Summary
Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.
Abstract
A célula externa do cabelo é um dos dois tipos de células sensoriais ciliadas da cóclea mamíferos. Eles alteram seu comprimento de células com o receptor do potencial para amplificar a vibração fraca do sinal de som de baixo nível. A morfologia e a propriedade eletrofisiológica de células ciliadas exteriores (OHCs) desenvolvem na idade pós-natal. A maturação da célula exterior de cabelo pode contribuir para o desenvolvimento do sistema auditivo. No entanto, o processo de desenvolvimento de OHCs não é bem estudado. Isto é parcialmente devido à dificuldade de medir sua função por uma abordagem eletrofisiológica. Com o objetivo de desenvolver um método simples para resolver o problema acima, aqui descrevemos um protocolo passo a passo para estudar a função do OHCs na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Com este método, podemos avaliar a resposta coclear aos estímulos de Tom puro e examinar o nível de expressão e a função da proteína motor prestin em OHCs. Esse método também pode ser usado para investigar as células ciliadas interiores (IHCs).
Introduction
Duas funções distintas coclear células sensoriais são essenciais para a audição dos mamíferos: transdução de mechanoelectric (MET) e electromotility1,2. Por canais MET localizados no pacote o cabelo, IHCs (IHCs) e OHCs converter som vibração em alterações do potencial de membrana, bem como os sinais elétricos dos neurônios do gânglio espiral inervado. OHCs alterar seu comprimento de células com o potencial de membrana e amplificam a vibração do som de baixo nível. Essa atividade denominada electromotility é derivada pelo motor proteína prestin localizado na parede lateral do OHCs3.
Em muitas espécies, incluindo roedores, a função auditiva é imatura na época início pós-natal4,5. Sem potencial de ação em resposta a sinais sonoros pode ser detectado no córtex auditivo antes do início de audiência6,7. Desenvolvimento da morfologia e função da cóclea tem sido amplamente estudadas em rato, rato e rato4,5,8. O mechanotransduction e electromotility de células ciliadas são também desenvolvidos no início da época de vida5.
A fim de avaliar a sensibilidade auditiva de ratos em diferentes idades pós-natal, nós desenvolvemos um método para auditivo de tronco encefálico (ABR) gravação em filhotes. Braçadeira do remendo de célula inteira é uma tecnologia ideal para investigar os OHCs electrophysiologically. No entanto, em comparação com a braçadeira do remendo realizada em neurônios e outras células epiteliais, a baixa taxa de selagem da célula inteira limitado a investigação de electromotility de OHCs isoladas.
Aqui descrevemos um procedimento para investigar os OHCs morfologicamente e electrophysiologically na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Esse método pode ser modificado para estudar os mecanismos moleculares que regulam a função e desenvolvimento celular interna do cabelo.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da universidade médica do Sul.
1. prepare soluções para experimentos
- Preparar o anestésico (ver Tabela de materiais): 1.5% pentobarbital de sódio dissolvido em ddH2O.
- Preparar a solução de dissecação (ver Tabela de materiais): dissolver um saco de pó de L-15 do Leiboviz em 1 L de DDQ2O. ajuste de pH para 7,3 com 1 M de NaOH. Ajuste a osmolaridade para 300-330 mOsm usando um aparelhos e 10 mM HEPES antes do uso.
- Dissolver 2 mg/mL colagenase IV (ver Tabela de materiais) em solução de dissecação, preparada na etapa 1.2.
- Preparar as soluções de imunocoloração (ver Tabela de materiais): dissolver o paraformaldeído 4% em salina tamponada fosfato (PBS).
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada. - Dilua o agente de permeabilidade de 0,3% em PBS. Dilua o soro de cabra normal de 10% em PBS como o tampão de bloqueio. Dilua a 1: 200 prestin anticorpo em tampão de bloqueio. Dilua o anticorpo conjugado Alexa488 1:600 em tampão de bloqueio. Dilua a 1: 200 B faloidina-diversos isotiocianato em PBS.
- Preparar a solução extracelular (ver Tabela de materiais): preparar o meio de L-15 a Leiboviz conforme descrito acima (etapa 1.2).
- Preparar a solução intracelular (ver Tabela de materiais).
2. gravação ABR
Nota: Gravação ABR foi previamente descrita em detalhe no nosso anterior estudo9.
