Summary
Hemos expresado ectopically subunidad NR1 del receptor NMDA etiquetada con proteína verde fluorescente en células embrionarias humanas (HEK293) como antígeno para detectar autoanticuerpos contra el receptor de NMDA en la sangre de pacientes con encefalitis autoinmune. Este sencillo método puede ser adecuado para la detección de propósitos en contextos clínicos.
Abstract
La presencia de anti-NMDA receptores autoanticuerpo puede causar diversos síntomas neuropsiquiátricos en los pacientes afectados, denominados encefalitis anti-NMDA autoinmune. Detección de los autoanticuerpos específicos contra el receptor NMDA en la sangre o líquido cefalorraquídeo (LCR) es esencial para la diagnosis exacta de esta condición. El receptor NMDA es un ion canal complejo de la proteína que contiene cuatro subunidades, incluyendo dos obligatorio NMDA receptor subunidad 1 (NR1) y uno o dos receptores NMDA 2A subunidad (NR2A), NMDA receptor la subunidad 2B (NR2B) subunidad del receptor NMDA 2C (NR2C), o del receptor NMDA subunidad 2D (NR2D). El epitopo del autoanticuerpo de anti-NMDA receptor se informó a estar presente en el dominio N-terminal extracelular de la subunidad NR1 del receptor NMDA. El objetivo de este estudio es desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia celular simple que puede utilizarse como una prueba de cribado para detectar la presencia de autoanticuerpos contra la subunidad NR1 del receptor NMDA en la sangre para facilitar la investigación clínica y básica de encefalitis autoinmune anti-NMDA.
Introduction
Encefalitis anti-NMDA autoinmune es una entidad nuevamente reconocida de enfermedad que puede ocurrir en pacientes de todas las edades y afecta a pacientes predominantemente femenino1,2. Es una de la encefalitis más frecuentemente diagnosticada entre los pacientes con etiología desconocida inicial de encefalitis3. Los pacientes afectados con encefalitis anti-NMDA generalmente tienen síntomas prodrómicos de fiebre, seguida por el desarrollo rápido de cambio de nivel de conciencia y una variedad de síntomas neuropsiquiátricos agudos, como agitación, irritabilidad o dolor de cabeza , ataques de ansiedad, insomnio, alucinaciones, delirios, agresividad, comportamientos extraños, anormalidades de movimiento, dysregulation autonómico y asimiento4,5. Reconocimiento temprano de esta condición y el tratamiento oportuno con inmunoterapia son importantes para un mejor resultado y recuperación completa incluso en los pacientes afectados6. Por lo tanto, se sugiere que la encefalitis anti-NMDA autoinmune se debe considerar como un importante diagnóstico diferencial de pacientes que presentan con características psicóticas agudas o del nuevo-inicio7,8.
Además de las características clínicas, la detección de autoanticuerpos contra el receptor NMDA en la sangre o el CSF es esencial para la diagnosis exacta de anti-NMDA receptor encefalitis autoinmune9. La mayoría de las pruebas inmunológicas para detectar el autoanticuerpo del receptor anti-NMDA está disponible en algunos laboratorios de investigación10,11, y hay solamente un análisis de la inmunofluorescencia celular comercialmente disponibles para la detección del anti-NMDA receptores autoanticuerpos12. El objetivo de este estudio es desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia de celular interna simple que puede ser utilizado convenientemente en el laboratorio para detectar la presencia de anti-NMDA receptores autoanticuerpos para facilitar la investigación clínica del receptor anti-NMDA encefalitis autoinmune. El receptor NMDA es un heterotetrámero ion canal complejo de la proteína expresado específicamente en el cerebro. Se hace de dos subunidades NR1 obligatorias y la combinación de una o dos subunidades de NR2A, NR2B, NR2C o NR2D13. Un estudio informó que el epitopo principal blanco de los anticuerpos fue en el dominio N-terminal extracelular de la subunidad NR1 del5. Por lo tanto, en este protocolo, expresa la proteína recombinante humana de la subunidad NR1 del receptor NMDA con proteína verde fluorescente (GFP) en la línea de células epiteliales de riñón embrionario humano (HEK293) la etiqueta de y desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia basadas en células para detectar la clase IgG de autoanticuerpos del receptor de anti-NMDA en la sangre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El estudio fue aprobado por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital en Linkuo, Taoyuan, Taiwán (102-2577A3).
1. preparación del plásmido de expresión de GFP NR1
- Mezcla 10 ng de plásmido NR1-GFP con 100 μl de cepa de células competentes de Escherichia coli DH5α de 1,5 mL estéril y centrifugar el tubo, pipetear la mezcla suavemente hasta 4 - 6 veces e incubar el tubo en hielo por 20 min.
