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रोधी दवा प्रतिरोध के मार्करों का पता लगाने के लिए Candida glabrata के पूरे जीनोम अनुक्रमण

Published: December 28, 2017 doi: 10.3791/56714
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 4,5, 6, 7, 1,3, 1,2,3
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology-Public Health, Westmead Hospital, 2Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, ICPMR, 3Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity, The University of Sydney, 4Department of Microbiology and Infectious Diseases, Canberra Hospital and Health Services, Australian National University Medical School, 5Infection Management Services, Australian National University Medical School, 6Department of Microbiology and Infectious Diseases, St. Vincent's Hospital, 7Department of Infectious Diseases, Peter MacCallum Cancer Centre
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन के Candida glabrataमें रोधी दवा प्रतिरोध को प्रदान जीन में उत्परिवर्तनों के विश्लेषण के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण लागू किया । C. glabrata echinocandins, azoles और 5-flucytosine के लिए प्रतिरोधी अलग, पद्धति को वर्णन करने के लिए अनुक्रम थे । अलग की संवेदनशीलता प्रोफाइल की उपस्थिति या जीन में विशिष्ट उत्परिवर्तन पैटर्न के अभाव के साथ संबंधित ।

Abstract

Candida glabrata तेजी से उत्परिवर्तनों कि दवा प्रतिरोध में परिणाम प्राप्त कर सकते हैं, विशेष रूप से azoles और echinocandins के लिए । आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की पहचान आवश्यक है, के रूप में इन विट्रो में पाया प्रतिरोध अक्सर नैदानिक विफलता के साथ संबद्ध किया जा सकता है । हम C. glabrataमें रोधी दवा प्रतिरोध के जीनोम चौड़ा विश्लेषण के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) का उपयोग करने की व्यवहार्यता की जांच की । उद्देश्य torecognize सक्षमीकरण और कार्यांवयन WGS में बाधाओं और इसके प्रभाव को मापने था । यह कागज कुंजी गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों और WGS पद्धति के आवश्यक घटकों की रूपरेखा के लिए आनुवंशिक मार्कर रोधी एजेंटों को कम संवेदनशीलता के साथ जुड़े जांच । यह भी डेटा विश्लेषण और बारी-परीक्षण के आसपास के समय की सटीकता का अनुमान है ।

12 नैदानिक की Phenotypic संवेदनशीलता, और सी. glabrata के एक ATCC तनाव रोधी संवेदनशीलता परीक्षण के माध्यम से निर्धारित किया गया था । ये तीन अलग जोड़े शामिल, तीन रोगियों से, कि दवा ंयूनतम निरोधात्मक सांद्रता में वृद्धि विकसित की है । दो जोड़े में, प्रत्येक जोड़ी के दूसरे अलग echinocandins के लिए प्रतिरोध विकसित की है । दूसरी तीसरी जोड़ी के अलग प्रतिरोध विकसित 5-flucytosine । अतिसंवेदनशील और अज़ोल प्रतिरोधी अलग शामिल शेष । echinocandin, अज़ोल और 5-flucytosine प्रतिरोध से जुड़े जीन में सिंगल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs) को अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करके WGS के माध्यम से अलग किया गया प्रतिरोधी में पुष्टि की गई । FKS1, FKS2,   CgPDR1, CgCDR1 और FCY2 जैसे रोधी प्रतिरोधक जीन में गैर-पर्यायवाची SNPs की पहचान की गई. कुल मिलाकर, WGS के ९८% की एक औसत सी. glabrata के बारे में ७५ के साथ संदर्भ जीनोम के लिए बदलाव समय और लागत सैंज अनुक्रमण के लिए तुलनीय थे ।

अंत में, सी glabrata के WGS नैदानिक महत्वपूर्ण जीन कई पीसीआर/डीएनए अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यकता के बिना विभिंन रोधी दवा वर्गों के विरोध में शामिल उत्परिवर्तनों खुलासा में संभव था । इस नैदानिक प्रयोगशाला में WGS क्षमता की स्थापना की दिशा में एक साथ रोधी प्रतिरोध का पता लगाने के लिए एक सकारात्मक कदम का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिस्थापन ।

Introduction

Candida glabrata एक तेजी से एक प्रजाति है कि azoles के लिए प्रतिरोध के रूप में के रूप में अच्छी तरह से और अधिक हाल ही में प्रदर्शन के रूप में महत्व के साथ रोगज़नक़ है, echinocandins1,2,3। द्विगुणित सी. albicansके विपरीत, सी. glabrata के अगुणित जीनोम यह उत्परिवर्तनों के अधिग्रहण और बहु दवा प्रतिरोध और अधिक आसानी से विकसित करने के लिए अनुमति दे सकता है । दोनों दवा वर्ग के सह-विरोध को भी4बताया गया है । इसलिए, रोधी संवेदनशीलता के प्रारंभिक मूल्यांकन और सी. glabrata में दवा प्रतिरोध का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है सही, लक्षित चिकित्सा के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोधी प्रबंध के संदर्भ में रोगाणुरोधी प्रतिरोध के ड्राइवरों की सीमा1 , 5 , 6. एक कुशल कार्यप्रवाह की स्थापना के लिए तेजी से प्रतिरोधी पुष्टि में प्रतिरोध से जुड़े उत्परिवर्तनों की उपस्थिति का पता लगाने के अलग भी निर्णय विहित और नैदानिक परिणामों में सुधार करने में मदद मिलेगी ।

