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Neuroscience

श्रवण Brainstem प्रतिक्रिया और बाहरी बाल कोशिका पूरी सेल पैच दबाना जन्मोत्तर चूहों में रिकॉर्डिंग

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/56678
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 4, 1
1Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, 3Department of Laboratory Medicines, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Southern Medical University, 4Experiment Teaching Center, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University

Summary

इस प्रोटोकॉल जन्मोत्तर चूहा पिल्ले से श्रवण brainstem प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करने के लिए विधियों का वर्णन करता है । बाह्य बाल कोशिकाओं के कार्यात्मक विकास की जांच करने के लिए, पूरे सेल पैच दबाना की प्रयोगात्मक प्रक्रिया पृथक बाहरी बाल कोशिकाओं में रिकॉर्डिंग कदम दर कदम वर्णित है ।

Abstract

बाहरी बाल कोशिका स्तनधारी कोक्लीअ में दो प्रकार की संवेदी बाल कोशिकाओं में से एक है । वे कम स्तर ध्वनि संकेत के कमजोर कंपन बढ़ाना रिसेप्टर क्षमता के साथ अपने सेल की लंबाई में परिवर्तन । बाह्य बाल कोशिकाओं (OHCs) की आकृति विज्ञान और electrophysiological गुण जल्दी जन्मोत्तर उंर में विकसित । बाहरी बाल कोशिका की परिपक्वता अनुश्रवण प्रणाली के विकास में योगदान कर सकते हैं । हालांकि, OHCs विकास की प्रक्रिया अच्छी तरह से अध्ययन नहीं है । यह आंशिक रूप से क्योंकि कठिनाई के एक electrophysiological दृष्टिकोण से अपने कार्य को मापने के लिए है । इसके बाद के संस्करण के मुद्दे को संबोधित करने के लिए एक सरल विधि विकसित करने के उद्देश्य से, यहां हम जन्मोत्तर चूहों से तीव्र रूप से असंबद्ध कोक्लीअ में OHCs के समारोह का अध्ययन करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन. इस विधि के साथ, हम शुद्ध टोन उत्तेजनाओं के लिए कॉकलियर प्रतिक्रिया का मूल्यांकन और अभिव्यक्ति स्तर और OHCs में मोटर प्रोटीन prestin के समारोह की जांच कर सकते हैं । इस विधि का उपयोग भीतरी बाल कोशिकाओं (IHCs) की जांच के लिए भी किया जा सकता है ।

Introduction

कॉकलियर संवेदी बाल कोशिकाओं के दो अलग कार्य स्तनधारी सुनवाई के लिए आवश्यक हैं: mechanoelectric transduction (MET) और electromotility1,2. से मुलाकात की बाल बंडल में स्थित चैनलों, IHCs (IHCs) और OHCs झिल्ली संभावित परिवर्तन, साथ ही साथ innervated सर्पिल नाड़ीग्रंथि ंयूरॉंस के विद्युत संकेतों में ध्वनि कंपन परिवर्तित । OHCs झिल्ली क्षमता के साथ अपने सेल की लंबाई बदलने के लिए और कम स्तर ध्वनि के कंपन बढ़ाना । इस गतिविधि को electromotility ने मोटर प्रोटीन prestin OHCs3की पार्श्व दीवार में स्थित द्वारा व्युत्पंन है ।

कुतर सहित कई प्रजातियों में, सुनवाई समारोह जल्दी जन्मोत्तर युग4,5में अपरिपक्व है । ध्वनि संकेतों के जवाब में कोई कार्रवाई की क्षमता श्रवण प्रांतस्था में सुनवाई शुरू होने से पहले पाया जा सकता है6,7। कोक्लीअ की आकृति विज्ञान और समारोह का विकास व्यापक रूप से माउस, gerbil, और चूहा4,5,8में अध्ययन किया गया है । बाल कोशिकाओं के mechanotransduction और electromotility के शुरुआती जीवन युग5में भी विकसित हुए हैं ।

आदेश में विभिंन जन्मोत्तर उंर में चूहों की सुनवाई संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, हम श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (ABR) चूहा पिल्ले में रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि विकसित की है । पूरे सेल पैच दबाना OHCs electrophysiologically की जांच करने के लिए एक आदर्श तकनीक है । हालांकि, पैच के साथ तुलना में न्यूरॉन्स और अन्य उपकला कोशिकाओं में प्रदर्शन क्लैंप, पूरे सेल सील की कम दर अलग OHCs के electromotility की जांच सीमित.

