Summary
Denna studie genomförs hela Genomsekvensering för analys av mutationer i gener som ger resistens mot svampdödande läkemedel i Candida glabrata. C. glabrata isolat resistenta mot echinocandiner, azoler och 5-flucytosin, var sekvenserade för att illustrera metoden. Känslighet profiler av isolaten korrelerade med närvaro eller frånvaro av specifika mutation mönster i gener.
Abstract
Candida glabrata kan snabbt skaffa mutationer som leder till läkemedelsresistens, särskilt azoler och echinocandiner. Identifiering av genetiska mutationer är viktigt, som resistens upptäcks i vitro kan ofta korreleras med kliniska misslyckande. Vi undersökte möjligheten att använda hela Genomsekvensering (WGS) för genome-wide analys av svampdödande läkemedelsresistens i C. glabrata. Målet var torecognize enablers och hinder i genomförandet WGS och mäta dess effektivitet. Detta dokument beskriver de viktiga kvalitetskontroll kontrollpunkter och väsentliga komponenter av WGS metod att undersöka genetiska markörer associerade med minskad känslighet för antimykotika. Det uppskattar också noggrannheten av dataanalys och turn-around-tid testning.
Fenotypisk känslighet 12 kliniska och en ATCC stam av C. glabrata bestämdes genom svampdödande resistensbestämning. Dessa inkluderade tre isolera par, från tre patienter, som utvecklat ökning drog de minsta hämmande koncentrationerna. I två par isolera andra av varje par utvecklat resistens mot echinocandiner. Isolatet av andra tredje paret utvecklat resistens mot 5-flucytosin. De återstående består av mottagliga och azol resistenta isolat. Enda nukleotid polymorfismer (SNP) i gener kopplade till echinocandin, azol och 5-flucytosin motstånd bekräftades i resistenta isolat genom WGS använder nästa generations sekvensering. Icke-synonymt SNP i svampdödande motstånd gener såsom FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 och FCY2 identifierades. Totalt, genomsnitt 98% av WGS läser av C. glabrata isolat mappas till referens genomet med ca 75-fold Läs djup täckning. Den handläggningstid och kostnaden var jämförbara med Sanger sekvensering.
Sammanfattningsvis, var WGS av C. glabrata genomförbart i avslöjar kliniskt signifikant genmutationer som är inblandade i resistens mot olika svampdödande läkemedel klasser utan behov av flera PCR/DNA sekvensering reaktioner. Detta utgör ett positivt steg mot att inrätta WGS kapacitet i kliniska laboratorium för samtidiga upptäckt av svampdödande resistenssubstitutioner om tilldelning.
Introduction
Candida glabrata är en alltmer förekommande patogen med vikten som en art som uppvisar motstånd till azoler samt mer nyligen, den echinocandiner1,2,3. Till skillnad från det diploida C. albicans, kan haploida genomet hos C. glabrata tillåta det att förvärva mutationer och utveckla flera läkemedelsresistens lättare. Samtidig resistens till båda drog klasser har också rapporterat4. Tidig utvärdering av svampdödande känslighet och upptäckt av läkemedelsresistens i C. glabrata är därför avgörande för korrekt, riktad terapi samt som i sammanhanget av svampdödande förvaltarskap att begränsa förare av antimikrobiell resistens1 , 5 , 6. att upprätta ett effektivt arbetsflöde att snabbt upptäcka förekomst av bekräftande mutationer kopplade till motstånd biomarkörer i resistenta isolat kommer också bidra till att förbättra förskrivning beslut och kliniska resultat.
Svampdödande känslighet bedöms vanligtvis genom att mäta minsta hämmande koncentration (MIC) som definieras som den lägsta drog koncentration som resulterar i en betydande minskning av tillväxten av en mikroorganism jämfört med en Drogfri-tillväxt kontroll. Klinisk och Laboratory Standards Institute (CLSI) och Europeiska kommittén på antimikrobiell känslighet Testing (EUCAST) har standardiserat resistensbestämning metoder för att göra MIC beslutsamhet mer exakt och konsekvent7, 8. Nyttan av svampdödande MIC förblir dock begränsad speciellt för echinocandiner, särskilt när det gäller genomför mellan olika laboratorier jämförelser där varierande metoder och villkor är användas9. Det finns också osäkra korrelation av mikrofoner med behandlingssvar echinocandin och oförmåga att urskilja WT (eller mottagliga) isolat från dem härbärgerat FKS mutationer (echinocandin-resistenta stammar)10,11. Trots tillgången till bekräftande singel-gen primärvården och Sanger sekvensering av svampdödande motstånd markörer, förverkligandet av resultaten är ofta försenats på grund av bristande samtidiga upptäckt flera motstånd markörer5,12. Därav, samtidiga detektion av resistens-ger mutationer på olika platser i arvsmassan, aktiverad av hela genomet sekvensering-baserad analys, erbjuder betydande fördelar jämfört med nuvarande metoder.
Hela genomet sekvensering (WGS) har genomförts framgångsrikt för att spåra sjukdomsspridning under utbrott samt en strategi för genome-wide risk bedömning och drog resistens testning i bakterier och virus13. Senaste framstegen inom nukleinsyra sekvenseringsteknologi har gjort hela Genomsekvensering (WGS) av patogener i en kliniskt angripbara slå-runt-tid både tekniskt och ekonomiskt genomförbara. DNA-sekvensering erbjuder viktiga fördelar över andra metoder för patogen identifiering och karakterisering sysselsatt i mikrobiologi laboratorier14,15,16. Först, det ger en universell lösning med hög genomströmning, hastighet och kvalitet. Sekvensering kan tillämpas på någon av mikroorganismer och tillåter stordriftsfördelar på lokala eller regionala laboratorier. För det andra, den producerar data i ett 'framtidssäker' format mottagliga för jämförelse på nationell och internationell nivå. Slutligen, den potentiella nyttan av WGS i medicin har varit förstärkt av den snabba tillväxten av offentliga databaser som innehåller referens genomen, som kan kopplas till motsvarande databaser som innehåller ytterligare kliniska och epidemiologiska metadata17 ,18.