- ANESTHETIZE ratos Sprague Dawley (SD) (filhotes de 1-14 dias de idade e adultos 2 - meses de idade, ambos os sexos) com uma única injeção de pentobarbital de sódio 1,5% (22 mg/kg para filhotes de cachorro e 30 mg/kg para adultos, intraperitoneal (i.p.)).
- Coloque o animal anestesiado em um molde de espuma de polietileno para imobilizar o corpo do animal. Coloque o animal em uma mesa de antivibração em uma sala de som-atenuantes. Manter a temperatura do corpo do animal a 37,5 ° C, com uma almofada de aquecimento.
- Limpe a área de cabeça com etanol a 70% (vol/vol). Usando uma tesoura bem, faça uma incisão de 1-2mm ventrolateral para o pavilhão auricular externo para colocar o eletrodo de referência ou o chão. Um eletrodo de agulha subdérmica (eletrodo de gravação) está localizado sobre o vértice do crânio (figura 1A).
- Usando o gerador de função, gerar explosões de Tom calibrado (1 ms subida/descida, planalto 3 ms) de várias frequências (2, 4, 8, 16, 24 e 32 kHz) e intensidades (diminuídas de 85 para 10 dB SPL na etapa 5 dB). Variar a frequência e a amplitude manualmente ou usando um computador. Entrega a estímulos sonoros através de um alto-falante eletrostático localizado a 10 cm de distância em direção a cabeça do animal.
- Filtro (100-1.000 Hz), amplificar e média (256 vezes) o som eliciado potencial usando um processador de multi-função para obter os ABRs. Os vestígios da ABR é monitorado on-line e armazenados para análise off-line. Demora cerca de 40 min para completar o ABR a gravação de um animal.
Nota: Normalmente, de três a sete picos (onda eu a onda VII) com latências inferior a 15 ms pode ser identificado (figura 1B). O limiar da ABR é definido como o nível mínimo de som no qual wave I e II pode ser detectado. - Eutanásia antes os animais acordou da anestesia (com a injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio 1,5% 0,3 mL).
3. a dissecação do órgão de Corti (OC)
- Filhotes de anestesiar. Para ratos menos de 6 dias de idade (< P6), manter o animal em um prato de cultura de 100 mm e cubra o prato com gelo por 10 min. Para ratos > P6, anestesiar o animal com uma única injeção de pentobarbital de sódio 1,5% (22 mg/kg, i.p.). Decapitar os filhotes de rato após a anestesia.
- Esterilize a cabeça pulverizando com etanol a 70% (vol/vol).
- Abrir o crânio ao longo da linha sagital mediana com tesoura; Remova o cérebro para expor o ouvido interno.
- Transferência da orelha interna em uma placa de Petri 35mm preenchido com 3 mL de gelado L-15 (Figura 2A).
- Sob o microscópio de dissecação, use pinça fina para remover a cápsula óssea da cóclea (Figura 2B).
- Desembrulhe o OC e associados do stria vascularis (SV) do modiolus.
- Mantendo a porção basal do SV com fórceps, separar o OC a SV completamente desenrolando lentamente da base-de-apex (Figura 2).
- Corte o OC uniformemente em três pedaços, usando uma tesoura fina (Figura 2D).
4. mancha da imunofluorescência
- Usando uma ponta de pipeta 200 µ l, transferir os segmentos de OC (passo 3.8) numa lâmina de vidro e fixar com 100 µ l de paraformaldeído 4% pelo menos 4 h a 4 ° C.
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada. - Lave o tecido deslocando o paraformaldeído com 100 µ l de PBS fresco. Lave o tecido três vezes por 10 min.
- Incube o tecido com agente de permeabilidade de 0,3% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
- Descartar o agente de permeabilidade em PBS e lave o tecido 3 vezes com PBS.
- Bloco com 10% de soro de cabra normal em PBS por 1h à temperatura ambiente.
- Incube com anticorpo anti-prestin-C-terminal (1: 200) no bloqueio solução para 2 h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.
- Lave tres vezes com PBS por 5 min.
- Incube com anticorpos secundarios conjugados a Alexa488 (1:600) em solução de bloqueio por 1h à temperatura ambiente no escuro.
- Lave tres vezes com PBS por 5 min no escuro.