- Incubar el tubo a 42 ° C por 1 min en un baño de agua, retire el tubo del baño María, añada 1 mL Lisogenia caldo (LB) medio en el tubo e incubar el tubo a 37 º C en una incubadora con agitación durante 1 hora.
- 50 μl de la mezcla en una placa de agar LB con ampicilina (0,1 mg/mL) se difundió e incubar la placa de agar LB a 37 ° C en una incubadora durante una noche.
- Escoger una sola Colonia de la placa de agar LB durante la noche mediante una punta estéril y agitar la punta en un en un tubo de cultivo bacteriano que contiene 5 mL de medio LB y ampicilina (0,1 mg/mL). Incubar el tubo a 37 º C en una incubadora con agitación durante la noche.
- Alícuota 3 mL del cultivo bacteriano durante la noche en un matraz de 500 mL que contiene 250 mL estéril LB medio y ampicilina (0,1 mg/mL). Incube el frasco a 37 ° C con agitación. Compruebe regularmente la densidad óptica (OD) de la cultura bacteriana en la longitud de onda de 600 nm, utilizando un espectrómetro hasta la OD600 0.6-1.0.
Nota: Mezcle bien 800 μl de la cultura bacteriana durante la noche con 200 glicerol μL para preparar el stock de glicerol y almacenar el stock de glicerol debajo de-80 ° C para su uso futuro. - Preparación de plásmido de expresión de GFP NR1 de la cultura bacteriana de 250 mL
- Recoger las células por centrifugación a 6.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado de las bacterias en buffer de resuspensión de 10 mL conteniendo Rnasa A; vórtice completamente hasta que no se ven grumos.
- Añadir 10 mL de tampón de lisis a la suspensión bacteriana, suavemente invierta la mezcla 4 - 6 veces e incubar el lisado a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos.
- Añadir 10 mL de tampón de precipitación previamente enfriada a lisado, invierta suavemente la mezcla 4 - 6 veces.
- Vierta el lisado en el cañón de un cartucho de filtro con la tapa esperar 10 min a TA.
- Quite la tapa de la boquilla de salida del cartucho, inserte un émbolo del cartucho y empuje suavemente el émbolo. Recoger el filtrado lisado en un tubo de 50 mL.
- Añadir 2,5 mL propiedad tampón del fabricante para el filtrado lisado, mezcle la mezcla invirtiendo el tubo aproximadamente 10 veces e incubar la mezcla en hielo durante 30 minutos.
- Aplique la mezcla filtrada de lisado a una columna de filtro que fue previamente equilibrada con 10 mL de tampón de equilibrado. Deje que la columna de desagüe por gravedad.
- Lavar la columna con tampón de lavado 30 mL dos veces y luego eluir el ADN de la columna con 15 mL de tampón de elución.
- Agregar isopropanol de 10,5 mL (0,7 volúmenes) en el búfer de ADN eluído, mezclar bien y centrifugar la mezcla a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C.
- Decantar cuidadosamente el sobrenadante y lavar el pellet de ADN con etanol al de 70% libre de endotoxina 5 mL una vez, Centrifugue a 20.000 x g durante 10 minutos.
- Decantar el sobrenadante y secar el pellet por 5-10 min en una campana química, disolver el pellet en 300-500 μl de tampón libre de endotoxinas.
- Determinar la concentración de plásmido mediante la medición de la absorción de la solución en UV 260/280 nm usando un espectrofotómetro.
Nota: Prepare el plásmido de expresión de GFP utilizando el mismo protocolo.
2. transfección de células HEK293 con el plásmido de expresión de GFP NR1
- Alícuota 200 μL de solución 2% de gelatina a cada pozo de una placa de 48 pozos cultura e incubar la placa a 37 ° C durante al menos 30 minutos.
- Aspire la solución de gelatina de las células 5 x 104 HEK293 bien y semillas en 200 μL de medio de cultivo celular que contenga 10% suero bovino fetal (FBS) en cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora humidificada provista de 5% CO2 durante la noche.
Nota: Las células se cuentan usando un hemocitómetro. - Al día siguiente, reemplazar el gastado medio de cultivo con 200 μL de medio de cultivo fresco que contiene 10% FBS por pozo.
- Para cada individual, preparar solución A mezclando 100 ng de plásmido tGFP NR1 con 20 μl de medio de cultivo y B una solución mezclando 0,8 μl de reactivo de transfección con 20 μl de medio de cultivo. Multiplique al número de pozos necesarios para preparar el volumen total para cada experimento.