यहां हम एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए OHCs आकृति विज्ञान और electrophysiologically में तीव्र असंबद्ध कोक्लीअ चूहों से जन्मोत्तर की जांच । इस विधि के लिए आणविक तंत्र है कि आंतरिक बाल कोशिका विकास और समारोह को विनियमित अध्ययन संशोधित किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल पशु विषयों को शामिल दक्षिणी चिकित्सा विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. प्रयोगों के लिए समाधान तैयार करें

  1. संवेदनाहारी तैयार करें (देखें सामग्री की तालिका): १.५% pentobarbital सोडियम ddH2ओ में भंग ।
  2. विच्छेदन समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें): Leiboviz के एल-15 पाउडर में से एक बैग को भंग कर के 1 l में ddH2हे. 1 मीटर NaOH के साथ ७.३ को पीएच समायोजित । उपयोग करने से पहले एक osmometer और 10 मिमी HEPES का उपयोग करके 300-330 mOsm के लिए osmolarity समायोजित करें ।
  3. भंग 2 मिलीग्राम/एमएल collagenase IV ( सामग्री की तालिकादेखें) में १.२ चरण में तैयार समाधान ।
  4. immunostaining समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें): 4% paraformaldehyde को फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पंजाब) में भंग करें ।
    सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है; उपयुक्त सुरक्षा पहनें ।
  5. पंजाब में ०.३% पारगम्यता एजेंट पतला । ब्लॉकिंग बफर के रूप में पंजाब में 10% सामांय बकरी सीरम पतला । prestin एंटीबॉडी 1:200 बफ़र अवरुद्ध में पतला है । Alexa488-संयुग्मित एंटीबॉडी 1:600 बफ़र अवरुद्ध में पतला है । पंजाबियों में Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate 1:200 को पतला करना ।
  6. extracellular समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें): ऊपर वर्णित (चरण १.२) के रूप में Leiboviz के एल-15 माध्यम तैयार करें ।
  7. intracellular समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