- Incube com rodamina-faloidina (1: 200) por 10 min à temperatura ambiente no escuro.
- Lave tres vezes com PBS por 5 min no escuro.
- Montar sobre uma lâmina de vidro com meio de montagem (contendo DAPI). Imagem com microscopia confocal usando 405 nm, 488 nm e 594 nm de lasers. Definir a potência do laser em 0.1-0.5 mW e o scan velocidade no quadro/s 0.5.
5. braçadeira de Patch gravação de OHCs isolado
- Usar o extrator de pipeta e microfalsificador para fazer patch pipetas com um diâmetro de ponta 2-3 µm. Back-preencher as pipetas com solução intracelular. Geralmente, a resistência inicial da pipeta remendo foi MΩ 2.5-3.5 em solução de banho.
- Usando uma ponta de pipeta de 200 µ l, transferi uma parte do co (da etapa 3.8) em uma placa de Petri de 35mm. Digerir o tecido com 100 µ l de meio de digestão enzimática (colagenase IV, consulte Tabela de materiais) por 5 min à temperatura ambiente.
- Deslocar o meio da digestão enzimática com 100 µ l de L-15. Corte o tecido em pequenos pedaços, usando um micro bisturi para isolar as células capilares.
- Após suave pipetagem, transferir as células em uma câmara de plástico pequena caseira (diâmetro ~ 1,5 cm) preenchido com solução de banho livre de enzima (~ 1,5 mL, consulte Tabela de materiais).
- Coloque a câmara no palco de um microscópio invertido. Encontre os OHCs solitárias saudável-aparecendo.
- Carrega a pipeta de remendo para o palco principal de um amplificador de 700B. Mover a pipeta de remendo cuidadosamente por um micromanipulador e posicioná-lo em torno do fundo da célula exterior de cabelo (Figura 3A).
- Braçadeira do remendo de células inteiras o OHC selando a parede lateral do corpo celular. Aplique sucção leve até a membrana celular é rompida. Conjunto da exploração potencial em -70 mV. Células com resistência de acesso variou entre 10 e 17 MΩ e resistência de membrana variaram de 100 a 500 MΩ e são consideradas uma configuração bem sucedida de células inteiras.
- Usando o controle de computador, aplicar hiperpolarização e despolarizantes tensão (250 ms de duração e que variam de −140 a +94 mV em 13 passos de mV) para a célula para eliciar correntes de células inteiras.
- Amplificar as correntes de células inteiras, filtrar (frequência de canto de 5 kHz) por um amplificador de 700B. Converta os dados por um conversor de 1440A e loja para análise off-line.
- Medir a capacitância de membrana de OHCs usando um protocolo de estímulo dois da onda de seno-tensão controlado por um software de braçadeira do remendo. Definir a escala de tensão de estimular de-140 a 110 mV. Armazene os dados para análise off-line.
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Representative Results
ABR pode ser provocada de anestesiados filhotes mais velhos que o 7º dia pós-natal (P7) usando rajadas de Tom puro (figura 1A). Como mostrado na figura 1B, as formas de onda ABR obtidas de filhotes mostrou apenas três ou quatro ondas distintas com pequena amplitude. Normalmente, até sete picos foram observadas as formas de onda ABR de animais adultos (figura 1B).
Para seguir imunocoloração e medição eletrofisiológica, rato ouvido recentemente foi dissecado do osso temporal. Vamos mostrar as etapas consecutivas da dissecção do tecido para isolar o OC de SV e o modiolus (Figura 2A–2C). O OC foi cortado em três pedaços uniformemente com microtesoura (Figura 2D). Para mostrar a morfologia das células de cabelo, os segmentos foram corados com a faloidina, anticorpo prestin e DAPI (Figura 2E). Os feixes do cabelo (em vermelho) indicam a superfície apical das células de cabelo, Considerando que o corpo da célula das OHCs foi marcado por prestin (em verde). O núcleo foi rotulado por DAPI (em azul) localizado na região inferior da IHCs e OHCs. Como mostrado na Figura 2E, nenhum prestin foi detectada as OHCs da cóclea na P5. Prestin foi observado pela primeira vez no P7 em OHCs localizado na cóclea basal.