रोधी संवेदनशीलता आमतौर पर ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) जो सबसे कम दवा एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है मापने के द्वारा मूल्यांकन है कि एक सूक्ष्मजीवों के विकास में एक महत्वपूर्ण कमी में एक दवा मुक्त विकास के साथ तुलना में परिणाम नियंत्रण. नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान (CLSI) और रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (EUCAST) पर यूरोपीय समिति MIC निर्धारण अधिक सटीक और लगातार7बनाने के क्रम में मानकीकृत संवेदनशीलता परीक्षण तरीकों है, 8. हालांकि, रोधी MIC की उपयोगिता विशेष रूप से echinocandins के लिए सीमित रहता है, के साथ विशेष रूप से अंतर-प्रयोगशाला तुलना करने का संबंध है जहां अलग तरीके और शर्तों के उपयोग कर रहे है9। echinocandin उपचार और WT भेद अक्षमता (या अतिसंवेदनशील) उन FKS उत्परिवर्तनों बंदरगाह (echinocandin प्रतिरोधी उपभेदों)10,11से अलग करने के लिए प्रतिक्रिया के साथ MICs के भी अनिश्चित सहसंबंध है । पुष्टि एकल जीन पीसीआर और रोधी प्रतिरोध मार्करों के सैंज अनुक्रमण की उपलब्धता के बावजूद, परिणाम की प्राप्ति अक्सर कई प्रतिरोध मार्करों5,12के एक साथ का पता लगाने की कमी के कारण देरी है । इसलिए, प्रतिरोध के समवर्ती का पता लगाने-जीनोम में विभिन्न स्थानों में उत्परिवर्तनों को प्रदान, पूरे जीनोम अनुक्रमण आधारित विश्लेषण द्वारा सक्षम, वर्तमान दृष्टिकोण पर महत्वपूर्ण लाभ देता है ।

पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) सफलतापूर्वक फैलने के दौरान रोग संचरण ट्रैक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीनोम व्यापक जोखिम मूल्यांकन और बैक्टीरिया और वायरस में दवा प्रतिरोध परीक्षण के लिए एक दृष्टिकोण13लागू किया गया है । न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के हाल ही में अग्रिमों दोनों तकनीकी और आर्थिक रूप से व्यवहार्य एक चिकित्सकीय कार्रवाई बारी में रोगजनकों के पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) बना दिया है । डीएनए अनुक्रमण रोगज़नक़ की पहचान के अन्य तरीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है और14,15,16सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में कार्यरत लक्षण वर्णन. सबसे पहले, यह उच्च प्रवाह, गति और गुणवत्ता के साथ एक सार्वभौमिक समाधान प्रदान करता है । sequencing सूक्ष्मजीवों के किसी भी करने के लिए लागू किया जा सकता है और स्थानीय या क्षेत्रीय प्रयोगशालाओं में पैमाने की अर्थव्यवस्थाओं की अनुमति देता है । दूसरा, यह एक ' भविष्य प्रूफ ' प्रारूप में डेटा का उत्पादन राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय स्तर पर तुलना के लिए उत्तरदायी । अंत में, चिकित्सा में WGS की संभावित उपयोगिता संदर्भ जीनोम युक्त सार्वजनिक डेटा ठिकानों की तेजी से वृद्धि के द्वारा संवर्धित किया गया है, जो समकक्ष डेटा ठिकानों है कि अतिरिक्त नैदानिक और महामारी विज्ञान मेटाडाटा शामिल करने के लिए जोड़ा जा सकता है17 ,18.