2. ABR रिकॉर्डिंग

नोट: ABR रिकॉर्डिंग पहले हमारे पिछले अध्ययन में विस्तार से वर्णित किया गया है9।

  1. Anesthetize Sprague Dawley (एसडी) चूहों (1-14 दिन पुराने पिल्ले और 2 महीने पुराने वयस्कों, दोनों लिंगों) के एक इंजेक्शन के साथ १.५% सोडियम pentobarbital (22 मिलीग्राम/पिल्ले के लिए और 30 मिलीग्राम/वयस्कों के लिए, intraperitoneal (आईएफसआई)) ।
  2. पशुओं के शरीर को स्थिर करने के लिए एक पॉलीथीन-फोम मोल्ड में anesthetized जानवर को रखें । एक ध्वनि क्षीणन कमरे में एक विरोधी कंपन मेज पर पशु प्लेस । ३७.५ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग पैड के साथ पशुओं के शरीर का तापमान रखें ।
  3. ७०% के साथ सिर क्षेत्र पोंछ (vol/ एक ठीक कैंची का उपयोग करके, बाहरी pinna के लिए एक 1-2 mm चीरा ventrolateral संदर्भ इलेक्ट्रोड या जमीन जगह बनाने के लिए । एक चमड़े का सुई इलेक्ट्रोड (रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड) खोपड़ी शिखर पर स्थित है (चित्र 1a) ।
  4. समारोह जनरेटर का उपयोग करना, नपे टोन फटने उत्पन्न (1 ms rise/गिर, 3 ms पठार) विभिन्न आवृत्तियों की (2, 4, 8, 16, 24, और ३२ kHz) और तीव्रता (८५ से कम करने के लिए 10 डीबी SPL में 5 डीबी कदम). आवृत्ति और आयाम मैंयुअल रूप से बदलती है या किसी कंप्यूटर का उपयोग कर । पशु के सिर की ओर 10 सेमी दूर स्थित एक इलेक्ट्रोस्टैटिक वक्ता के माध्यम से ध्वनि उत्तेजनाओं उद्धार ।
  5. फ़िल्टर (100-1000 हर्ट्ज), बढ़ाना और औसत (२५६ बार) ध्वनि एक बहु समारोह प्रोसेसर का उपयोग कर ABRs पाने के लिए क्षमता प्राप्त की । ABR निशान ऑनलाइन निगरानी और ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए संग्रहीत है । यह एक जानवर से ABR रिकॉर्डिंग को पूरा करने के लिए लगभग ४० मिनट लगते हैं ।
    नोट: आमतौर पर, तीन से सात चोटियों (तरंग मैं सातवीं लहर करने के लिए) से कम विलंब 15 ms पहचाना जा सकता है (चित्र 1b) । ABR दहलीज न्यूनतम ध्वनि स्तर जिस पर वेव मैं और द्वितीय का पता लगाया जा सकता है के रूप में परिभाषित किया गया है ।
  6. Euthanize (०.३ मिलीलीटर १.५% सोडियम pentobarbital के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ) संज्ञाहरण से जाग जानवरों से पहले ।

3. Corti के अंग (ओसी) विच्छेदन

  1. Anesthetize चूहा पिल्ले. 6 दिन पुरानी (< P6) से कम चूहों के लिए, १०० mm कल्चरल डिश में जानवर रखें, और 10 मिनट के लिए बर्फ के साथ डिश को कवर करें । चूहों के लिए > P6, १.५% सोडियम pentobarbital के एक इंजेक्शन के साथ पशु anesthetize (22 मिलीग्राम/ संज्ञाहरण के बाद चूहा पिल्ले Decapitate ।
  2. ७०% (vol/इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा सिर निष्फल ।
  3. खोपड़ी को कैंची से sagittal midline के साथ खोलें; भीतरी कान को बेनकाब करने के लिए मस्तिष्क को हटा दें ।
  4. भीतरी कान को ३५-mm पेट्री डिश में 3 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा L-15 (चित्र 2a) से भरा हुआ अंतरण ।
  5. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, कोक्लीअ (चित्र बी) के बोनी कैप्सूल को दूर करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें ।
  6. modiolus से ओसी और एसोसिएटेड stria vascularis (एसवी) को खोलना ।
  7. एसवी के बेसल भाग को संदंश के साथ धारण करने से, बेस-टू-एपेक्स (चित्र 2c) से धीरे से भागदौड़ करते हुए एसवी से ओसी को पूरी तरह से अलग कर दीजिये ।
  8. ठीक कैंची (चित्र 2d) का उपयोग करके OC समान रूप से तीन टुकड़ों में काटें ।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलाना

  1. एक २०० µ एल पिपेट टिप का उपयोग करके, एक ग्लास स्लाइड पर OC (चरण ३.८) के खंडों हस्तांतरण, और 4% से कम 4 h के लिए 4% paraformaldehyde के १०० µ l के साथ ठीक करें ।
    सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है; उपयुक्त सुरक्षा पहनें ।
  2. ताजे पंजाबियों के १०० µ l के साथ paraformaldehyde को हटाकर टिशू को धो लें । 10 मिनट के लिए तीन बार ऊतक धो लें ।
  3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पंजाब में ०.३% पारगम्यता एजेंट के साथ ऊतक मशीन ।
  4. पंजाब में पारगम्यता एजेंट को त्यागें और तीन बार पंजाबियों के साथ ऊतक धोने ।
  5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पंजाब में 10% सामांय बकरी सीरम के साथ ब्लॉक ।
  6. कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में 2 घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध में विरोधी prestin-सी-टर्मिनस एंटीबॉडी (1:200) के साथ मशीन ।
  7. 5 मिनट के लिए पंजाबियों के साथ तीन बार धो लें ।
  8. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए समाधान अवरुद्ध में Alexa488-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:600) के साथ मशीन ।
  9. अंधेरे में 5 मिनट के लिए पंजाबियों के साथ तीन बार धो लें ।
  10. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए rhodamine-phalloidin (1:200) के साथ मशीन ।
  11. अंधेरे में 5 मिनट के लिए पंजाबियों के साथ तीन बार धो लें ।
  12. बढ़ते मध्यम (युक्त DAPI) के साथ एक गिलास स्लाइड पर माउंट । ४०५ एनएम, ४८८ एनएम, और ५९४ एनएम पराबैंगनीकिरण का उपयोग करके फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ छवि । लेजर पावर सेट पर 0.1-0.5 मेगावाट और स्कैन गति पर ०.५ फ़्रेम/

5. अलग OHCs के पैच दबाना रिकॉर्डिंग

  1. पिपेट खींचने और सूक्ष्म जालसाज का प्रयोग करें एक टिप व्यास 2-3 µm. Back-intracellular समाधान के साथ पिपेट भरने के साथ पैच पिपेट बनाने के लिए । आमतौर पर, पैच पिपेट के प्रारंभिक प्रतिरोध स्नान समाधान में 2.5-3.5 MΩ था ।
  2. एक २०० µ एल पिपेट टिप का उपयोग करके, (३.८ से कदम से) ओसी का एक टुकड़ा एक ३५ mm पेट्री डिश में हस्तांतरण । एंजाइमी पाचन माध्यम (collagenase IV के १०० µ l के साथ ऊतक को पचाने, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. एंजाइमी पाचन माध्यम को एल के १०० µ एल के साथ विस्थापित-15 । बालों की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक माइक्रो स्केलपेल का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में ऊतक काटें ।
  4. कोमल pipetting के बाद, एक घर का छोटा प्लास्टिक चैंबर (व्यास ~ १.५ सेमी) एंजाइम से मुक्त स्नान समाधान (~ १.५ एमएल, सामग्री की तालिकादेखें) के साथ भरा में कोशिकाओं हस्तांतरण ।
  5. एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर चैंबर रखें. स्वस्थ दिखने वाले एकान्त OHCs को खोजो ।
  6. एक 700B एम्पलीफायर के सिर मंच में पैच पिपेट लोड. एक micromanipulator द्वारा ध्यान पिपेट पैच ले जाएँ और बाहरी बाल सेल (चित्रा 3) के नीचे के आसपास की स्थिति.
  7. पूरे सेल पैच सेल शरीर की पार्श्व दीवार सील द्वारा OHC दबाना । सेल झिल्ली टूटना है जब तक प्रकाश चूषण लागू करें । पर धारण क्षमता सेट-७० एमवी । उपयोग प्रतिरोध के साथ कोशिकाओं को 10 से लेकर 17 MΩ और झिल्ली प्रतिरोध १०० से ५०० MΩ तक की दूरी पर है, और एक सफल पूरे सेल विंयास माना जाता है ।
  8. कंप्यूटर नियंत्रण का उपयोग करना, hyperpolarizing और ध्रुवीकरण वोल्टेज लागू (२५० एमएस अवधि और से लेकर − १४० से + ९४ एमवी 13 एमवी चरणों में) पूरे सेल धाराओं में लाना करने के लिए सेल करने के लिए.
  9. पूरे सेल धाराओं बढ़ाना, फिल्टर (5 kHz के कोने आवृत्ति) एक 700B एम्पलीफायर द्वारा. एक 1440A कनवर्टर और ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए स्टोर द्वारा डेटा कन्वर्ट ।
  10. एक दो साइन-वेव वोल्टेज उत्तेजना एक पैच दबाना सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित प्रोटोकॉल का उपयोग कर OHCs की झिल्ली समाई उपाय । सेट से उत्तेजित वोल्टेज रेंज-१४० करने के लिए ११० एमवी । ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए डेटा संग्रहीत करना ।