Nyligen genomförda studier har visat nyttan av WGS för identifiering av svampdödande motstånd markörer från kliniska isolat av Candida spp. 10 , 19 , 20. Detta beror främst på tillgången till hög genomströmning bänkmonterade sequencers, etablerade bioinformatik pipelines och minskar kostnaden för sekvensering21,22. Fördelen med svamp WGS över Sanger sekvensering är att WGS gör sekvensering av flera genom att på en enda körning. Dessutom kan WGS av Candida genom identifiera nya mutationer i läkemedelsmål, spåra genetisk evolution, och uppkomsten av kliniskt relevanta sekvens-typer20,22,23. Viktigast av allt, i fall av inneboende multidrug motstånd, kan WGS hjälpa tidig detektion av resistens-ger mutationer före behandling urval22,24.
Här, undersökte vi möjligheten att WGS-aktiverade screening för mutationer som förknippas med resistens mot olika klasser av antimykotika. Vi presenterar en metod för genomförandet av WGS från slutanvändare och diagnostiska mykologi laboratorium perspektiv. Vi ingår i den här analysen tre isolera paren odlade från tre separata kliniska fall i som in vitro- resistens mot de echinocandiner och 5-flucytosin utvecklats över tiden efter antimykotisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ingen etisk godkännande krävdes för denna studie.
1. subkultur och inokulum förberedelse för Candida glabrata
- Välj en panel av C.glabrata isolat studeras som också bör omfatta minst en C. glabrata amerikansk typ kultur samling (ATCC) med känd känslighet mönster.
- Subkultur ett isolat genom att trycka på en enda koloni med hjälp av en steril engångs plast loop och strimmor på en Sabouraud dextros agar (SDA) platta8.
- Inkubera SDA plattan för 24-48 h vid 35 ° C för renkultur av isolat med god tillväxt.
2. bestämning av svampdödande känslighet
- Använd en steril engångs plast loop att plocka 4-5 kolonier av cirka 1 mm diameter från en färsk subcultured C. glabrata isolera på SDA tallrik. Återsuspendera i 3 mL i sterilt destillerat vatten. Blanda väl genom varsam pipettering för att erhålla enhetlig suspension.
- Justera cell densiteten till 0.5 McFarland vilket motsvarar 1 x 106 5 x 106 celler/ml använder en densitometer 8.
- Utföra resistensbestämning med kommersiell analys (se tabell för material och reagenser) på alla C. glabrata isolerar följa tillverkarens instruktioner. Tolka känslighet av isolat baserat på resulterande mikrofoner av svampdödande läkemedel enligt CLSI riktlinjer och förbereda rapport (tabell 1)8.
3. genomisk DNA-extraktion för sekvensering
- Återsuspendera en platinaögla kolonier från en färska odlade SDA-plattan i 300 µL av 50 mM EDTA i en 1,5 mL tub.
- Tillsätt 40 µL av zymolyase (10 mg/mL) till suspension och försiktigt Pipettera 5 gånger tills suspensionen är enhetliga.
- Inkubera provet vid 37 ° C i 1-2 h att smälta cellväggen. Svalna i rumstemperatur i 5 min.
- Centrifugera suspensionen vid 14.000 × g i 2 min och ta sedan försiktigt bort supernatanten.
- Extrahera genomiskt DNA DNA extraktion kit riktlinjer (se tabell för material).
- Återsuspendera extraherat DNA pelleten i 50 µL 10 mm Tris buffert (pH 7,5-8,5) i stället för eluering bufferten i kit.
- Kontrollera renhet av DNA genom mätning av optiska densitet (O.D) 260/280 nm25.
4. genomisk DNA kvantifiering
- Förbereda en 1 x Tris EDTA (TE) buffert i assay kit baserat på tillverkarens riktlinjer för fluorescens analysen (se tabell för material).
- Späd det DNA-provet genom att lägga till 2 µL 98 µL av 1 x TE analysbuffert (slutlig volym av 100 µL, utspädning faktor 1:50) i en disponibel 96 väl platta. Denna utspädningssteg kan utföras antingen manuellt med hjälp av en multikanalpipett eller genom automatiserad vätskehantering arbetsstation.
- Förbereda spänna av standarder genom att späda ut lambda DNA (100 µg/mL) i fluorescens assay kit (tabell 2) och inkluderar för mätning tillsammans med prover.
- Tillsätt 100 µL av den fluorescerande färgen till 100 µL utspädd DNA-prover och standarder för reaktionen. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur, skyddas från ljus.
- Mäta fluorescensen av alla prover utifrån tillverkarens riktlinjer.
- Rita standardkurvan med fluorescens avläsningarna och beräkna den ursprungliga koncentrationen av de DNA-proverna.
- Bestäm volymen av DNA och 10 mM Tris buffert (pH 8) läggas till justera DNA koncentrationen till 0,2 ng/µL.
- Utföra de DNA utspädningar med automatiserad vätskehantering arbetsstation. Detta steg kan också uppnås genom manuell pipettering.
5. DNA bibliotek förberedelse
Obs: Biblioteket förberedelse och sekvensering utfördes efter tillverkarens protokoll och riktlinjer som tillhandahålls av företaget (figur 1A) (se tabell för material).
- Tagmentation och PCR-amplifiering
- Märka en ny 96 brunnar hårda tunn vägg platta.
- Tillsätt 5 µL av kvantifierade input DNA på 0,2 ng/µL (1 ng totalt) till varje prov väl av plattan.
- Tillsätt 10 µL tagmentation buffert och 5 µL förstärkning buffert till varje brunn innehållande DNA och Pipettera försiktigt för att blanda. Försegla plattan med fästplatta plomb.
- Placera plattan i en termocykel och kör programmet följande PCR: 55 ° C i 5 min, och håll vid 10 ° C. När provet når 10 ° C, Fortsätt omedelbart att neutralisera.
- Tillsätt 5 µL neutralisering buffert till plattan att neutralisera amplikon reaktionen, och försiktigt Pipettera mix. Försegla plattan och odla i rumstemperatur i 5 min.
- Tillsätt 15 µL av indexering PCR mastermix till proverna.
- Använda en låda med index primer rör tillgängliga för inställning av plattan med 96 brunnar format så att varje prov blir en unik kombination av index baserat på index mall (tabell 3).
- Ordna index primer rören i index platta racket (figur 1B) med hjälp av den ordning som anges i mallen på tabell 3 och spela in positionen för indexen på mallen.
- Placera tagmentation plattan med extra PCR mastermix på index platta racket med index rör i ordning.
- Sätta index primer 1 rör i vertikala arrangemang, och index primer 2 rör i horisontella arrangemang på index racket. Med hjälp av en flerkanalspipett, noggrant Tillsätt 5 µL av index grundfärger till varje prov.