- Preparar la solución C por mezclar solución A y solución B e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 minutos.
- Alícuota de 40 μl de la solución C a cada bien que contiene las células HEK293, agitar la placa suavemente e incubar la placa a 37 ° C en una incubadora humidificada provista de 5% CO2 durante la noche.
- Comprobar la expresión de proteína recombinante NR1-GFP en las células hospedadoras bajo microscopio con 40 aumentos X-200 de fluorescencia (excitación/emisión: 482/502 nm) y proceder a lo análisis de la inmunofluorescencia celular.
Nota: Transfectar el plásmido de expresión GFP en las células HEK293, usando el mismo protocolo.
3. Análisis de la inmunofluorescencia basadas en células
- Aspire el medio gastado de los pozos, luego lave cada pocillo con 200 μL de fosfato tampón salino (PBS) tres veces.
- Añadir 200 μL de solución de paraformaldehído al 4% a cada pocillo; Incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Aspirar la solución de paraformaldehído de los pozos y lave cada bien con 200 μL de PBS tres veces.
- Añadir 200 μL de 10% de leche descremada en SAFT (0,1% Tween-20 en PBS) solución a cada pozo, incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 h con agitación suave.
- Aspirar el 10% de leche descremada en la solución de SAFT desde el pozo, luego lavar los pocillos con 200 μL de SAFT una vez.
- Incube los pocillos con plasma diluido (1: 100 en SAFT) como el anticuerpo primario con agitación suave a temperatura ambiente durante 1 hora.
Nota: El Plasma se obtiene de la sangre de pacientes sospechados para tener encefalitis autoinmune. - Aspire el plasma diluido de los pozos y lave cada bien con 200 μL de SAFT tres veces.
- Añadir 200 μL de antihumano de cabra IgG conjugado con Alexa Fluor 594 (1:1, 000 dilución en SAFT) a cada pocillo e incubar la placa de cultivo a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 hora.
- Aspirar el antihumano de cabra IgG conjugado con Alexa Fluor 594 solución y lavar cada pozo con 200 μL de SAFT tres veces.
- Añadir 100 μl solución de glicerol (glicerol al 50% en PBS y 1: 100.000 de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) a cada pocillo.
- Observar y las células bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un 10 X ocular y 4 X, 10 X y 20 X objetivos de imagen.
Nota: Utilizar el filtro correcto para cada tinte: para NR1-GFP (excitación/emisión = 482/502 nanómetro), para Alexa Fluor 594 (excitación/emisión = 561/594 nm), para DAPI (excitación/emisión = 358/461 nm). Realizar el control negativo utilizando las células HEK expresan la GFP de la misma manera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En promedio, podríamos obtener 200-300 μg plásmido de expresión libre de endotoxina NR1-GFP y GFP de cultivo bacteriano 250 mL siguiendo los procedimientos descritos en la sección 1 del protocolo. Una cantidad de 100 ng/pozo del plásmido de expresión se utilizó para la transfección de las células HEK293, cultivado en la placa de 48 pozos, como se describe en la sección 2 del protocolo. 24-30 h después de la transfección, las células expresan el NR1-GFP y se pudieran detectar proteínas recombinantes GFP bajo microscopio de fluorescencia. Figura 1A se muestra la imagen de las células hospedadoras que expresan la GFP NR1, mientras que la figura 1 muestra las células expresando GFP. La señal verde puede ser utilizada como un controlador de calidad de la prueba: aproximadamente el 30% de las células tenían las señales verdes bajo el microscopio de fluorescencia. Figura 1A y 1D muestran la imagen de las células hospedadoras que expresan la GFP NR1. La señal verde puede ser utilizada como un controlador de calidad de la prueba: aproximadamente el 30% de las células tenían las señales verdes bajo el microscopio de fluorescencia. Las células que expresan GFP NR1 fueron utilizadas para la detección de la presencia de anti-NMDA receptores autoanticuerpos en la muestra de plasma humano.