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Representative Results

ABR शुद्ध टोन फटने (चित्र 1a) का उपयोग कर anesthetized चूहा पिल्ले से पुराने जन्मोत्तर दिन 7 (P7) से ले जा सकते हैं । के रूप में चित्रा 1bमें दिखाया गया है, चूहे पिल्ले से प्राप्त ABR waveforms छोटे आयाम के साथ केवल तीन से चार अलग लहरों दिखाया. आमतौर पर, सात चोटियों तक वयस्क जानवरों की ABR waveforms में मनाया गया (चित्र 1b).

निम्नलिखित immunostaining और electrophysiological मापन के लिए, चूहे के भीतरी कान के लौकिक हड्डी से नए सिरे से विच्छेदित किया गया. हम एसवी और modiolus (चित्रा 2a-2c) से ओसी को अलग करने के लिए ऊतक विच्छेदन के लगातार कदम दिखाते हैं । ओसी को माइक्रो-कैंची (चित्रा 2d) के साथ समान रूप से तीन टुकड़ों में काटा गया । बाल कोशिकाओं की आकृति विज्ञान दिखाने के लिए, खंडों phalloidin, prestin एंटीबॉडी, और DAPI (चित्रा 2E) के साथ दाग रहे थे । बाल बंडलों (लाल में) बाल कोशिकाओं के शिखर सतह संकेत मिलता है, जबकि OHCs के सेल शरीर prestin द्वारा चिह्नित किया गया था (हरे रंग में). नाभिक DAPI द्वारा लेबल (नीले रंग में) IHCs और OHCs के नीचे क्षेत्र में स्थित था । जैसा कि चित्रा 2Eमें दिखाया गया है, P5 पर कोक्लीअ के OHCs में कोई prestin नहीं पाया गया. Prestin पहले बेसल कोक्लीअ में स्थित OHCs में P7 पर मनाया गया ।

कोमल पाचन के बाद, OHCs OC (आंकड़ा 3ए) से अलग थे. पूरे सेल वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग OHCs तीव्रता से चूहे कोक्लीअ से पृथक से प्रदर्शन किया गया । एक प्रतिनिधि उदाहरण के पूरे-सेल वर्तमान एक अलग P9 OHC से दर्ज की प्रतिक्रिया में झिल्ली की क्षमता बदल गया − १४० से + १०७ एमवी में दिखाया गया है चित्र बी। कृपया I-V वक्र के N-आकृति क्षेत्र पर ध्यान दें, KCa वर्तमान की उपस्थिति का संकेत है जो OHCs की एक अनूठी प्रतिक्रिया है । झिल्ली वोल्टेज द्वारा संचालित, intracellular सीएल- prestin के साथ संयुक्त, पूरे सेल पैच दबाना मोड के तहत एक गैर रेखीय झिल्ली समाई (एनएलसी) परिवर्तन के रूप में प्रकट हो रहा है । एक परिपक्व OHC के ठेठ एनएलसी झिल्ली क्षमता पर घंटी के आकार निर्भरता की विशेषता है । एनएलसी एक दो राज्य बोल्ट्जमान समारोह के साथ फिट किया जा सकता है और OHCs के electromotility समारोह को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । समाई फिटिंग के लिए बोल्ट्जमान फ़ंक्शन के रूप में वर्णित है:

Equation

समीकरण और पैरामीटर्स हमारे पिछले पेपर9में बताए गए थे । दो प्रतिनिधि NLCs चित्र 3 cमें दिखाए जाते हैं ।