- Ersätt gamla kepsar av index rör med nya lock för att undvika korskontaminering mellan indexen.
- Försegla plattan med 96 brunnar klart plattan tätningsmedel och utföra andra PCR enligt följande: 95 ° C i 30 s, 12 behandlingscykler om 95 ° C för 10 s, 55 ° C för 30 s, 72 ° C under 30 s och 72 ° C i 5 min.
- PCR-rensning
- Överför PCR-produkten för PCR-rensning, från tagmentation plattan till en djup, väl tallrik (se tabell för material).
- Vortex kommersiella magnetiska pärlor lösningen (se tabell för material) utifrån tillverkarens anvisningar och tillsätt 30 µL pärlor i varje PCR-produkt i plattan djupa brunnar.
- Skaka plattan på en mikroplattan shaker vid 1800 rpm i 2 min och odla i rumstemperatur utan att skaka i 5 min.
- Placera plattan på en magnetisk stå för 2 min tills supernatanten har rensat.
- Kassera supernatanten noggrant med plattan fortfarande på magnetiska stativet.
- Tillsätt 200 µL av nylagade 80% etanol med plattan på magnetiska stativet.
- Inkubera plattan på magnetiska står för 30 s och försiktigt bort och kasta bort vätskefasen utan att störa pärlorna.
- Upprepa tvättningen igen och låt pärlorna lufttorka 15 min. ta bort överflödig etanol eventuellt.
- Avlägsna plattan från magnetiska stativet och tillsätt 52,5 µL resuspension buffert i pärlorna.
- Skaka plåten på en mikroplattan shaker vid 1800 rpm i 2 min och odla i rumstemperatur i 2 min utan att skaka.
- Placera plattan på magnetiska stativet och låt supernatanten att rensa.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, noggrant överföra 50 μl av supernatanten från rensning av plattan till en ny hård platta.
- Bibliotek normalisering
- Tina bibliotek normalisering reagenser enligt tillverkarens riktlinjer (se tabell för material).
- Över 20 µL av supernatanten från rensning av plattan till en nya plattan djupa brunnar.
- Tillsätt 45 µL av magnetiska pärla suspensionen och försegla plattan med en tallrik sealer.
- Skaka plåten på en mikroplattan shaker vid 1800 rpm i 30 min. Denna inkubationstid är avgörande och bör inte överskridas.
- Placera plattan på en magnetisk stå i 2 min och bekräfta att supernatanten har rensat (figur 1B).
- Avlägsna och Kassera supernatanten i en lämplig riskavfallsbehållare med plattan fortfarande på magnetiska stativet.
- Avlägsna plattan från den magnetisk stå och tvätta pärlorna med 45 µL tvättlösning.
- Skaka plattan med tvättbuffert på en mikroplattan shaker vid 1800 rpm för 5 min.
- Placera plattan på magnetisk stå för 2 min och Kassera supernatanten när det blir klart.
- Avlägsna plattan från magnetiska stativet och upprepa tvätten med tvättbuffert igen.
- Avlägsna plattan från magnetiska stativet och tillsätt 30 µL 0,1 N NaOH.
- Skaka plattan med 0,1 N NaOH på en mikroplattan shaker vid 1800 rpm för 5 min och placera plattan på magnetiska står för 2 min eller tills vätskan är klar.
- Tillsätt 30 µL av eluering buffert till varje brunn en ny 96 brunnar hårda tunnväggiga slutliga normaliserade bibliotek plattan.
- Överföra 30 µL av supernatanten från normalisering plattan till slutliga normaliserade bibliotek plattan att göra slutliga volym 60 µL. Biblioteken är nu redo att sekvenseras.
- Bestämning av DNA bibliotek koncentration av qPCR
- Tina de mastermix, primers och normer i qPCR kit enligt tillverkarens riktlinjer (se tabell för material).
- Kombinera PCR reagens mastermix och primer i qPCR kit efter tillverkarens anvisningar och alikvoter kan lagras vid-20 ° C.
- För att bestämma DNA bibliotek koncentrationen, gör en 1/8000 utspädning av DNA biblioteken använder 10 mM Tris buffert (pH 8) genom att utföra en spädning 1: 100 (1,5 µL DNA bibliotek till 148,5 µL Tris buffert) följt av en 1: 80 utspädning (2 µL från 1: 100 till 158 µL Tris buffert).
- Skaka den utspädning plattan vid 700 rpm för minst 1 minut och sedan Centrifugera vid 14000 × g i 1 min.
- Förbered 20 µL av slutliga PCR-reaktionen genom att blanda 4 µL utspädda DNA bibliotek eller DNA standarder och 16 µL av mastermix.
- Utföra PCR följande tillverkarens inställningar i termocyklern: 95 ° C i 5 min, 35 cykler av 95 ° C i 30 s och 60 ° C för 45 s, och slutliga 65 ° C till 95 ° C för smälta kurva analys.
- Hämta Ct värdena för prov DNA bibliotek och standarder från de qPCR termocyklern.
- Generera en standardkurva från Ct värdet av standarder (figur 2). Definiera intervallet övre och nedre QC av ± 3 cykler från medelvärdet. Till exempel om genomsnittliga Ct-värde är 13 cykler är då QC intervallet mellan 16 och 10 cykler.
- Fastställa de individuella och genomsnittliga bibliotek koncentrationerna (ALC) från standardkurvan och Ct-värden.
- Bestäm volymen av totala poolade bibliotek (PAL) som ska användas baserat på beräkningen nedan angivna för slutliga sekvensering med tanke på att biblioteket målkoncentration är mellan 1,4 - 13 8:.
Obs: Genomsnittlig bibliotek koncentration erhålls från qPCR = ALC; Summa poolade bibliotek (PAL) = ALC / 2; Denatureras PAL (DAL) = PAL * 0,666
Beroende på volymen av DAL som blandas med buffert, är koncentrationen av bibliotek som ska läggas till cellen flöde. Till exempel om 65 µL av biblioteket läggs till 835 µL buffert, sedan från denna utspädning (Dil 1) 195 läggs till en total volym på 1300 µL: (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = slutlig koncentration (bör vara mellan 1,4 - 13 8:)
6. bibliotek poolning och initiering sekvensering i bänkmonterade Sequencer
- Tina reagens patron enligt tillverkarens riktlinjer. Ta ut en ny flöde cell från sitt paket från 4 ° C lagring och föra till rumstemperatur åtminstonde 30 min före sekvensering. Ta ut bufferten patron och prechill sekvensering buffertlösning före användning (se tabell för material).
