Tüm genom sıralama Candida glabrata algılama, işaretçileri, Antifungal ilaç direnci için
Summary
Bu çalışmada Candida glabrataantifungal ilaç direnci veriyor genlerdeki mutasyonlar çözümlenmesi için tüm genom sıralama uygulanmaktadır. C. glabrata yalıtır echinocandins, azoles ve 5-flucytosine, dayanıklı metodoloji göstermek için sıralı. Duyarlılık profilleri varlığı ya da yokluğu genler belirli mutasyon desenleri ile ilişkili yalıtır.
Abstract
Candida glabrata hızla ilaç direnci, özellikle azoles ve echinocandins neden mutasyonlar elde edebilirsiniz. Direnç vitro kez klinik başarısızlık ile ilişkili olduğu tespit gibi Genetik mutasyonlar tanımlanması önemlidir. Genom geniş analizi C. glabrataantifungal ilaç direnci için tüm genom sıralama (WGS) kullanarak fizibilite inceledi. Amaç torecognize yardımcı teknolojiler ve engelleri WGS uygulamasında ve onun etkinliğini ölçmek. Bu kağıt anahtar kalite kontrol kontrol noktaları ve genetik işaretler antifungal ajanları düşük duyarlılık ile ilgili araştırmaya WGS metodolojisi temel bileşenlerine önerilmektedir. Ayrıca veri analizi doğruluğunu ve dönüş çevresinde-test zamanı tahmin ediyor.
12 klinik fenotipik duyarlılık ve C. glabrata bir ATCC suşu antifungal duyarlılık testi ile tespit edilmiştir. Dahil bu üç çift, uyuşturucu minimum inhibitör konsantrasyonu artış geliştirilmiş üç hastalardan izole et. İki çift olarak ikinci izole echinocandins her çift geliştirilen direnç. Üçüncü çiftinin ikinci izole 5-flucytosine direnç geliştirmiştir. Kalan duyarlı ve azole dayanıklı yalıtır oluşur. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) echinocandin, azole ve 5-flucytosine direnç bağlantılı genlerdeki dayanıklı yalıtır WGS sonraki nesil sıralama kullanarak üzerinden teyit edildi. Sigara eşanlamlı SNPs antifungal direnç genleri FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 ve FCY2 gibi tespit edildi. Genel olarak, ortalama % 98 oranında başvuru genom ile yaklaşık 75-fold okuma derinlik örtmek için eşlenen C. glabrata yalıtır WGS okur. Gerçekleştirme süresi ve maliyeti Sanger için karşılaştırılabilir sıralama.
Sonuç olarak, C. glabrata WGS klinik olarak anlamlı gen mutasyonlarının farklı antifungal ilaç sınıfları birden fazla PCR/DNA sıralama reaksiyonlar için gerek kalmadan direnç yer vermeden mümkün. Bu WGS yeteneklilik içinde eşzamanlı antifungal direnç saldırıyı oyuncu değişikliği algılanması için klinik laboratuvar kurulması yolunda olumlu bir adım temsil eder.
Introduction
Candida glabrata giderek karşılaşılan bir patojen azoles yanı sıra son zamanlarda, echinocandins1,2,3direnç sergileyen bir tür olarak öneme sahip olduğunu. Diploit C. albicans, C. glabrata haploit genom mutasyonlar elde etmek ve çoklu ilaç direnci daha kolay geliştirmek için izin verebilir. Co direnç için her iki ilaç sınıfları Ayrıca olmuştur4bildirdi. Bu nedenle, erken antifungal duyarlılık değerlendirilmesi ve C. glabrata ilaç direnci tespiti doğru hedeflenen tedavisi için Antimikrobiyal direnç1 sürücüleri sınırlamak için antifungal yönetimi bağlamında olduğu gibi çok önemlidir , 5 , 6. hızla direnç biyolojik olarak dirençli yalıtır bağlı doğrulama mutasyonların varlığı da reçete artırmak için yardımcı kararlar olduğunu algılar için etkin bir iş akışı ve klinik sonuçlar oluşturma.