Figure 1
चित्र 1. श्रवण brainstem प्रतिसाद रेकॉर्डिंग. (क) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दो कानों के बीच खोपड़ी में डाला गया था. जमीन और संदर्भ इलेक्ट्रोड क्रमशः बाएँ और दाएँ pinna के अंतर्गत रखे गए थे. एक खुला मैदान वक्ता चूहे की नाक की नोक से 10 सेमी दूर रखा गया था । (ख) 16 kHz, ८० डीबी SPL टोन फटने के जवाब में दो प्रतिनिधि ABR waveforms । ऊपरी ट्रेस एक P8 पिल्ला से दर्ज की गई । नीचे एक वयस्क चूहे से दर्ज ट्रेस । संख्या waveforms के विभिन्न चोटियों से संकेत मिलता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. Corti विच्छेदन के अंग. (क) भीतरी कान के एक P9 चूहे के पिल्ला से विदारक हो गया. कोक्लीअ व vestibular क्षेत्र को दर्शाया गया है । (ख) बोनी दीवार को हटाने के बाद कोक्लीअ की संरचना उजागर हुई । (ग) Corti (ओसी) और stria vascularis (एसवी) के अंग modiolus से पृथक किए गए थे. (घ) Corti का अंग तीन टुकड़ों में समान रूप से कट गया था । A-D में स्केल पट्टियां १,००० µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । (E) फोकल छवियां कोक्लीअ के साथ विभिंन सेगमेंट (बेसल, मध्य और शिखर) में स्थित बालों की कोशिकाओं को दिखाते हैं । Rhodamine-phalloidin (लाल) बालों की कोशिकाओं के शिखर सतह पर स्थित बालों के बंडलों का प्रतिनिधित्व करता है । DAPI (नीला) बालों की कोशिकाओं के मध्य-निचले हिस्से में स्थित नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है । prestin (हरे रंग में लेबल) केवल बाहरी बाल कोशिकाओं की पार्श्व दीवार पर व्यक्त किया गया था । P7 में मध्य और बेसल खंडों के लिए, केवल ग्रीन चैनल OHCs में prestin की अभिव्यक्ति वर्णन करने के लिए दिखाया गया है । स्केल बार 20 µm का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. पृथक बाहरी बाल कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग पूरे सेल पैच दबाना । (क) एक पृथक बाहरी बाल कोशिका पूरे सेल मोड में सील किया गया था । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है 10 µm. (B) एक प्रतिनिधि I-V वक्र एक P9 बाहरी हेयर सेल से रिकॉर्ड किया गया । (ग) भिंन आयु में दो बाह्य बाल कोशिकाओं से प्राप्त रेखीय झिल्ली समाई (एनएलसी) । समाई-वोल्टेज प्रतिक्रियाओं (खुले हलकों) बोल्ट्जमान समारोह के लिए फिट थे (मोटी लाइनों के रूप में दिखाया गया है) । एनएलसी संगत रेखीय समाई (क्लीन) करने के लिए सामान्यीकृत थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

11 दिन से छोटी चूहों में, ध्वनि उत्तेजना के जवाब में कोई कार्रवाई की क्षमता श्रवण प्रांतस्था में देखा जा सकता है6,7. इसलिए, जन्मोत्तर दिन 11 "सुनवाई शुरुआत" के रूप में वर्णित है10। सुनवाई शुरू होने से पहले सुनवाई समारोह के विकास अभी तक अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया । वयस्क ABR रिकॉर्डिंग के लिए इसी तरह की विधि का उपयोग करना, हम है कि ABRs चूहा पिल्ले से शुद्ध टोन फट से P11 से छोटा किया जा सकता है (चित्रा 1) । हालांकि, चूहे पिल्ले से प्राप्त ABR waveforms वयस्क जानवरों के उन लोगों से कुछ अलग सुविधाओं दिखाया. ABR प्रतिक्रियाओं अपेक्षाकृत उच्च थ्रेसहोल्ड के साथ आयाम में छोटे हैं । इस परिणाम का अर्थ है कि विकासशील श्रवण प्रणाली ध्वनि संकेतों को कम संवेदनशीलता है । महत्वपूर्ण अंतर चूहे पिल्ले से दर्ज ABR waveforms में मनाया गया था. आमतौर पर, सात चोटियों तक वयस्क ABR waveforms9में मनाया गया. अलग विलंबता के साथ इन चोटियों श्रवण मार्ग11साथ अलग brainstem नाभिक द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. हमारे परिणाम संकेत मिलता है कि केवल I-IV तरंगों चूहे पिल्ले (चित्रा 1b) से ABR में detectable थे । लहरों मैं और द्वितीय कोक्लीअ और श्रवण तंत्रिका11से प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसलिए, परिणाम संकेत मिलता है कि उच्च स्तर श्रवण नाभिक विकास के दौरान ध्वनिक उत्तेजनाओं का जवाब देने में विफल रहा । इन आंकड़ों का सुझाव है कि कोक्लीअ कार्यात्मक परिपक्वता से पहले तक पहुंच केंद्रीय श्रवण प्रणाली करता है । विधि हम यहां का वर्णन आणविक तंत्र है कि कोक्लीअ विकास और बाल कोशिका समारोह को विनियमित के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है ।

