
- Aspire o anti-humano de cabra IgG conjugada com Alexa Fluor 594 solução e cada um lavar bem com 200 µ l de PBST três vezes.
- Adicione solução de glicerol 100 µ l (50% de glicerol em PBS e de 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1: 100.000) para cada poço.
- Observar e as células sob um microscópio fluorescente usando um 10 X ocular e 4x, 10x e 20 X objetivos da imagem.
Nota: Utilize o filtro correto para cada tintura: para NR1-GFP (excitação/emissão = 482/502 nm), para Alexa Fluor 594 (excitação/emissão = 561/594 nm), para DAPI (excitação/emissão = 358/461 nm). Realizar o controle negativo usando as células HEK expressando GFP, da mesma forma.
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Representative Results
Em média, poderíamos obter 200-300 µ g plasmídeo de expressão livre de endotoxinas NR1-GFP e GFP de cultura bacteriana 250 mL, seguindo os procedimentos descritos na secção 1 do protocolo. Um montante de 100 ng/poço do plasmídeo a expressão foi usado para o transfection das células HEK293 cultivadas na placa de 48 conforme descrito na seção 2 do protocolo. 24-30 h após a transfeccao, as células expressaram a NR1-GFP, e proteínas recombinantes de GFP poderiam ser detectadas sob microscópio fluorescente. A figura 1A mostra a imagem de células hospedeiras que expressam a NR1-GFP, enquanto a Figura 1 mostra as células expressando GFP. O sinal verde pode ser usado como um controlador de qualidade do ensaio: aproximadamente 30% das células tinha os sinais verdes sob o microscópio fluorescente. Figura 1A e 1D mostram a imagem de células hospedeiras que expressam a NR1-GFP. O sinal verde pode ser usado como um controlador de qualidade do ensaio: aproximadamente 30% das células tinha os sinais verdes sob o microscópio fluorescente. As células expressando GFP-NR1 foram usadas para a seleção a presença de auto-anticorpos de receptor NMDA anti da amostra de plasma humano.
No ensaio de imunofluorescência baseada em célula conforme descrito na seção 3 do protocolo, o positivo controle amostra (obtido de uma fonte comercial, consulte Tabela de materiais) foi adicionado ao plasma pool em 01:10 diluição de acordo com o instruções do fabricante. O pool de plasma foi preparado a partir de 5 adultos machos e 5 fêmeas adultas. Figura 1B é a Alexa Fluor-594 imagem de amostra do controlo positivo após incubação com a expressão de células GFP-NR1, enquanto Figura 1E é a Alexa Fluor-594 imagem de amostra do controlo positivo após incubação com a expressão de células GFP. Figura 1 é a imagem mesclada de figura 1A e figura 1B: existem sobreposições significativas de sinais verdes e vermelhos sinais na mesma cela, indicando a localização co do NR1-GFP e os anticorpos contra o subunit NR1 de NMDA receptor (setas). Se sobrepõe a uma amostra de plasma que mostra maior que 30% de verde e vermelhos sinais serão interpretados como positivo neste caso. Figura 1F é a imagem mesclada da Figura 1 e Figura 1E que serve como o controle negativo para a Figura 1. A cor vermelha fraca é fluorescência de plano de fundo da imagem Alexa Fluor-594. Há pouca sobreposição dos sinais verdes e vermelhos, não indicando nenhuma ligação de auto-anticorpos de receptor a anti-NMDA contra a proteína recombinante.
Durante o estabelecimento dos procedimentos experimentais, observou-se uma baixa relação sinal-ruído da imagem Alexa Fluor-594 quando as amostras de plasma foram testadas. Procurou-se otimizar a relação sinal-ruído através da realização de uma diluição serial do plasma forma 01:10, 01:50, 1: 100, e 1: 200 e testando diferentes concentrações de Alex Fluor-594 etiquetados anticorpo secundário de 1: 500 a 1:2, 000. Encontramos essa diluição de 1: 100 de diluição plasma e 1:1,000 ou 1:2,000 o Alexa Fluor-594 foram as condições ideais para a interpretação dos dados.