Antifungal duyarlılık genellikle bir uyuşturucu ücretsiz büyüme ile karşılaştırıldığında bir mikroorganizma gelişimini önemli bir azalma sonucunda en düşük ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanan minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) ölçülerek değerlendirilir Denetim. Klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) ve Avrupa Komitesi antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST) üzerinde duyarlılık testi yöntemleri mikrofon tespiti yapmak için standartlaşmış daha doğru ve tutarlı7, 8. Ancak, antifungal mikrofon yarar özellikle inter-laboratory karşılaştırmalar açısından çeşitli metodolojiler ve koşullar kullanılan9nerede özellikle echinocandins için sınırlı kalır. Ayrıca mikrofon belirsiz ilişki echinocandin tedavi ve yetersizlik WT ayırt etmek için yanıt ile olduğunu (ya da duyarlı) bu FKS mutasyonlar (echinocandin dirençli suşların)10,11yataklık yalıtır. Doğrulayıcı tek gen PCR ve Sanger rağmen antifungal direnç işaretleri sıralama, sonuçları gerçekleştirilmesinin kez nedeniyle birden fazla direnç işaretleri5,12eşzamanlı Algılama eksikliği gecikir. Bu nedenle, tüm genom analizi tarafından-dayandırılmış, etkin genom, farklı yerlerdeki direnci veriyor mutasyonların eş zamanlı algılama güncel yaklaşımları önemli avantajlar sunmaktadır.
(WGS) sıralama tüm genom genom genelinde risk değerlendirme ve ilaç direnci bakteri ve virüsleri13‘ te test için bir yaklaşım yanı sıra hastalık iletim sırasında salgınlar izlemek için başarıyla uygulamaya konmuştur. Nükleik asit sıralama teknolojisindeki son gelişmeler tüm genom sıralama (WGS) patojenler bir klinik olarak dava açmak-çevresinde-zamanında hem teknik hem de ekonomik açıdan uygulanabilir yaptık. DNA sıralama patojen kimlik ve Mikrobiyoloji laboratuvarları14,15,16‘ istihdam karakterizasyonu diğer yöntemler üzerinde önemli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, yüksek işlem hacmi, hız ve kalite ile evrensel bir çözüm sağlar. Sıralama mikroorganizmaların için uygulanabilir ve yerel veya bölgesel laboratuarlarında ölçek ekonomileri sağlar. İkinci olarak, ulusal ve uluslararası düzeyde karşılaştırma için mükellef bir ‘gelecek-proof’ biçiminde veri üretir. Son olarak, WGS potansiyel yarar tıpta genel veri tabanları ek klinik ve epidemiyolojik meta veriler17 içeren eşdeğer veri tabanları için bağlı başvuru genleri içeren hızlı büyüme tarafından artar ,18.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda WGS yarar antifungal direnç işaretleri Candida sppklinik yalıtır üzerinden tanımlaması için göstermiştir. 10 , 19 , 20. bu çoğunlukla yüksek-den geçerek benchtop sıralayıcılar, kurulan Biyoinformatik boru hatları ve21,22sıralama maliyeti azalan durumu nedeniyle olduğunu. Avantajı mantar WGS Sanger sıralama WGS sıralama birden çok genleri bir tek kaçak sağlanmıştır. Buna ek olarak, WGS Candida genleri roman mutasyonların uyuşturucu hedefleri belirlemek, genetik evrim ve klinik sıra türleri20,22,23ortaya çıkması izleyebilirsiniz. En önemlisi, içsel tedavisine direnç durumlarda, erken teşhis tedavi seçimi22,24önce direnç veriyor mutasyonların WGS yardımcı olabilir.
Burada, WGS etkin tarama antifungal ajanların farklı sınıflar için ilaç direnci ile ilgili mutasyonlar için fizibilite inceledi. Biz bir metodoloji WGS uygulanması son kullanıcı ve tanılama Mikoloji laboratuvar bakış açıları için mevcut. Biz üç üç ayrı klinik durumlarda hangi vitro echinocandins ve 5-flucytosine direnç antifungal tedavi aşağıdaki zaman içinde geliştirilen kültürlü çiftleri ayırmak bu analizde dahil.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, fizibilite, yaklaşık zaman çizelgeleri ve hassas WGS-güdümlü algılama C. glabratailaç direnci belirledi. Kütüphane hazırlık ve sıralama gerçekleştirme süresi (TAT) dört gün ve raporlama analiz sonuçları iki gün oldu. Bu kültür plakaları ve Sanger duyarlılık deneyleri için benzer en az bir miktar TAT ile karşılaştırır anlamlı olarak daha yüksek sayıda örnekleri sıralama. Yaklaşık 30-90 C. glabrata genleri hücre içi akış kapasitesi, 80-%100 sıra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser enfeksiyon hastalıkları ve Mikrobiyoloji, halk sağlığı Merkezi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar bu çalışma için diğer bir fon almadım. Yazarlar Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann ve Ranjeeta Menon onların uzman tavsiyesi ve tüm genom sıralama deney ile yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