OC के उच्च गुणवत्ता विच्छेदन immunostaining, पश्चिमी सोख्ता, और electrophysiological माप सहित आगे के प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है । इन प्रयोगों 1 और 14 दिन पुराने के बीच वयस्क एसडी चूहों और चूहे पिल्ले का उपयोग किया गया है । चूहा पिल्ले ठीक विच्छेदन के लिए आदर्श के रूप में कॉकलियर हड्डी नरम है और आसानी से OC को नुकसान पहुंचाए बिना संदंश द्वारा हटाया जा सकता है । वयस्क चूहों के लिए, विशेष रूप से सावधानी rupturing से बचने के लिए आवश्यक है, जबकि हार्ड-बोनी कैप्सूल को हटाने. ठीक संदंश का उपयोग करके, OC और संबद्ध एसवी modiolus से हटा दिया जा सकता है । सेपरेटेड ओसी और एसवी अलग बनावट (चित्रा 2c) है । चूहा पिल्ले के लिए, OC 800-1200 µm की लंबाई के साथ तीन खंडों में काटा जा सकता है । कृपया ध्यान दें, सभी कदम बर्फ ठंड एल में प्रदर्शन किया जाना चाहिए-15 के रूप में तेजी से संभव के रूप में क्रम में गिरावट और ऊतक गिरावट को कम करने के लिए ।

ओसी के पृथक खंडों immunostaining, वेस्टर्न सोख्ता, और आरएनए विश्लेषण के लिए अच्छी तैयारी कर रहे हैं । यहाँ हम immunostaining द्वारा OC में संवेदी बाल कोशिकाओं की आकृति विज्ञान दिखाते हैं. OHCs उनके शिखर सतह पर बाल बंडलों है जबकि नाभिक उंहें12बेसल स्थित है । मोटर प्रोटीन prestin OHCs की पार्श्व झिल्ली पर व्यक्त किया जाता है । फोकल इमेजिंग डेटा संकेत दिया कि prestin पहले P6-P7 में व्यक्त किया गया था और अगले सप्ताह (चित्रा 2E) पर एक निरंतर वृद्धि दिखाई । आगे के प्रयोगों में, पश्चिमी सोख्ता और क्यू पीसीआर विकास के दौरान prestin के मनाया अभिव्यक्ति स्तर परिवर्तन (डेटा नहीं दिखाया गया) यों तो प्रदर्शन किया गया । क्योंकि बाल कोशिकाओं के OC में अल्पसंख्यक हैं, 6 से 10 cochleae एक प्रयोग में मजबूत संकेतों को प्राप्त करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं ।