- Förbered ett kontrollbibliotek genom att blanda 5 µL bibliotek (1 nM) och 5 µL 0,2 N NaOH. Vortex kort och inkubera i 5 min i rumstemperatur att denaturera kontroll biblioteket in singeln strandar.
- Tillsätt 5 µL av 200 mM Tris-HCl, pH 7 och vortex. Lägg till 235 µL prechilled sekvensering buffert och blanda försiktigt. Den totala volymen är 250 µL med kontroll bibliotek slutkoncentration 20 pM.
- Pool DNA bibliotek genom att överföra 5 µL av varje prov bibliotek till sekvenseras från den slutliga normaliserade bibliotek plattan i ett enda låg-bind 1,5 mL rör.
- Lägga till 30 µL av poolade bibliotek och 30 µL av 0,2 N NaOH att denaturera bibliotek i en annan låg bind tube.
- Vortex låg-binda röret och inkubera i 5 min i rumstemperatur att denaturera bibliotek in singeln strandar.
- Tillsätt 30 µL av 200 mM Tris-HCl, pH 7 till röret med denaturerat bibliotek att neutralisera reaktion.
- Lägga till 65 µL neutraliserat denaturerat bibliotek suspension och 835 µL av pre kylda sekvensering buffert och vortex att blanda väl.
- I ett sista låg bind rör kombinera följande: 195 µL från neutraliserat denaturerat bibliotek, 1.30 µL av kontrollbibliotek och 1103.70 µL av sekvensering buffert. Blanda ordentligt.
- Läsa in den slutliga bibliotek mix (1300 µL) i den utsedda platsen på reagens patron.
- Set-up sekvensering köra genom att ange projektet och prov detaljer i Sequencer designerat webbplatsen efter riktlinjer.
- Initiera sekvensering efter riktlinjer. Laddar flöde cell, reagens med bibliotek buffert bläckkassetten och i bänkmonterade sequencer.
- Spela in batchnummer av alla reagens kit och patroner som används i sekvenseringen.
7. data hämtas från sekvensering webbplats
- Data överför FASTQ arkivera efter tillverkarens anvisningar som finns på webbplatsen.
- För en god kvalitet kör kontroll att procentuella Q30 är ≥ 75% och kluster densitet är mellan 170-280 K/mm2 med optimal på 200-210 K/mm2 (tabell 4).
8. sekvensering dataanalys
- Importera FASTQ filer sekvenserade prover till data analys integrerat programpaket (se tabell för material).
- Skapa ett arbetsflöde för sekvensering i programvara genom att lägga till funktioner från listan nämligen trimning, mappning till referens (Välj referens genomet), lokala uträtning och variant analys (figur 3A) med inställningar som anges i tabell 5.
- Kör arbetsflöde genom att välja ett enda prov eller ett parti av FASTQ exempelfilerna och spara utdatafiler i utsedda prov mappar.
- Generera rapport för sekvens täckning djup, mappade regioner och lista över strukturella varianter i genomet (figur 3B).
- Använda strukturella varianter ska söka efter icke-synonymt enda nukleotid polymorfismer (SNP) i gener som ger resistens och virulens.
- Förbereda rapport genom att lista SNP läge, gen och antalet resistenta eller känsliga isolat (tabell 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tretton C. glabrata bestående av C. glabrata ATCC 90030 och 12 isolat från klinisk mykologi referenslaboratorium (isolater CMRL1 till CMRL12), Westmead sjukhus, Sydney studerades (tabell 1). Dessa inkluderade tre par isolat CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 och CMRL-5/CMRL-6 erhållits före och efter antimykotisk terapi med inga epidemiologiska samband mellan dem 24 (tabell 1).
MICs bestämdes med CLSI tolkande brytpunkt för nio antimykotika nämligen amfotericin (AMB), Anidulafungin (ANI), Micafungin (MIF), kaspofungin (CAS), 5-flucytosin (5-FC), posakonazol (POS), vorikonazol (VRC), itrakonazol () ITR) och flukonazol (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 och Candida krusei ATCC 6258 användes som kvalitetskontroll stammar. Bland isolera para, CMRL-1 och CMRL-2, var den andra isolera CMRL-2 resistenta mot kaspofungin (MIC 8 vs 0,12 mg/L, tabell 1). CMRL-2 hade också liknande dosproportionella ökningar i MICs anidulafungin och micafungin (≥ 0,5 mg/L) vilket resulterar i in vitro- resistens mot alla tre echinocandiner24. Jämväl, isolera CMRL-4 hade utvecklat echinocandin resistans än isolatet CMRL-3 (tabell 1). Mellan det tredje paret, isolera CMRL-6 hade en 5-flucytosin MIC (> 64 vs. 0.06 mg/L)24. Båda dessa isolera paren var mottagliga/vildtyp (WT) till andra antimykotika testade. Isolera CMRL-6 och CMRL-12 befanns vara resistenta eller icke-WT att alla azoler. CMRL-7 var resistent mot flukonazol och icke-WT till vorikonazol (tabell 1). C. glabrata ATCC 90030 och isolat CMRL-8 till CMRL-11 var mottagliga mottagliga/WT till alla antimykotika24.
WGS 13 isolat utfördes med hjälp av bänkmonterade sequencer. I genomsnitt, en mid output sekvensering körning, gav runt 27-40 GB data med en felprocent mellan 0,5-1,4%. Den genomsnittliga procentuella Q30 erhålls var oftast runt 80-85%. Klustret flöde-cell densiteten (K/mm2) varierade mellan 200-250 (tabell 4). Råsekvensdata från denna studie har deponerats på NCBI sekvens Läs arkiv (SRA) under projektnummer PRJNA310057. 98% av sekvensering läser mappade till C. glabrata referens genomet (stam CBS138) genom analys i integrerade data analysprogram. Genomsnittligt Läs djup täckning var 75 x med genomsnitt läsa längd 143-bp. strukturella variant upptäckt identifierade mer än 50, 000 SNPs per isolat. Särskilt när man analyserar de stam-par CMRL1/CMRL-2, totala SNPs hittades på varje isolat var runt 79 000, för CMRL-3/CMRL-4, var det totala antalet SNP runt 60.000 och för CMRL-5/CMRL-6, mer än 56 000 jämfört med CBS13824. SNP skillnaden jämfört mellan isolat i en stam-par var mindre än 25.