Figura 1: imagens representativas do ensaio imunofluorescência baseados em células para detectar anticorpos do receptor NMDA anti. Imagem do (A) das células HEK293 que expressam NR1-GFP. (B) a Alexa Fluor-594 imagem retirada o mesmo campo de A após a incubação com a amostra de controle positivo. Sinal vermelho indica a ligação dos auto-anticorpos anti receptor NMDA-anti para o NR1 expressado nas células HEK293. (C) a imagem mesclada de A e B. Cor amarela indica a localização co do NR1 (sinal verde) e os auto-anticorpos de receptor NMDA-anti (sinal vermelho). As setas indicam exemplos de algumas células proeminentes, mostrando a localização co de NR1-GFP e anti-NMDA auto-anticorpos do receptor. (D) imagem do HEK293 células expressando GFP-NR1. (E) a Alexa Fluor-594 imagem retirada o mesmo campo de D após incubação com a amostra de controle positivo. Sinal vermelho fraco indica o ruído de fundo da imagem de Alexa Fluor-594. (F) a imagem mesclada de D e E. Esta imagem serve como um controle negativo, como há pouco amarelo sinal observado. A imagem de controlo negativo mostra a vinculação específica do anti-NMDA anticorpos do receptor para o NR1-GFP no ensaio. Todas as imagens foram tiradas de menos de 10 X olho lente e objectivo de lente X 20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem vários ensaios imunológicos cell-based para a tela a presença de auto-anticorpos contra o receptor NMDA relatados na literatura, incluindo imunofluorescência baseada em célula viva do ensaio11, fixada ensaio imunofluorescência baseada em célula9 , e baseados em citometria de fluxo do ensaio14. O ensaio de imunofluorescência baseada em célula ao vivo deve ser realizado logo após a preparação de células ectopically, expressando a proteína NR1, enquanto o ensaio baseados em citometria de fluxo requer equipamentos especiais e pessoal treinado. Um ensaio de imunofluorescência fixo baseados em células é um ensaio mais conveniente que pode ser conduzido para situações clínicas. Assim, muitos estudos utilizados o ensaio imunofluorescência baseada em célula comercial indireto fixo para auto-anticorpos de receptor NMDA anti tela no soro e CSF espécimes12,15. O kit utilizado (ver a tabela de materiais) contém as células HEK293 fixas que ectopically expressam a subunidade recombinante de NR1 do receptor NMDA. O ensaio foi avaliado para ter um desempenho excelente na detecção do anticorpo de IgG anti-NMDA receptor no soro e CSF espécimes12. Em nosso protocolo, usamos a mesma abordagem que o recomendado pelo fabricante do kit, exceto que nós usamos o plasmídeo de expressão NR1-GFP. A proteína GFP-NR1 pode ser usada para monitorar a eficiência do transfection e distribuição da proteína NR1 em cada experimento. Portanto, ele pode ser usado como uma garantia de qualidade do ensaio.