OHCs के पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए, हल्के एंजाइमी पाचन OHCs को अलग करने के लिए किया गया था । बाल कोशिकाओं नाजुक है, और इस कदम में विशेष सावधानी की आवश्यकता है । ऊतक और अलग कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक २०० µ l पिपेट टिप का उपयोग करें. OC के अलग खंड collagenase समाधान की एक बूंद को हस्तांतरित किया गया था (~ १०० µ एल) कमरे के तापमान पर के बारे में 5 मिनट के लिए एक पेट्री डिश में । लंबे समय तक पाचन समय से बचें, जो OHCs की कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचा देगा । माइक्रोस्कोप के तहत, स्वस्थ लग OHCs पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए चयन किया गया । सिकुड़न, सूजन, क्षति, या नाभिक के translocation के किसी भी लक्षण दिखा कोशिकाओं को अगले प्रयोग से बाहर रखा गया । स्वस्थ दिखने वाले एकाकी OHCs और IHCs को अपने रूपात्मक अंतर से पहचानने में आसानी होती है. OHCs एक बेलनाकार आकृति और एक बड़ा अक्ष व्यास अनुपात दिखाने के लिए, जबकि IHCs एक तंग गर्दन के साथ कुप्पी के आकार के हैं12. OHCs में पूरे सेल पैच दबाना न्यूरॉन्स और अन्य उपकला कोशिकाओं में उन लोगों से कुछ हद तक मुश्किल है. सफल पूरे सेल विन्यास के लिए, पैच पिपेट आमतौर पर नाभिक के पास स्थित था, ऊपरी पार्श्व झिल्ली से दूर रखा prestin कणों का एक उच्च घनत्व (चित्रा 3) युक्त. झिल्ली टूटना था के बाद, OHCs की झिल्ली समाई प्राप्त करने के क्रम में एक दो साइन-वेव वोल्टेज उत्तेजना प्रोटोकॉल सेल करने के लिए लागू किया गया था । एक ही तकनीक के साथ, वोल्टेज कदम का उपयोग करके, यह पूरे सेल वर्तमान में लाना संभव है ।

इस विधि से इन विट्रो9,13में OHCs के electromotility फ़ंक्शन की जांच करने के लिए एक अच्छा उपकरण है । इस विधि भी आयन चैनलों के समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही OHCs और IHCs में रिसेप्टर्स के औषधीय गुणों14.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम ९७३ कार्यक्रम (2014CB943002) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (११५३४०१३, ३१५००८४१) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium Sigma P3761 1.5% in water
Name Company Catalog Number Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
Collagenase IV Sigma C5138 2 mg/mL in L-15
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining solutions
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 PH 7.3
Paraformaldehyde Sigma 158127 4% in PBS
Triton X-100 Amresco ZS-0694 0.3% in PBS
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 10000C 10% in PBS
prestin antibody Santa Cruz SC-22694 dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody Thermo Fisher Scientific A-11055 dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma P1951 dil 1:200
DAPI Solarbio C0060 dil 1:20
Name Company Catalog Number Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
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Intracellular solution
CsCl Sigma 7647-17-8 140 mM
MgCl2 Sigma 7791-18-6 2 mM
EGTA Sigma 67-42-5 10 mM
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
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Equipment
Osmometer Gonotec OSMOMAT 3000 basic
Forcep WPI 14095 Tweezers dumont
Micropipette puller Sutter Instrument MODLE-P97
Micro Forge Narishigen MF-830
Mini Operating System Sutter Instrument MP-285
MultiClamp Axon 700B
Low-Noise Data Acquisition System Axon 1440A
ES1 speaker Tucker-Davis Technologies
TDT system 3 Tucker-Davis Technologies
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Software
SigGenRP software Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software Tucker-Davis Technologies
jClamp Scientific Solutions
Name Company Catalog Number Comments
Animal
SD rat Experimental Animal Center of Southern Medical University

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References

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तंत्रिका विज्ञान १३५ अंक श्रवण brainstem प्रतिक्रिया Corti के अंग बाहरी बाल कोशिका जन्मोत्तर चूहा पूरे सेल पैच दबाना रैखिक समाई
श्रवण Brainstem प्रतिक्रिया और बाहरी बाल कोशिका पूरी सेल पैच दबाना जन्मोत्तर चूहों में रिकॉर्डिंग
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Chang, A., Li, C., Huang, J., Pan,… More

Chang, A., Li, C., Huang, J., Pan, W., Tian, Y., Tang, J. Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats. J. Vis. Exp. (135), e56678, doi:10.3791/56678 (2018).

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