Baserat på känslighet profil av isolaten, känt motstånd biomarkörer valdes för analys24, särskilt, FKS1, FKS2 och FKS3 (echinocandin resistans), FCY1 och FCY2 (5- flucytosin motstånd), och ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 och CgFLR1 (azol motstånd). Generna kontrollerades för kända mutationer, och frekvensen av SNP förekomster. Endast icke-synonymt SNP i gener med läsa djup täckning av ≥20 dvs, studerades särskilt hög kvalitet SNP (hq-SNP).
Särskilt, identifierades FKS mutationer i genomet hos båda echinocandin-resistenta isolat24. Av de två första paren, de echinocandin resistenta isolat, CMRL-2 hyste en enda FKS2 mutation S629P och CMRL-4, FKS2 mutationen S663P (tabell 6). För det tredje paret hittades en SNP i FCY2 (Ala237Thr) i både CMRL-5 (5-flucytosin mottagliga) och CMRL-6 (resistent) (tabell 6). SNP i FCY2 fanns dock också i andra fenotypiskt-WT isolat (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24. Isolat CMRL-6 och CMRL-12 var anmärkningsvärd för sin pan-azol resistenta/icke-WT karaktär och hade SNP i både CgCDR1 (kodning azol effluxpumpar) och CgPDR1 (kodning en transkriptionsfaktor som reglerar effluxpumpar) (tabell 6)26 ,27. Förekomsten av mutationer i en annan gen för efflux-pump, CgFLR1 inträffade i båda azol-mottagliga och azol-resistenta isolat26,28. Framgick för SNPs inom den ERG9 (kodning skvalen synthase) mutationer men det fanns inga mutationer identifieras i ERG1124.
WGS analysen visade också flera icke-synonymt SNP i Candida cellväggen vidhäftning gener nämligen EPA1, EPA6, PWP2 och PWP5. EPA6 mutationer var närvarande i 9/12 isolat. SNP i PWP2 och PWP5 var också närvarande i nästan alla isolat, utom isolat CMRL-1 och CMRL-11-24.
| Isolera | AMB | ANI | MIF | CAS | 5-FC | POS | VRC | ITR | FLC | Tolkning av svampdödande känslighet | Gener som ger resistens identifieras av WGS | ||
| CMRL-1 | 0,5 | 0,03 | < 0,008 | 0,12 | < 0,06 | 0,5 | 0,12 | 0,25 | 8 | Mottagliga för alla | - | ||
| CMRL-2 | 0,5 | 1 | 1 | 8 | < 0,06 | 0,25 | 0,06 | 0,12 | 4 | Resistenta mot alla echinocandiner endast | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0,25 | 0,015 | 0,015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0,25 | 0,5 | 8 | Mottagliga för alla | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0,06 | 0,5 | 0,12 | 0,25 | 8 | Resistenta mot alla echinocandiner endast | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0,12 | 0,015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Mottagliga för alla | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0,06 | 0,015 | 0,06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | Resistent mot 5-FC och azoler | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0,25 | 0,06 | 0,015 | 0,25 | < 0,06 | 1 | 8 | 0,5 | 256 | Resistenta mot alla azoler endast | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0,5 | 0,03 | 0,008 | 0,06 | < 0,06 | 0,5 | 0,25 | 0,25 | 4 | Mottagliga för alla | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0,03 | 0,015 | 0,25 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 1 | 16 | Mottagliga för alla | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0,03 | < 0,008 | 0,5 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Mottagliga för alla | - | ||
| CMRL-11 | 0,5 | 0,03 | < 0,008 | 0,03 | < 0,06 | 0,5 | 0,25 | 0,5 | 8 | Mottagliga för alla | - | ||
| CMRL-12 | 0,5 | 0,03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | Resistenta mot alla azoler endast | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0,03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 8 | Mottagliga för alla | - | ||
| Förkortningar: MIC, minsta hämmande koncentration; AMB, amfotericin B; ANI, anidulafungin; CAS, kaspofungin; FLC, flukonazol; ITR, itrakonazol; MIF, micafungin; POS, posakonazol; VRC, vorikonazol; 5-FC, 5-flucytosin. | |||||||||||||
Tabell 1. In vitro känslighet 13 Candida glabrata isolerar inklusive CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 och CMRL-5/CMRL-6 isolera paren som erhållits före och efter antimykotisk terapi
| Standarder | DNA Standard volym (μl) | 1 X TE buffert | Reagens (μL) | Summa i plattan med 96 brunnar (μL) | Slutliga DNA-koncentration (ng/mL) |
| STD-Pico 1 | 8 (standard DNA tube 100 µg/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| STD-Pico 2 | 10 (från Std-Pico 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| STD - Pico 3 | 5 (från Std-Pico 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| STD-Pico 4 | 2 (från Std-Pico 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| STD-Pico 5 | 10 (Std-Pico 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| Tomt | - | 100 | 100 | 200 | Tomt |
Tabell 2. Protokoll för utarbetandet av standarder för standardkurvan Generation för DNA kvantifiering