हाल के अध्ययनों से नैदानिक Candida एसपीपीके अलग से रोधी प्रतिरोध मार्करों की पहचान के लिए WGS की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है । 10 , 19 , 20. यह ज्यादातर उच्च प्रवाह benchtop sequencers की उपलब्धता के कारण है, bioinformatics पाइपलाइन की स्थापना की और अनुक्रमण की लागत कम21,22। एक ही रन पर कई जीनोम के अनुक्रमण WGS की अनुमति देता है कि सैंज sequencing पर कवक WGS का लाभ यह है । इसके अलावा, Candida जीनोम के WGS दवा के लक्ष्यों में उपंयास उत्परिवर्तनों की पहचान कर सकते है आनुवंशिक विकास ट्रैक, और चिकित्सकीय प्रासंगिक अनुक्रम के उद्भव-प्रकार20,22,23। सबसे महत्वपूर्ण बात, आंतरिक बहुऔषध प्रतिरोध के मामलों में, WGS प्रतिरोध का जल्दी पता लगाने में सहायता कर सकते है-उत्परिवर्तनों इलाज के चयन से पहले22,24।

यहां, हम रोधी एजेंटों के विभिंन वर्गों के लिए दवा प्रतिरोध के साथ जुड़े उत्परिवर्तनों के लिए WGS सक्षम स्क्रीनिंग की व्यवहार्यता की जांच की । हम अंत उपयोगकर्ता और नैदानिक कवक प्रयोगशाला के दृष्टिकोण से WGS के कार्यांवयन के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं । हम तीन अलग नैदानिक मामलों जिसमें इन विट्रो में echinocandins और 5 के लिए प्रतिरोध-रोधी उपचार के बाद समय के साथ विकसित flucytosine से प्रसंस्कृत जोड़े को अलग इस विश्लेषण में शामिल थे ।

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Protocol

इस अध्ययन के लिए कोई नैतिक अनुमोदन आवश्यक नहीं था ।

1. Candida glabrata के लिए उपसंस्कृति और इनोक्युलम तैयारी

  1. C. glabrata के एक पैनल का चयन करने के लिए अलग से अध्ययन किया जा करने के लिए जो भी शामिल होना चाहिए कम से कम एक सी glabrata अमेरिकन प्रकार संस्कृति संग्रह (ATCC) ज्ञात संवेदनशीलता पैटर्न के साथ ।
  2. उपसंस्कृति एक एक बाँझ डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश का उपयोग कर एक कॉलोनी को छूने और एक Sabouraud डेक्सट्रोज आगर (SDA) प्लेट8पर धारिता से अलग ।
  3. अच्छी वृद्धि के साथ अलग की शुद्ध संस्कृति के लिए ३५ डिग्री सेल्सियस पर 24-48 घंटे के लिए SDA प्लेट मशीन ।

2. रोधी संवेदनशीलता का निर्धारण

  1. एक बाँझ डिस्पोजेबल प्लास्टिक लूप का प्रयोग करें लगभग 1 मिमी व्यास के 4-5 कालोनियों एक हौसले से उपसंस्कृत सी. glabrata SDA प्लेट पर अलग से लेने के लिए । बाँझ आसुत पानी की 3 मिलीलीटर में पुनर्स्थगित । कोमल pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण वर्दी निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
  2. ०.५ ट्विटर के लिए सेल घनत्व को समायोजित करें जो 1 x 106 के बराबर है 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल एक densitometer 8का उपयोग कर ।
  3. प्रदर्शन संवेदनशीलता वाणिज्यिक परख का उपयोग कर परीक्षण (सामग्री और रिएजेंट की तालिका देखें) पर सभी C. glabrata निंनलिखित निर्माता के निर्देशों को अलग । CLSI दिशानिर्देशों के अनुसार रोधी औषधों के परिणामी MICs के आधार पर अलग की संवेदनशीलता की व्याख्या करना और रिपोर्ट तैयार करना (तालिका 1)8.

3. अनुक्रमण के लिए जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण

  1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ५० mM EDTA के ३०० µ एल में एक हौसले से बढ़ी SDA प्लेट से कालोनियों के एक पाश reसस्पेंड ।
  2. zymolyase के ४० µ l जोड़ें (10 मिलीग्राम/एमएल) निलंबन करने के लिए, और धीरे प्लास्टिक 5 बार निलंबन तक वर्दी है ।
  3. सेल दीवार को पचाने के लिए 1-2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शांत ।
  4. 2 मिनट के लिए १४,००० × g पर निलंबन केंद्रापसारक और फिर ध्यान से supernatant हटा दें ।
  5. निकालने जीनोमिक डीएनए निंनलिखित डीएनए निष्कर्षण किट दिशानिर्देश (सामग्री की तालिका देखें) ।
  6. ५० में निकाला डीएनए गोली reसस्पैंड 10 मिमी Tris बफर के µ एल (पीएच 7.5-8.5) के बजाय रेफरेंस बफर किट में प्रदान की ।
  7. 260/280 एनएम25पर ऑप्टिकल घनत्व (ओ. डी.) की माप द्वारा डीएनए की शुद्धता की जांच करें ।