Após a digestão suave, os OHCs foram isoladas a partir do co (Figura 3A). Gravações de tensão-braçadeira de células inteiras foram realizadas entre OHCs aguda isoladas da cóclea rato. Um exemplo representativo da célula inteira corrente gravado a partir de um OHC P9 isolado em resposta ao potencial de membrana mudada de −140 para +107 mV é mostrado na Figura 3B. Por favor, note a região N-forma da curva I-V, indicando a presença de KCa atual que é uma resposta única da OHCs. Impulsionado pela tensão de membrana, o Cl intracelular– combinado com o prestin, aparecendo como uma capacitância de membrana não-linear (NLC) muda sob a modalidade de braçadeira do remendo de células inteiras. A NLC típico de um OHC maduro é caracterizado por campaniformes dependência do potencial de membrana. A NLC pode ser equipado com uma função de Boltzmann do dois-estado e pode refletir a função de electromotility de OHCs. A função de Boltzmann para encaixe de capacitância é descrita como:
A equação e os parâmetros que foram descritos em nosso anterior papel9. Dois representante NLCs são mostrados na Figura 3.
Figura 1. Gravação de resposta auditiva do tronco encefálico. (A), o eletrodo de gravação foi inserido no couro cabeludo entre duas orelhas. Eletrodos de referência e terra foram colocados sob o pavilhão auricular esquerdo e direito, respectivamente. Um alto-falante campo aberto foi colocada a 10 cm de distância da ponta nasal do rato. (B) dois representante ABR formas de onda em resposta a picos de Tom 16 kHz, 80 dB SPL. Rastreamento superior gravado desde filhote P8. Rastreamento de fundo gravado a partir de um rato adulto. Os números indicam os diferentes picos de ondas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A dissecação do órgão de Corti. (A) no ouvido interno dissecado de um filhote de rato P9. Da região vestibular e da cóclea são mostrados. (B) a estrutura da cóclea foi exposto após a remoção da parede óssea. (C), o órgão de Corti (OC) e do stria vascularis (SV) foram isoladas a partir do modiolus. (D) o órgão de Corti foi cortado uniformemente em três pedaços. Barras de escala em A-D representam 1.000 µm. (E) imagens Confocal mostrar as células capilares localizadas em diferentes segmentos (basais, médios e apicais) ao longo da cóclea. Rodamina-faloidina (vermelho) representa os pacotes de cabelo localizados na superfície apical das células de cabelo. DAPI (azul) representa os núcleos localizados na parte média-inferior de células ciliadas. O prestin (marcado em verde) só foi expressa na parede lateral das células de cabelo exteriores. Para os segmentos médios e basais no P7, somente o canal verde é mostrado para ilustrar a expressão de prestin em OHCs. Barra de escala representa 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Gravação de braçadeira de remendo de células inteiras de células isoladas de cabelo exteriores. (A) uma célula isolada de cabelo exterior foi selada no modo de células inteiras. Barra de escala representa 10 µm. (B) representante V curva gravado a partir de uma célula de cabelo exterior P9. Capacitância (C), a membrana não-linear (NLC) Obtida de duas células de cabelo exteriores em diferentes idades. As respostas de capacitância-tensão (círculos abertos) foram montadas para a função de Boltzmann (mostrada como as linhas espessas). A NLC foram normalizados para a capacitância linear correspondente (Clin). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em ratos mais jovens do que de dia 11, sem potencial de ação em resposta à estimulação sonora pode ser observada no córtex auditivo6,7. Portanto, dia pós-natal 11 é descrito como "início de audiência"10. O desenvolvimento da função auditiva antes de início da audiência não foi bem estudado ainda. Usando o método semelhante para a gravação de ABR adulta, demonstramos que ABRs poderiam ser provocados pela explosão de Tom puro de filhotes mais jovens que P11 (Figura 1). No entanto, as formas de onda ABR obtidas de filhotes mostraram algumas características diferentes dos animais adultos. As respostas ABR são pequenas em amplitude com limites relativamente altos. Este resultado implica que o sistema auditivo em desenvolvimento tem baixa sensibilidade para sinais sonoros. Diferença significativa foi observada nas formas de onda ABR gravadas a partir de filhotes. Normalmente, até sete picos foram observados em adultos de formas de onda ABR9. Estes picos com latência diferente são gerados pelos núcleos do tronco cerebral diferentes ao longo da via auditiva11. Nossos resultados indicam que apenas as ondas-IV foram detectáveis em ABR de filhotes de rato (figura 1B). As ondas I e II representam as respostas da cóclea e o nervo auditivo11. Portanto, os resultados indicam que os núcleos auditivos nível superiores não conseguiram responder a estímulos acústicos durante o desenvolvimento. Estes dados sugerem que maturidade funcional de alcance de cóclea mais cedo do que o sistema auditivo central. O método que descrevemos aqui é importante para o estudo dos mecanismos moleculares que regulam a função de desenvolvimento e cabelo célula cóclea.