En el análisis de la inmunofluorescencia de células como se describe en la sección 3 del Protocolo, el positivo control de muestra (obtenida de una fuente comercial, véase Tabla de materiales) fue añadida al plasma combinado en 1:10 dilución según el instrucciones del fabricante. El plasma combinado fue preparado de 5 machos y 5 hembras. Figura 1B es la imagen de Alexa Fluor-594 de la muestra control positivo después de la incubación con la expresión de células NR1-GFP, mientras Figura 1E es la imagen de Alexa Fluor-594 de la muestra control positivo después de la incubación con la expresión de células GFP. Figura 1 es la imagen fusionada de la figura 1A y figura 1B: hay traslapos significativos de señales verdes y rojas en la misma célula, indicando la co-localización de NR1-GFP y los anticuerpos contra la subunidad NR1 del NMDA receptor (flechas). Una muestra de plasma que muestra mayor que 30% se superpone de verde y rojo señales se interpretan como positivos en este caso. Figura 1F es la imagen fusionada de la figura 1 y Figura 1E que sirve como control negativo para la figura 1. El color rojo débil es fluorescencia del fondo de la imagen de Alexa Fluor-594. Hay poca superposición de señales verdes y rojas, indicando que no hay Unión de los autoanticuerpos del receptor anti-NMDA contra la proteína recombinante.
Durante el establecimiento de los procedimientos experimentales, se observó un cociente signal-to-noise bajo de la imagen de Alexa Fluor-594 cuando analizaron las muestras de plasma. Intentamos optimizar la relación señal a ruido mediante la realización de una dilución seriada de la plasma forma 1:10, 1:50, 1: 100 y 1: 200 y prueba diferentes concentraciones de Alex Fluor-594 etiquetan anticuerpo secundario de 1: 500 a 1:2, 000. Encontramos esa dilución 1: 100 de la dilución de plasma y 1:1,000 o 1:2,000 de Alexa Fluor-594 eran las condiciones óptimas para la interpretación de los datos.
Figura 1: imágenes representativas de lo análisis de la inmunofluorescencia basadas en células para detectar autoanticuerpos del receptor de NMDA anti. Imagen de (A) de las células HEK293 que expresan GFP NR1. (B) la Alexa Fluor-594 imagen tomada desde el mismo campo de A después de la incubación con la muestra control positivo. Señal roja indica la fijación de los autoanticuerpos del receptor anti-NMDA NR1 expresado en las células HEK293. (C) la imagen combinada de A y B. Color amarillo indica la co-localización de los NR1 (señal verde) y el anti-NMDA receptores autoanticuerpos (señal roja). Las flechas indican los ejemplos de algunas células prominentes mostrando la localización de NR1-GFP y anti-NMDA autoanticuerpos del receptor. (D) imagen de la HEK293 células expresando NR1-GFP. (E) la Alexa Fluor-594 imagen tomada desde el mismo campo de D después de la incubación con la muestra control positivo. Débil señal roja indica que el ruido de fondo de imagen de Alexa Fluor-594. (F) la imagen combinada de D y E. Esta imagen sirve como un control negativo, ya que hay poco amarillo señal observada. La imagen de control negativo muestra a la unión específica de lo anti-NMDA los anticuerpos del receptor a la NR1-GFP en el ensayo. Todas las imágenes fueron tomadas bajo 10 X ojo lente y objetivo de lente 20 X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hay varios ensayos inmunológicos celulares para detectar la presencia de autoanticuerpos contra el receptor NMDA, divulgado en la literatura, incluyendo inmunofluorescencia celular vivo ensayo11, fijada de análisis de la inmunofluorescencia celular9 , y basados en la citometría de flujo ensayo14. El análisis de la inmunofluorescencia celular vivo debe realizarse poco después de la preparación de las células ectopically expresaban la proteína NR1, mientras que el análisis basado en la citometría de flujo requiere personal capacitado y equipos especiales. Un análisis de la inmunofluorescencia celular fijo es un ensayo más conveniente que puede llevar a cabo ajustes clínicos. Por lo tanto, muchos estudios utilizan el análisis de la inmunofluorescencia celular fija indirecta comercial al autoanticuerpo de receptores anti-NMDA de pantalla en suero y CSF muestras12,15. El kit utilizado (véase la tabla de materiales) contiene las células HEK293 fijadas que expresan ectópicamente la recombinante subunidad NR1 del receptor NMDA. El ensayo se ha evaluado para tener excelente rendimiento en la detección de los anticuerpos anti-NMDA receptor IgG en el suero y CSF muestras12. En nuestro protocolo, utilizamos el mismo criterio como recomendado por el fabricante del kit, excepto que utilizamos el plásmido de expresión de GFP NR1. La proteína GFP NR1 puede utilizarse para monitorear la eficiencia de transfección y la distribución de la proteína NR1 en cada experimento. Por lo tanto, puede utilizarse como un aseguramiento de la calidad del ensayo.