4. जीनोमिक डीएनए ठहराव

  1. एक 1x Tris EDTA (ते) परख प्रतिदीप्ति परख के लिए निर्माता के दिशा निर्देशों के आधार पर किट में उपलब्ध कराई बफर (सामग्री की तालिका देखें) तैयार करते हैं ।
  2. 1x ते परख बफर के ९८ µ l को 2 µ l को जोड़कर डीएनए नमूने को पतला करें (अंतिम मात्रा १०० µ l, कमजोर कारक 1:50) एक डिस्पोजेबल ९६ वेल प्लेट में. इस कमजोर पड़ने कदम प्रदर्शन किया जा सकता है या तो मैंयुअल रूप से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर या स्वचालित तरल हैंडलिंग कार्य केंद्र द्वारा ।
  3. प्रतिदीप्ति परख किट (तालिका 2) में दिए गए लैंब्डा डीएनए (१०० µ g/mL) को कमजोर करके मानकों की सीमा तैयार करें और नमूनों के साथ माप के लिए भी शामिल हों ।
  4. १०० µ एल के लिए फ्लोरोसेंट डाई के १०० µ एल जोड़ें डीएनए नमूने और प्रतिक्रिया के लिए मानकों को पतला । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन, प्रकाश से सुरक्षित ।
  5. निर्माता के दिशानिर्देशों के आधार पर सभी नमूनों के प्रतिदीप्ति को मापने ।
  6. प्रतिदीप्ति रीडिंग का उपयोग कर मानक वक्र साजिश और डीएनए नमूनों की मूल एकाग्रता की गणना ।
  7. डीएनए की मात्रा का निर्धारण और 10 मिमी Tris बफर (पीएच 8) ०.२ एनजी करने के लिए डीएनए एकाग्रता को समायोजित करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए/µ एल
  8. करने के लिए स्वचालित तरल हैंडलिंग कार्य केंद्र का उपयोग डीएनए कमजोर पड़ने । यह कदम मैनुअल pipetting से भी हासिल किया जा सकता है ।

5. डीएनए लाइब्रेरी की तैयारी

नोट: लाइब्रेरी तैयारी और अनुक्रमण निर्माता के प्रोटोकॉल और कंपनी (चित्रा 1ए) (सामग्री की तालिका देखें) द्वारा प्रदान किए गए दिशानिर्देशों के बाद किया गया था ।