Dissecação de alta qualidade de OC é fundamental para ainda mais experimentos incluindo imunocoloração, mancha ocidental e medição eletrofisiológica. Estes experimentos foram realizados utilizando ratos SD adultos e filhotes entre 1 e 14 dias de idade. Filhotes são ideais para dissecação bem como o osso coclear é macio e pode ser facilmente removido por fórceps sem danificar o OC. Para ratos adultos, atenção especial é necessária para evitar a ruptura do co ao remover a cápsula dura-ósseas. Usando a pinça fina, o OC e SV associado podem ser decolou do modiolus. O OC separados e SV tem textura diferente (Figura 2). Para filhotes, o OC pode ser cortado em três segmentos, com um comprimento de 800-1200 µm. Observe que todas as etapas devem ser executadas em L-15 gelada mais rápido possível para minimizar a degradação e deterioração do tecido.
Segmentos isolados da OC são bons preparativos para imunocoloração, mancha ocidental e análise de RNA. Aqui nós mostramos a morfologia das células sensoriais do cabelo OC por imunocoloração. OHCs tem pacotes de cabelo na sua superfície apical, Considerando que o núcleo tem os localizado basalmente12. O motor da proteína prestin é expressa na membrana lateral de OHCs. Os dados da imagem latente confocal indicam que o prestin primeiro foi expressa em P6-P7 e mostrou um aumento continuado ao longo da semana seguinte (Figura 2E). Em outras experiências, mancha ocidental e q-PCR foram realizadas para quantificar as alterações de nível de expressão observado da prestin durante o desenvolvimento (dados não mostrados). Porque as células capilares são a minoria em OC, cochleae de 6 a 10 é recomendados em uma única experiência para alcançar sinais robustos.
Para gravações de braçadeira do remendo de OHCs, leve digestão enzimática foi realizada para separar as OHCs. As células ciliadas são frágeis, e especial cuidado é necessário nesta etapa. Use uma ponta de pipeta de 200 µ l para transferir os tecidos e células separadas. O segmento isolado da OC foi transferido para uma gota de solução de colagenase (~ 100 µ l) em uma placa de Petri para cerca de 5 min à temperatura ambiente. Evite tempos de digestão longa, o que irão danificar a membrana da célula de OHCs. Sob o microscópio, OHCs aparência saudáveis foram selecionados para a gravação de braçadeira do remendo. Danificar as células mostrar sinais de encolhimento, inchaço, ou translocação do núcleo foram excluídos do próximo experimento. Saudável aparecendo solitária OHCs e IHCs são fáceis de identificar por sua diferença morfológica. OHCs mostrar uma forma cilíndrica e um rácio de eixo de diâmetro maior, Considerando que IHCs são em forma de balão com um pescoço apertado12. Braçadeira do remendo de células inteiras em OHCs é um pouco difícil daquelas em neurônios e outras células epiteliais. Para configuração de células inteiras bem sucedida, a pipeta de remendo localizava-se geralmente perto do núcleo, mantido longe da membrana lateral superior contendo uma elevada densidade de partículas prestin (Figura 3A). Depois que a membrana foi rompida, um protocolo de estímulo de tensão de onda senoidal dois foi aplicado à célula a fim de obter a capacitância de membrana de OHCs. Com a mesma técnica, por meio de medidas de tensão, é possível eliciar a célula inteira corrente.
Este método é uma boa ferramenta para investigar a função de electromotility de OHCs em vitro9,13. Esse método também pode ser usado para investigar a função dos canais iônicos, assim como as propriedades farmacológicas dos receptores em OHCs e IHCs14.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa 973 (2014CB943002) e o Nacional Natural Science Foundation da China (11534013, 31500841).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
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