A eficiência da transfecção do plasmídeo de expressão NR1-GFP nas células HEK293 é aproximadamente 30% no protocolo apresentado aqui, que é suficiente para o ensaio de imunofluorescência. No entanto, encontramos que a intensidade da fluorescência verde não é distribuída uniformemente entre as células transfectadas, sugerindo diferenças na eficiência da capacidade de transfeccao ou expressão de células individuais. Os diferentes níveis de expressão de recombinação NR1-GFP em células diferentes causam heterogênea intensidade quando a imagem verde fundiu-se com a imagem vermelha de Alexa Fluor 594. O anti-humano de cabra IgG conjugada com Alexa Fluor 594 foi usado como o anticorpo secundário para detectar a presença de auto-anticorpos humano classe IgG. Nós achamos que o brilho da Alexa Fluor 594 é relativamente mais fraco do que da proteína verde fluorescente. Nós tentamos otimizar a intensidade do sinal, aumentando a concentração do anti-humano IgG conjugada com Alex Fluor 594, no entanto, o fundo aumentado também. Portanto, a concentração ideal para o ser anti-humano IgG conjugada com Alex Fluor 594 é 1:1,000 neste laboratório. Além disso, algumas amostras de plasma tinham um fundo significativamente elevado sinal na imagem Alexa Fluor 594. Foram testadas diferentes diluições do plasma, e verificou-se que uma diluição mínima de 1: 100 é necessária obter um fundo limpo para a maioria das amostras. Portanto, recomendamos a diluição de 1: 100 de plasma como padrão passo no presente protocolo. Em comparação com os outros ensaios cell-based que podem detectar a amostra de soro em 01:10 e 01:20 diluição da amostra de sangue11,16, este protocolo atual não tem suficiente sensibilidade para a detecção de auto-anticorpos de receptor NMDA anti baixo título, o que é uma limitação do protocolo.
O protocolo atual é um ensaio imunofluorescência fixa baseada em célula. A placa de cultura pode ser armazenada na geladeira de 4 ° C, após a fixação, para uso posterior até 1 mês, em comparação com o ensaio ao vivo baseados em células que não pode ser armazenado por um longo tempo. No entanto, a proteína NR1 irá desnaturar e perder sua conformação natural durante o procedimento de fixação, que pode afetar a conformação do epítopo que vincula os auto-anticorpos de receptor NMDA-anti. Daí, alguns estudos adoptada ao vivo baseados em células immunofluorescene11,17. Nosso protocolo pode ser modificado como alternativa para tornar-se um ensaio de imunofluorescência baseados em células vivas de preservar a conformação natural da proteína NR1, se incubar a amostra de plasma com as células vivas, primeiro e consertar as células mais tarde. Portanto, há flexibilidade no protocolo para atender a necessidade do experimento.
O receptor NMDA é uma proteína complexa heterotetramer consistindo de NR1, NR2A, NR2B, NR2C e NR2D. O protocolo atual foi projetado para detectar classe IgG de auto-anticorpos contra NR1 subunidade do receptor NMDA. O protocolo também pode ser modificado para detectar diferentes isotipos de auto-anticorpos, enquanto anticorpos IgG anti-humano secundários são substituídos por outra classe específica de anticorpos secundários. Além disso, o atual protocolo pode ser modificado para detectar a presença de auto-anticorpos contra NR2A e NR2B, NR2C, NR2D, se o plasmídeo de expressão NR1-GFP é substituído com o plasmídeo de expressão correspondente, respectivamente.
Neste protocolo, usamos uma amostra de plasma em vez de soro, porque nós rotineiramente coletar amostra de sangue com anticoagulante para diversos fins de estudo, mas o protocolo pode aplicar soro ou amostras de fluido Cerebrospinal. O título de anticorpos no plasma pode ser quantificado pelo serial diluição da amostra. No laboratório, também testamos a linha de fibroblasto-como celular de rim de macaco verde africano (COS1) como as células hospedeiras, usando o mesmo protocolo. Os resultados são os mesmos como aqueles que usam as células HEK293, exceto que as células COS1 têm uma eficiência de transfeccao ligeiramente menor do que as células HEK293.
Para verificar a presença de auto-anticorpos de receptor a anti-NMDA, sugere-se que experimentos adicionais tais como imuno-histoquímica do ensaio usando tecidos cerebrais de roedores e imunocitoquímica usando primário roedores cultivadas neurônios ser executada5 ,9. Portanto, o protocolo atual só pode ser considerado como um ensaio de triagem. Embora sua validade experimental foi verificada usando a amostra de controlo positivo neste estudo, a sensibilidade e a especificidade deste teste em ambientes clínicos devem ser estabelecidas no futuro estude.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação médica do Chang Gung (o número de concessão CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 e CMRPG3E0633).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
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