  1. Tagmentation व पीसीआर प्रवर्धन
    1. लेबल एक नया ९६-अच्छी तरह से हार्ड खोल पतली दीवार की थाली ।
    2. ०.२ एनजी पर मात्रा इनपुट डीएनए के 5 µ एल जोड़ें/µ एल (कुल में 1 एनजी) प्लेट के प्रत्येक नमूने को अच्छी तरह से ।
    3. जोड़ें 10 µ एल के tagmentation बफर और 5 µ एल प्रवर्धन बफर के प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त डीएनए के लिए और धीरे मिश्रण करने के लिए पिपेट. एक चिपकने वाला प्लेट सील के साथ प्लेट सील ।
    4. एक थर्मल साइकिल चालक में थाली प्लेस और निंनलिखित पीसीआर कार्यक्रम चलाने के लिए: 5 मिनट के लिए ५५ ° c, और 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो । जब नमूना 10 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है, तुरंत बेअसर करने के लिए आगे बढ़ें ।
    5. amplicon प्रतिक्रिया बेअसर करने के लिए प्लेट के लिए बेअसर बफर के 5 µ एल जोड़ें, और धीरे पिपेट मिश्रण । प्लेट सील और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    6. नमूनों को अनुक्रमणी पीसीआर mastermix के 15 µ एल जोड़ें ।
    7. index प्राइमर ट्यूबों का एक सेटअप ९६ के लिए उपलब्ध की एक बॉक्स का प्रयोग करें-अच्छी तरह प्लेट प्रारूप इतना है कि प्रत्येक नमूने सूचकांक टेंपलेट (तालिका 3) के आधार पर सूचकांक का एक अनूठा संयोजन हो जाता है ।
    8. अनुक्रमणिका प्लेट रैक में index प्राइमर ट्यूबों की व्यवस्था (चित्रा 1बी) तालिका 3 पर टेम्पलेट में प्रदान की गई आदेश का उपयोग कर और टेम्पलेट पर सूचकांकों की स्थिति रिकॉर्ड.
    9. क्रम में सूचकांक ट्यूबों के साथ सूचकांक प्लेट रैक पर जोड़ा पीसीआर mastermix के साथ tagmentation प्लेट रखें ।
    10. डाल सूचकांक प्राइमर 1 ट्यूबों ऊर्ध्वाधर व्यवस्था में, और सूचकांक पुस्तक क्षैतिज व्यवस्था में 2 ट्यूबों सूचकांक रैक पर । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, ध्यान से प्रत्येक नमूने के लिए index प्राइमरों के 5 µ एल जोड़ें ।
    11. नई टोपियां के साथ सूचकांक ट्यूबों के पुराने टोपियां बदलें पार से बचने के लिए सूचकांक के बीच संदूषण ।
    12. ९६-अच्छी तरह से स्पष्ट प्लेट sealers का उपयोग कर प्लेट सील और इस प्रकार के रूप में दूसरी पीसीआर प्रदर्शन: ९५ ° c 30 s के लिए, ९५ ° c के 12 चक्र के लिए 10 s, ५५ ° c के लिए 30 s, ७२ ° c के लिए 30 s और ७२ ° c के लिए 5 min.
  2. पीसीआर सफाई
    1. पीसीआर के लिए पीसीआर प्रोडक्ट को ट्रांसफर करें-सफाई, tagmentation प्लेट से लेकर डीप वेल प्लेट तक (देखें सामग्री की टेबल) ।
    2. भंवर वाणिज्यिक चुंबकीय मोती समाधान (सामग्री की तालिका देखें) निर्माता के निर्देशों पर आधारित है और गहरी अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के लिए मोतियों की 30 µ एल जोड़ें ।
    3. 5 मिनट के लिए मिलाते बिना कमरे के तापमान पर 2 मिनट और गर्मी के लिए १८०० rpm पर एक microplate शेखर पर थाली शेक ।
    4. supernatant को मंजूरी दे दी है जब तक 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट रखें ।
    5. supernatant ध्यान से प्लेट के साथ अब भी चुंबकीय स्टैंड पर त्यागें ।
    6. चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट के साथ हौसले से तैयार ८०% इथेनॉल के २०० µ एल जोड़ें ।
    7. 30 एस के लिए चुंबकीय स्टैंड पर थाली मशीन और ध्यान से हटाने और मोतियों को परेशान किए बिना supernatant त्यागें ।
    8. फिर से धो कदम दोहराएं और मोतियों की अनुमति हवा के लिए सूखी 15 मिनट के लिए । अतिरिक्त इथेनॉल निकालें यदि कोई हो ।
    9. चुंबकीय स्टैंड से प्लेट निकालें और मोतियों को resuspension बफर के ५२.५ µ एल जोड़ें ।
    10. मिलाने के बिना 2 मिनट के लिए 2 मिनट और कमरे के तापमान पर गर्मी के लिए १८०० rpm पर एक microplate शेखर पर थाली शेक ।
    11. चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट लगाएं और supernatant को साफ करने की अनुमति दें ।
    12. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, सावधानी से supernatant की ५० µ l को क्लीनअप प्लेट से एक नई हार्ड-शेल प्लेट में स्थानांतरित करें ।
  3. पुस्तकालय सामान्यीकरण
    1. गल पुस्तकालय सामान्यीकरण निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार रिएजेंट (सामग्री की तालिका देखें).
    2. एक नई गहरी अच्छी तरह से प्लेट को क्लीनअप प्लेट से supernatant के 20 µ एल हस्तांतरण ।