Figur 1 . Sekvensering arbetsflöde: (A) en disposition stora analytiska steg för bibliotek förberedelser och sekvensering på ett bänkmonterade sequencer. (B) viktiga komponenter för DNA bibliotek beredning såsom (vänster till höger) index plattan rack för arrangemang av index under indexering och magnetiska rack med djup 96-well platta för magnetiska pärla baserat sanering av DNA bibliotek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Index Serie A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | Prov 4 | Prov 5 | Prov 6 | Prov 7 | Prov 8 | Exempel 9 | Prov 10 | Exempel 11 | Prov 12 |
| B | S503 | Prov 13 | Prov 14 | Prov 15 | Prov 16 | Prov 17 | Prov 18 | Prov 19 | Prov 20 | Prov 21 | Prov 22 | Prov 23 | Prov 24 |
| C | S505 | Prov 25 | Prov 26 | Prov 27 | Prov 28 | Prov 29 | Prov 30 | Prov 31 | Prov 32 | Prov 33 | Prov 34 | Prov 35 | Prov 36 |
| D | S506 | Prov 37 | Prov 38 | Prov 39 | Prov 40 | Prov 41 | Prov 42 | Prov 43 | Prov 44 | Prov 45 | Prov 46 | Prov 47 | Prov 48 |
| E | S507 | Prov 49 | Prov 50 | Prov 51 | Prov 52 | Prov 53 | Prov 54 | Prov 55 | Prov 56 | Prov 57 | Prov 58 | Prov 59 | Prov 60 |
| F | S508 | Prov 61 | Prov 62 | Prov 63 | Prov 64 | Prov 65 | Prov 66 | Prov 67 | Prov 68 | Prov 69 | Prov 70 | Prov 71 | Prov 72 |
| G | S510 | Prov 73 | Prov 74 | Prov 75 | Prov 76 | Prov 77 | Prov 78 | Prov 79 | Prov 80 | Prov 81 | Prov 82 | Prov 83 | Prov 84 |
| H | S511 | Prov 85 | Prov 86 | Prov 87 | Prov 88 | Prov 89 | Prov 90 | Prov 91 | Prov 92 | Prov 93 | Prov 94 | Prov 95 | Prov 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indexera Set B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | Prov 4 | Prov 5 | Prov 6 | Prov 7 | Prov 8 | Exempel 9 | Prov 10 | Exempel 11 | Prov 12 |
| B | S503 | Prov 13 | Prov 14 | Prov 15 | Prov 16 | Prov 17 | Prov 18 | Prov 19 | Prov 20 | Prov 21 | Prov 22 | Prov 23 | Prov 24 |
| C | S505 | Prov 25 | Prov 26 | Prov 27 | Prov 28 | Prov 29 | Prov 30 | Prov 31 | Prov 32 | Prov 33 | Prov 34 | Prov 35 | Prov 36 |
| D | S506 | Prov 37 | Prov 38 | Prov 39 | Prov 40 | Prov 41 | Prov 42 | Prov 43 | Prov 44 | Prov 45 | Prov 46 | Prov 47 | Prov 48 |
| E | S507 | Prov 49 | Prov 50 | Prov 51 | Prov 52 | Prov 53 | Prov 54 | Prov 55 | Prov 56 | Prov 57 | Prov 58 | Prov 59 | Prov 60 |
| F | S508 | Prov 61 | Prov 62 | Prov 63 | Prov 64 | Prov 65 | Prov 66 | Prov 67 | Prov 68 | Prov 69 | Prov 70 | Prov 71 | Prov 72 |
| G | S510 | Prov 73 | Prov 74 | Prov 75 | Prov 76 | Prov 77 | Prov 78 | Prov 79 | Prov 80 | Prov 81 | Prov 82 | Prov 83 | Prov 84 |
| H | S511 | Prov 85 | Prov 86 | Prov 87 | Prov 88 | Prov 89 | Prov 90 | Prov 91 | Prov 92 | Prov 93 | Prov 94 | Prov 95 | Prov 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indexera uppsättning C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | Prov 4 | Prov 5 | Prov 6 | Prov 7 | Prov 8 | Exempel 9 | Prov 10 | Exempel 11 | Prov 12 |
| B | S515 | Prov 13 | Prov 14 | Prov 15 | Prov 16 | Prov 17 | Prov 18 | Prov 19 | Prov 20 | Prov 21 | Prov 22 | Prov 23 | Prov 24 |
| C | S516 | Prov 25 | Prov 26 | Prov 27 | Prov 28 | Prov 29 | Prov 30 | Prov 31 | Prov 32 | Prov 33 | Prov 34 | Prov 35 | Prov 36 |
| D | S517 | Prov 37 | Prov 38 | Prov 39 | Prov 40 | Prov 41 | Prov 42 | Prov 43 | Prov 44 | Prov 45 | Prov 46 | Prov 47 | Prov 48 |
| E | S518 | Prov 49 | Prov 50 | Prov 51 | Prov 52 | Prov 53 | Prov 54 | Prov 55 | Prov 56 | Prov 57 | Prov 58 | Prov 59 | Prov 60 |
| F | S520 | Prov 61 | Prov 62 | Prov 63 | Prov 64 | Prov 65 | Prov 66 | Prov 67 | Prov 68 | Prov 69 | Prov 70 | Prov 71 | Prov 72 |
| G | S521 | Prov 73 | Prov 74 | Prov 75 | Prov 76 | Prov 77 | Prov 78 | Prov 79 | Prov 80 | Prov 81 | Prov 82 | Prov 83 | Prov 84 |
| H | S522 | Prov 85 | Prov 86 | Prov 87 | Prov 88 | Prov 89 | Prov 90 | Prov 91 | Prov 92 | Prov 93 | Prov 94 | Prov 95 | Prov 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indexera uppsättningen D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | Prov 4 | Prov 5 | Prov 6 | Prov 7 | Prov 8 | Exempel 9 | Prov 10 | Exempel 11 | Prov 12 |
| B | S515 | Prov 13 | Prov 14 | Prov 15 | Prov 16 | Prov 17 | Prov 18 | Prov 19 | Prov 20 | Prov 21 | Prov 22 | Prov 23 | Prov 24 |
| C | S516 | Prov 25 | Prov 26 | Prov 27 | Prov 28 | Prov 29 | Prov 30 | Prov 31 | Prov 32 | Prov 33 | Prov 34 | Prov 35 | Prov 36 |
| D | S517 | Prov 37 | Prov 38 | Prov 39 | Prov 40 | Prov 41 | Prov 42 | Prov 43 | Prov 44 | Prov 45 | Prov 46 | Prov 47 | Prov 48 |
| E | S518 | Prov 49 | Prov 50 | Prov 51 | Prov 52 | Prov 53 | Prov 54 | Prov 55 | Prov 56 | Prov 57 | Prov 58 | Prov 59 | Prov 60 |
| F | S520 | Prov 61 | Prov 62 | Prov 63 | Prov 64 | Prov 65 | Prov 66 | Prov 67 | Prov 68 | Prov 69 | Prov 70 | Prov 71 | Prov 72 |
| G | S521 | Prov 73 | Prov 74 | Prov 75 | Prov 76 | Prov 77 | Prov 78 | Prov 79 | Prov 80 | Prov 81 | Prov 82 | Prov 83 | Prov 84 |
| H | S522 | Prov 85 | Prov 86 | Prov 87 | Prov 88 | Prov 89 | Prov 90 | Prov 91 | Prov 92 | Prov 93 | Prov 94 | Prov 95 | Prov 96 |
Tabell 3. Mall för olika Index arrangemang
Figur 2 : Ett standard diagram genereras med Ct värderingar normer. Använda standardkurvan intercept och lutning värden för att bestämma genomsnittliga bibliotek koncentration från Ct-värde prov bibliotek i dubbletter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mått | Standart värderar | Värden som erhålls (genomsnitt) |
| Avkastning | 32,5-50 Gb för mitten av utgång | 42 Gb för mitten av utgång |