La eficiencia de la transfección del plásmido de expresión de GFP NR1 en las células HEK293 es aproximadamente 30% en el protocolo presentado aquí, que es suficiente para el análisis de la inmunofluorescencia. Sin embargo, encontramos que la intensidad de la fluorescencia verde no se distribuye uniformemente entre las células transfected, sugiriendo diferencias en eficiencia de transfección o expresión de la capacidad de células individuales. Los diferentes niveles de expresión de recombinante NR1-GFP en células diferentes causan intensidad heterogénea cuando la imagen verde se fusionó con la imagen roja de Alexa Fluor 594. El antihumano de cabra que IgG conjugado con Alexa Fluor 594 fue utilizado como el anticuerpo secundario para detectar la presencia de autoanticuerpos humanos clase IgG. Se encontró que el brillo de Alexa Fluor 594 es relativamente más débil que la de la proteína fluorescente verde. Intentamos optimizar la intensidad de la señal aumentando la concentración de anti humano que IgG conjugado con Alex 594 de Fluor, sin embargo, el fondo también. Por lo tanto, la concentración óptima para el ser anti-humano IgG conjugado con Alex Fluor 594 es 1:1,000 en este laboratorio. También, algunas muestras de plasma tenían un fondo significativamente alto señal en la imagen de Alexa Fluor 594. Se probaron diferentes diluciones de plasma, y se encontró que la dilución mínima de 1: 100 es necesaria para obtener un fondo limpio para la mayoría de las muestras. Por lo tanto, se recomienda dilución de 1: 100 del plasma como el paso estándar en este protocolo. En comparación con los otros ensayos basadas en células que pueden detectar la muestra de suero en dilución 1:10 y 1:20 de sangre muestra11,16, este protocolo actual no tiene suficiente sensibilidad para detectar autoanticuerpos en título bajo anti-NMDA receptor, que es una limitación del protocolo.
El protocolo actual es un ensayo de inmunofluorescencia celular fijo. La placa de cultivo se puede almacenar en frigorífico de 4 º C después de la fijación para su uso posterior durante 1 mes, en comparación con el ensayo vivo basadas en células que no se puede almacenar durante mucho tiempo. Sin embargo, la proteína NR1 se desnaturaliza y pierde su natural conformación durante el procedimiento de fijación, que puede afectar la conformación del epitopo que se une a los autoanticuerpos del receptor anti-NMDA. Por lo tanto, algunos estudios adoptaron en immunofluorescene celular11,17. Nuestro protocolo puede modificarse también para convertirse en un análisis de la inmunofluorescencia celular vivo para preservar la conformación natural de la proteína NR1, si incuban primero la muestra de plasma con las células vivas y fijar las células más adelante. Así, hay flexibilidad en el protocolo para satisfacer la necesidad del experimento.
El receptor NMDA es una proteína compleja heterotetrámero compuesto por NR1, NR2A, NR2B, NR2C y NR2D. El protocolo actual fue diseñado para detectar la clase de IgG del autoanticuerpo contra la subunidad NR1 del receptor NMDA. El protocolo también puede modificarse para detectar diferentes isotipos de autoanticuerpos, como anticuerpos secundarios contra IgG son substituidos por la otra clase específica de anticuerpos secundarios. Además, el protocolo actual puede ser modificado para detectar la presencia de autoanticuerpos contra NR2A, NR2B, NR2C y NR2D, si el plásmido de expresión de GFP de NR1 es reemplazado con el plásmido de expresión correspondiente, respectivamente.
En este protocolo, se utilizó a una muestra de plasma en lugar de suero, porque habitualmente recogemos muestra de sangre con anticoagulante para los varios propósitos de estudio, pero el protocolo se puede aplicar a suero o muestras de LCR. El título de los autoanticuerpos en el plasma puede cuantificarse por dilución seriada de la muestra. En el laboratorio, también probamos la línea de fibroblasto-como de células de riñón de mono verde africano (COS1) como las células del anfitrión utilizando el mismo protocolo. Los resultados son los mismos que usando las células HEK293, excepto que las células COS1 tienen una eficacia de transfección ligeramente más baja que las células HEK293.
Para determinar la presencia de los autoanticuerpos del receptor anti-NMDA, se sugiere que experimentos adicionales tales como inmunohistoquímica ensayo utilizando tejidos de cerebro de roedor e inmunocitoquímica utilizando roedores cultivadas primario neuronas ser5 ,9. Por lo tanto, el protocolo actual sólo puede considerarse como un ensayo de investigación. Aunque su validez experimental se comprobó con la muestra control positivo en este estudio, la sensibilidad y especificidad de esta prueba en contextos clínicos necesitan establecerse en un futuro estudio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación médica de Chang Gung (número de licencia CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 y CMRPG3E0633).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