    3. चुंबकीय मनका निलंबन के ४५ µ एल जोड़ें और एक थाली मुहर के साथ प्लेट सील ।
    4. 30 मिनट के लिए १८०० rpm पर एक microplate शेखर पर थाली शेक । इस मशीन समय महत्वपूर्ण है और पार नहीं किया जाना चाहिए ।
    5. 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट प्लेस और पुष्टि करें कि supernatant (चित्रा 1बी) को मंजूरी दे दी है ।
    6. निकालें और एक उपयुक्त खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में supernatant अभी भी चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट के साथ त्यागें ।
    7. चुंबकीय खड़े से थाली निकालें और ४५ µ एल धोने बफर के साथ मोती धो लो ।
    8. 5 मिनट के लिए १८०० rpm पर एक microplate शेखर पर धोने बफर के साथ प्लेट शेक ।
    9. 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट प्लेस और supernatant त्यागें जब यह स्पष्ट हो जाता है ।
    10. चुंबकीय स्टैंड से प्लेट निकालें और फिर धोने बफर के साथ धोने दोहराने ।
    11. चुंबकीय स्टैंड से प्लेट निकालें और ०.१ N NaOH के 30 µ l जोड़ें ।
    12. 5 मिनट के लिए १८०० rpm पर एक microplate शेखर पर ०.१ N NaOH के साथ प्लेट शेक और 2 मिनट या जब तक तरल स्पष्ट है के लिए चुंबकीय स्टैंड पर थाली जगह है ।
    13. एक नया ९६-अच्छी तरह से हार्ड शैल पतली दीवार अंतिम सामान्यीकृत पुस्तकालय प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए रेफरेंस बफर के 30 µ एल जोड़ें ।
    14. supernatant के 30 µ l को सामान्यीकरण प्लेट से अंतिम सामान्यीकृत लाइब्रेरी प्लेट में स्थानांतरित करें अंतिम मात्रा ६० µ l बनाने के लिए अब पुस्तकालयों को क्रमानुसार तैयार किया जाता है ।
  4. qPCR द्वारा डीएनए पुस्तकालय एकाग्रता का निर्धारण
    1. निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार qPCR किट में दिए गए mastermix, प्राइमरों और मानकों को गल (सामग्री की तालिका देखें) ।
    2. निर्माता के निर्देश के बाद qPCR किट में उपलब्ध कराई गई पीसीआर रिएजेंट mastermix और प्राइमर को संयोजित करें और aliquots को-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    3. डीएनए पुस्तकालय एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, एक 1:100 कमजोर पड़ने (१.५ µ एल डीएनए लाइब्रेरी १४८.५ µ एल Tris बफर) एक 1:80 कमजोर पड़ने से पीछा करके 10 मिमी Tris बफर (पीएच 8) का उपयोग कर डीएनए पुस्तकालयों के एक 1/8000 कमजोर पड़ने बनाने के लिए (2 µ एल 1:100 से १५८ µ एल Tris बफर) ।
    4. शेक ७०० rpm पर कमजोर पड़ने वाली प्लेट कम से कम 1 मिनट के लिए और फिर 1 मिनट के लिए १४००० × g पर केंद्रापसारक ।
    5. पतला डीएनए पुस्तकालय या डीएनए मानकों के 4 µ एल मिश्रण और mastermix के 16 µ एल के द्वारा अंतिम पीसीआर प्रतिक्रिया के 20 µ एल तैयार करें ।
    6. thermocycler में उपनिर्माता की सेटिंग्स के बाद पीसीआर प्रदर्शन: ९५ ° c 5 मिनट के लिए, ९५ डिग्री सेल्सियस के ३५ चक्र के लिए 30 एस और ६० ° c के लिए ४५ एस, और अंतिम ६५ ° c के लिए ९५ ° c पिघल वक्र विश्लेषण के लिए ।
    7. qPCR thermocycler से नमूना डीएनए पुस्तकालयों और मानकों के सीटी मूल्यों प्राप्त करें ।
    8. मानक वक्र (चित्र 2) मानक के सीटी मान से जनरेट करें । माध्य से ± 3 चक्र द्वारा ऊपरी और निचले QC रेंज को परिभाषित करें । उदाहरण के लिए, यदि मतलब सीटी मान 13 चक्र है तो QC रेंज 16 और 10 चक्र के बीच है ।
    9. मानक वक्र और सीटी मूल्यों से व्यक्तिगत और औसत पुस्तकालय सांद्रता (ALC) का निर्धारण ।
    10. लक्ष्य पुस्तकालय एकाग्रता 1.4-1.8 के बीच है पर विचार कर अंतिम अनुक्रमण के लिए नीचे दिए गए गणना के आधार पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए कुल परित पुस्तकालयों (पाल) की मात्रा निर्धारित करें ।
      नोट: औसत पुस्तकालय एकाग्रता से प्राप्त qPCR = ALC; कुल परित पुस्तकालयों (PAL) = ALC/ विकृत पाल (दल) = pal * ०.६६६
      बफर के साथ मिलाया जाता है कि दाल की मात्रा के आधार पर, प्रवाह सेल में जोड़ा जा करने के लिए पुस्तकालय की एकाग्रता है. उदाहरण के लिए, यदि लायब्रेरी के ६५ µ l को बफर के ८३५ µ l में जोड़ा जाता है, तो इस कमजोर पड़ने से (Dil 1) १९५ की कुल मात्रा में जोड़ा जाता है १३०० µ l: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = अंतिम एकाग्रता (1.4-1.8 के बीच होना चाहिए)