| 100-130 Gb för hög uteffekt | 120 Gb för hög uteffekt | |
| Procentandel Q30 | ≥ 75% | 80% |
| Klustret densitet | 170-230 K/mm2, Optimal på 200 K/mm2 | 210 K/mm2. |
| Kluster som passerar filter | > 70% | 89,09% |
| Intensitet av cykel | Över 1000 för varje bricka i flowcell | Över 1500 för varje bricka i flowcell |
| Felprocent | Under 1.5 | 1.4 |
Tabell 4. Mätvärden för en standard sekvensering kör i bänkmonterade Sequencer
Figur 3 : Sekvensering Data analysprogram. (A) skapa ett önskat arbetsflöde inklusive sekvens trimning, mappning till referens och kvalitet baserad variant upptäckt. Kör arbetsflöde genom att välja FASTQ exempelfilerna (enskilda eller flera prover i batch). (B) lista över strukturella varianter visar referenspositionen, täckning, nukleotid årsförändring och aminosyra som erhållits för analys av prov sekvenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1. Beskär sekvenser | Inställningen används |
| Trimma baser | Förvalda inställningar |
| Filtrera efter längd med maximalt antal nukleotid i läsningar | 1000 |
| Filtrera efter längd med minsta antal nukleotid i läsningar | 50 |
| 2. kartläggning läsningar att referera | |
| Referens som valts | CBS138 |
| Referens maskering med maskering läge | Ingen maskering |
| Mappning alternativ | Förvalda inställningar |
| 3. lokala uträtning | |
| Justeringsinställningar | Förvalda inställningar |
| 4. kvalitet baserat Variant upptäckt | |
| Stadsdelen radie | 5 |
| Minsta gapet och mismatch räkna | 2 |
| Minsta stadsdelen kvalitet | 15 |
| Minsta centrala kvalitet | 20 |
| Läs filter | Förvalda inställningar |
| Minimitäckning | 4 |
| Minsta variant frekvens (%) | 75 |
| Variant filter | Förvalda inställningar |
| Högsta förväntade alleler (ploiditeten) | 2 |
| Genetiska koden | Standard |
Tabell 5. Arbetsflödesparametrar och inställningar i programvaran
| Strukturella Variant nucleotiden Position | Gene | Droger | Funna i Antal Isolat |
Resistenta isolat | Känsliga isolat | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, VRC, ITR | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 5 | CMRL-6, CMRL-12 | CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 4 | CMRL-7 | CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
Tabell 6. Rapport om strukturella variant position i gener kopplade till svampdödande läkemedelsresistens Funna i antalet isolat av C. glabrata
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie fastställt genomförbarhet, ungefärliga tidslinjer och precision av WGS-guidad upptäckt av läkemedelsresistens i C. glabrata. Handläggningstid (TAT) för bibliotek förberedelse och sekvensering var fyra dagar och rapportering av analyserade resultaten one-two dagar. Detta kan jämföras med minst ett liknande belopp TAT för känslighet analyser från kultur plattor och Sanger sekvensering med betydligt högre antal prover. Runt 30-90 C. glabrata genomen kan sekvenseras baserat på sekvensering flöde-cell kapacitet, med 80-100% sekvensering täckning. Eftersom sekvenseringen utfördes på en in-house WGS laboratoriet setup, kostnader/resurskraven i denna studie var motsvarar nuvarande kostnaderna för Sanger ordningsföljd och sonden-baserade analyser med en beräknad kostnad av AUD 80-100 per prov. Känslighet av alla isolat bestämdes genom en kommersiell assay kit som lästs visuellt med en läsning spegel. Kultur tillväxt indikerades av förändring i kolorimetriska tillväxt indikatorn från blått till rosa. MIC lästes som den första blå väl efter en serie av rosa (tillväxt) brunnar dvs den lägsta koncentrationen av svampdödande agent som kraftigt hämmar tillväxten. För WGS utarbetades genomisk DNA bibliotek med hjälp av bibliotek förberedelser kit. Isolera biblioteken kvantifierades av qPCR. De kvantifierade bibliotek var poolade tillsammans för den slutliga sekvensering kör utförs i bänkmonterade sequencer.
I vår analys, förekomsten av SNP i gener som ger resistens i isolat korrelerade väl med den förhöjda i vitro MIC mot droger. MutationernaS629P i FKS1 och S663P i FKS2 identifieras var klart associerade med resistens mot echinocandiner. Både mutationer är kända att ge fenotypisk resistens29,30. Samtidiga genome-wide sekvensering avslöjade också mutationer i gener kopplade till 5-flucytosin (genen FCY2) och azol motstånd (CgPDR1, CgCDR1 och CgFLR1) som är associerade med resistens genom aktivering / överuttryck som efflux pumpar26,27,28. Dock analyserar effekterna av mutationer i gener kopplade till azol och 5-flucytosin motstånd31 behöver bekräftas av ytterligare funktionella för att bedöma gen uttryck. Intressant nog hittades stort antal SNPs också i cellväggen adhesiner i alla isolat32,33. Mutationer i vidhäftning genen EPA6, som kodar biofilm bildning, förekom relativt ofta33. Dessutom isolerar CMRL-3, CMRL-4 och CMRL-8 att saknade mutationer i gener som azol motstånd hade inga dokumenterade SNP i EPA1 och EPA624,34. Dock sammantaget kunde inga specifika association mellan SNP i adhesiner och drog MICs hittas på grund av det låga antalet test isolat inkluderade.