6. पुस्तकालय पूलिंग और Benchtop sequencer में अनुक्रमण की शुरुआत

  1. गल एजेंट कारतूस निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार । 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण से अपने पैकेज से एक नया प्रवाह सेल बाहर ले और अनुक्रमण करने से पहले कमरे के तापमान कम से कम 30 मिनट के लिए लाने के लिए । उपयोग करने से पहले बफर कारतूस और सर्द अनुक्रमण बफर बाहर ले लो (सामग्री की तालिका देखें) ।
  2. लाइब्रेरी के 5 µ एल (1 एनएम) और ०.२ एन NaOH के 5 µ एल को मिलाकर एक कंट्रोल लाइब्रेरी तैयार करें । भंवर संक्षेप में और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन को एक किस्में में नियंत्रण पुस्तकालय स्वभाव ।
  3. २०० मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7 और भंवर के 5 µ एल जोड़ें । जोड़ें २३५ µ एल ठंडा sequencing बफर और धीरे मिश्रण । कुल मात्रा 20 बजे नियंत्रण पुस्तकालय अंतिम एकाग्रता के साथ २५० µ एल है ।
  4. प्रत्येक नमूना पुस्तकालय के 5 µ एल स्थानांतरित करने के लिए एक एकल कम-बाइंड १.५ मिलीलीटर ट्यूब में अंतिम सामान्यीकृत पुस्तकालय प्लेट से अनुक्रम हो पूल डीएनए पुस्तकालयों ।
  5. एक और कम बांध ट्यूब में प्रकृति पुस्तकालयों के लिए ०.२ एन NaOH के 30 µ एल और परित पुस्तकालय के 30 µ एल जोड़ें ।
  6. भंवर कम-बांध ट्यूब और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक किस्में में पुस्तकालयों स्वभाव के लिए मशीन ।
  7. २०० mM Tris-HCl के 30 µ l जोड़ें, प्रतिक्रिया बेअसर करने के लिए विकृत पुस्तकालयों के साथ पीएच 7 के लिए ट्यूब ।
  8. तटस्थ विकृत पुस्तकालयों निलंबन के ६५ µ एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए पूर्व ठंडा sequencing बफर और भंवर के ८३५ µ एल ।
  9. एक अंतिम कम बांध ट्यूब में निंनलिखित गठबंधन: बेअसर विकृत पुस्तकालयों से १९५ µ एल, नियंत्रण पुस्तकालय के १.३० µ एल और अनुक्रमण बफर के ११०३.७० µ एल । ठीक से मिलाएं ।
  10. एजेंट कारतूस पर निर्दिष्ट स्थान में अंतिम पुस्तकालय मिश्रण (१३०० µ एल) लोड ।
  11. सेट अप अनुक्रमण परियोजना में प्रवेश करने और नमूना विवरण के sequencer नामित वेबसाइट निम्नलिखित दिशा निर्देशों में द्वारा संचालित.
  12. sequencing निंन दिशानिर्देशों को प्रारंभ करें । लोड फ्लो सेल, पुस्तकालयों और benchtop sequencer में बफर कारतूस के साथ एजेंट कारतूस ।
  13. सभी एजेंट किट और अनुक्रमण में इस्तेमाल कारतूस की रिकॉर्ड बैच संख्या ।

7. अनुक्रमण वेबसाइट से डेटा डाउनलोड

  1. वेबसाइट पर दिए गए निर्माता के निर्देश के बाद FASTQ फ़ाइलें डाउनलोड करें ।
  2. एक अच्छी गुणवत्ता चलाने के लिए जांच करें कि प्रतिशत Q30 ≥ ७५% है और क्लस्टर घनत्व 200-210 k/mm2 (तालिका 4) पर इष्टतम के साथ 170-280 K/mm2 के बीच है ।

8. अनुक्रमण डेटा विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण एकीकृत सॉफ्टवेयर पैकेज में अनुक्रम नमूनों की FASTQ फ़ाइलें आयात (सामग्री की तालिका देखें) ।
  2. तालिका 5 में सूचीबद्ध सेटिंग्स का उपयोग करके, संदर्भ (संदर्भ जीनोम का चयन करें), स्थानीय पुनर्संरेखण और भिन् न विश्लेषण (चित्र 3) को मैप करने वाली सूची से सुविधाएं जोड़कर सॉफ़्टवेयर में अनुक्रमण कार्यप्रवाह बनाएं ।
  3. कोई एकल नमूना या नमूना FASTQ फ़ाइलों का एक बैच का चयन करके कार्यप्रवाह चलाएँ और आउटपुट फ़ाइलें निर्दिष्ट नमूना फ़ोल्डर में सहेजें ।
  4. अनुक्रम कवरेज गहराई, मैप किए गए क्षेत्रों और जीनोम में संरचनात्मक वेरिएंट की सूची (चित्रा 3बी) के लिए रिपोर्ट उत्पन्न करते हैं ।
  5. संरचनात्मक वेरिएंट की सूची का प्रयोग करें प्रतिरोध और डाह प्रदान जीन में गैर पर्यायी एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs) के लिए खोज करने के लिए ।
  6. लिस्टिंग द्वारा रिपोर्ट तैयार SNP स्थान, जीन, और प्रतिरोधी या अतिसंवेदनशील की संख्या अलग (तालिका 6) ।

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Representative Results

तेरह सी. glabrata में शामिल सी. glabrata ATCC ९००३० और 12 को नैदानिक कवक संदर्भ प्रयोगशाला (अलग CMRL1 से CMRL12) से अलग किया गया है, Westmead अस्पताल, सिडनी (तालिका 1) अध्ययन किए गए. ये अलग CMRL के तीन जोड़े-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 और CMRL-5/CMRL-6 से पहले प्राप्त की और उन दोनों के बीच कोई महामारी विज्ञान के लिंक के साथ रोधी चिकित्सा के बाद 24 (तालिका 1) ।