Genomförandet av WGS i klinisk mykologi kräver genomförandet av robust kvalitetsledningssystem. Hög kvalitet genomisk DNA och kvalitetskontroll kontrollpunkter som följer varje steg i experimentet är viktigt för ett bra WGS-resultat. Renhet av C. glabrata sample DNA lämnas i biblioteket förberedelse kan valideras med UV-absorbans metod (absorbans vid 260/280 nm och 260/230 nm25. Vår erfarenhet för C. glabrata DNA förväntas den 260/280 ligga inom rekommenderade för 1,8-2 och 260/230 mellan 2-2.2. Om DNA extrakt inte uppfyller dessa krav på kvalitet, kan ytterligare rening av etanol nederbörd utföras. Tagmentation är ett viktigt steg för att lägga till unik streckkod sekvenser så som möjliggör differentiering av flera prov under sekvensering (multiplexing) kallade index primers. Därav, i indexeringsprocessen extra försiktighet måste iakttas att undvika korskontaminering mellan index rör och prover för att upprätthålla unika i indexen. Normalisering i sekvensering säkerställer att eventuella skillnader i provet DNA bibliotek som skulle införa bias i sekvensering data elimineras. En normalisering steg med en pärla baserat sanering tillåter vanligtvis avlägsnande av överflödigt DNA bibliotek fragment och variationer i biblioteket storlek som kan uppstå under bibliotek beredning. Därför är 30 min ruvning avgörande för optimal kluster densitet. Klustret densitet som är tätheten av klonala kluster av prov bibliotek genereras av massiva förstärkning under sekvensering influenser datakvalitet som Q30 noter och totala datautgång. Medan underclustering kan ge hög datakvalitet, det kommer också att resultera i lägre data utgång medan overclustering låg Q30 poäng. DNA biblioteken bör vara fri från magnetiska pärla rester under PCR-rensning och normalisering som som kan störa sekvensering datakvalitet. QPCR bör utföras på minst ett par representativt urval bibliotek inklusive en referensstam som positiv kontroll (ATCC stam av C. glabrata i detta fall) från en viss uppsättning index. De genomsnittliga Ct-värdena bör vara mellan 15-18 cykler. Varje prov inom denna spänner är godtagbar för sekvensering körningen. Dock om de Ct-värdena är utanför detta område bör qPCR upprepas. Prover kan ibland misslyckas qPCR på grund av låg kvalitet input DNA eller fel under bibliotek beredning. Baserat på beräkningar från den positiva kontrollen, bör den lägsta koncentrationen av bibliotek som kommer att producera bra sekvensdata fastställas. Använder den genomsnittliga koncentrationen av de bibliotek som erhållits från qPCR, kan volymen av slutliga bibliotek som ska läggas till för sekvensering beräknas. Detta bör ge den rekommendera sista bibliotek koncentrationen mellan 1,4 - 13 8:. För C. glabrata bibliotek, etablerade Ct spänna med isolatet av C. glabrata ATCC var mellan 16-18 cykler med en genomsnittlig bibliotek koncentrationsintervall 300-500 pM. Motsvarande volym av poolade denaturerade DNA bibliotek var inom spänna av 60-65 µL för ett kluster densitet intervall mellan 200-250 K/mm2.
Datafilerna som sekvens bör vara demultiplexed innan ytterligare analys. Detta kan uppnås genom att sortera i sina respektive bibliotek använder deras streckkoder efter sekvenseringen har ägt rum. Ett valfritt steg av kvalitet trimning av FASTQ filer kan utföras innan dataanalys. Den sekvens läser av isolaten från WGS analyserades med hjälp av ett anpassat arbetsflöde som skapade i ett standard programpaket. Detta tillät putsning av låg kvalitet läsningar och sedan mappa till referensen Candida genomet. Referens genomet, CBS138, hämtades från Candida genomet databas (CGD) och kopplade till arbetsflödet före analys. Förekomst av DNA upprepas i Candida genomet (exempelvis adhesin gener har DNA repetitioner) kan komplicera anpassningen av kort-Läs sekvenser och SNP kallelse. Detta kan förbättras genom den ytterligare lokala omgruppering av mappade sekvenser. Utdata från arbetsflödet var en strukturella varianter lista som kommenterade gener med icke-synonymt och synonymt SNP positioner och täckning. Detta användes för att identifiera SNP i gener av intresse och förbereda slutliga analysrapporten för isolaten (tabell 6).
Vissa begränsningar i vår studie och förhållningssätt bör erkännas. Vår rapport är baserad på litet antal isolat och det finns ingen standard svamp resistome databas för klinisk mykologi. Även om Sanger DNA-sekvensering är för närvarande mer tillgänglig för kliniska laboratorier, det har begränsad förmåga att samtidigt upptäcka flera genmutationer som medför resistens i Candida spp. (> 20 FKS mutationer för echinocandin resistans ensam). Med konsolidering av patologi tjänster och minskande sekvensering kostnader, praktiskhet med att använda WGS över Sanger sekvensering, kommer sannolikt att öka. En viktig faktor är dock den inledande laboratoriet setup och genomförandekostnaden WGS instrument samt utbildning av laboratoriepersonal. Lång sikt kostnaderna i huvudsak inbegriper upphandlar sekvensering reagens kit och tillbehör. Extra kostnad och en högre TAT bör förväntas om WGS instrumentet inte är in-house. Dessutom kan förekomsten av upprepade DNA-sekvenser i genomet komplicera anpassningen av kort-Läs sekvenser och SNP kallelse. Tillgången på högkvalitativa referens genomen sekvenserade använder lång-Läs teknik hjälper till att upprätthålla kvaliteten på SNP identifiering.
I framtiden förväntas WGS medföra förbättringar i klinisk behandling av snabb-tracking rapportering tid i diagnostikinställningar som är lättillgänglig och tolkas av kliniker20,22. Detta kan uppnås med utveckling av kurator och aktuell WGS svampdödande läkemedel resistens databaser roman och bekräftande mutationer att härleda svampdödande motstånd. Som mer genomen hos kliniskt relevanta jäst av kända fenotypiska drog känslighet blir tillgängliga för analys, är romanen markörer och svampdödande läkemedel resistensmekanismer sannolikt att upptäckas. Denna utveckling kommer att avsevärt minska riskerna med behandlingssvikt på grund av multi läkemedelsresistens och drog toxicitet. Sammanfattningsvis ger nästa generations sekvensering med lämplig kvalitet hanteringsprotokoll genome-wide detektering av mutationer ger resistens i Candida glabrata som kan öka fenotypiska tester i mykologi laboratorier. De insikter som tillhandahålls av snabba Genomsekvensering av kliniskt relevanta Candida spp kan fundamentalt ändra förståelsen av mekanismer för resistens till olika klasser av antimykotika och förbättra hanteringen av patienter med invasiv svampsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen och någon intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av centrum för infektionssjukdomar och mikrobiologi, folkhälsa. Författarna har inte fått någon annan finansiering för denna studie. Författarna tackar Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann och Ranjeeta Menon för deras expertråd och hjälp med hela genomet sekvensering experimentet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R.
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J.
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al.
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