MICs नौ रोधी एजेंटों के लिए CLSI interpretative विराम बिंदु का उपयोग कर निर्धारित किया गया अर्थात्, Amphotericin (अंब), Anidulafungin (ANI), Micafungin (MIF), Caspofungin (कैस), 5-Flucytosine (5-एफसी), Posaconazole (POS), Voriconazole (VRC), Itraconazole ( आईटीआर) और Fluconazole (FLC) । Candida parapsilosis ATCC २२०१९ और Candida krusei ATCC ६२५८ गुणवत्ता नियंत्रण उपभेदों के रूप में इस्तेमाल किया गया । अलग जोड़ी के अलावा, CMRL-1 और CMRL-2, दूसरा अलग CMRL-2 caspofungin के लिए प्रतिरोधी था (MIC 8 बनाम ०.१२ mg/L, तालिका 1) । CMRL-2 भी anidulafungin और micafungin के MICs में इसी तरह आनुपातिक बढ़ जाता था (≥ ०.५ mg/L) में जिसके परिणामस्वरूप इन विट्रो प्रतिरोध करने के लिए सभी तीन echinocandins24. इसी तरह, CMRL-4 अलग-अलग CMRL-3 (तालिका 1) की तुलना में echinocandin प्रतिरोध विकसित किया था । तीसरी जोड़ी के बीच, अलग CMRL-6 एक 5 flucytosine MIC था (> 64 बनाम ०.०६ mg/L)24। इन दोनों को अलग जोड़े अतिसंवेदनशील/जंगली-प्रकार (WT) अंय रोधी एजेंटों के लिए परीक्षण किया गया । अलग CMRL-6 और CMRL-12 सभी azoles के लिए प्रतिरोधी या गैर WT पाया गया । CMRL-7 के लिए प्रतिरोधी था fluconazole और गैर WT करने के लिए voriconazole (तालिका 1) । C. glabrata ATCC ९००३० और अलग CMRL-8 से CMRL-11 सभी रोधी एजेंटों को WT के लिए अतिसंवेदनशील/24।

WGS के 13 अलग benchtop sequencer का उपयोग किया गया था. एक औसत पर, एक मध्य उत्पादन अनुक्रमण चलाने, 0.5-1.4% के बीच एक त्रुटि दर के साथ 27-40 GB डेटा के आसपास झुकेंगे । औसत प्रतिशत Q30 प्राप्त आमतौर पर 80-85% के आसपास था । प्रवाह-सेल क्लस्टर घनत्व (K/mm2) 200-250 (तालिका 4) के बीच की श्रेणी में है । इस स्टडी से रॉ सीक्वेंस डेटा को प्रोजेक्ट नंबर PRJNA310057 के तहत NCBI सीक्वेंस रीडिंग आर्काइव (SRA) में जमा किया गया है । sequencing के ९८% एकीकृत डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण के माध्यम से C. glabrata संदर्भ जीनोम (तनाव CBS138) के लिए मैप की गई पढ़ता है । औसत पढ़ें गहराई कवरेज के साथ 75x था औसत पढ़ें लंबाई की १४३-bp. संरचनात्मक संस्करण का पता लगाने के प्रति अलग से अधिक ५०, 000 SNPs की पहचान की । विशेष रूप से, जब तनाव जोड़े CMRL1/CMRL-2 का विश्लेषण, कुल SNPs प्रत्येक अलग पर पाया ७९,००० के आसपास थे, CMRL के लिए-3/CMRL-4, SNPs की कुल संख्या ६०,००० के आसपास थे और CMRL के लिए-5/CMRL-6, ५६,००० से अधिक जब CBS13824की तुलना में । SNP अंतर जब एक तनाव जोड़ी में अलग के बीच तुलना में कम था 25 ।

अलग, ज्ञात प्रतिरोध की संवेदनशीलता प्रोफ़ाइल के आधार पर24विश्लेषण के लिए चुना गया, विशेष रूप से, FKS1, FKS2 और FKS3 (echinocandin प्रतिरोध), FCY1 और FCY2 (5- flucytosine प्रतिरोध), आणि ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 आणि CgFLR1 (अज़ोल प्रतिरोध). जीन ज्ञात उत्परिवर्तनों के लिए जांच की, और SNP घटनाओं की आवृत्ति थे । जीन में केवल गैर-पर्यायवाची SNPs ≥ 20 यानी की पढ़ें गहराई कवरेज के साथ, उच्च गुणवत्ता वाले SNPs (मुख्यालय-SNPs) का विशेष रूप से अध्ययन किया गया ।

विशेष रूप से, FKS उत्परिवर्तनों दोनों echinocandin के जीनोम में पहचाने गए-प्रतिरोधी24अलग । पहले दो जोड़े की, echinocandin प्रतिरोधी अलग, CMRL-2 एक एकल FKS2 उत्परिवर्तन S629P, और CMRL-4 बंदरगाह, FKS2 उत्परिवर्तन S663P (तालिका 6) । तीसरी जोड़ी के, एक SNP में FCY2 (Ala237Thr) दोनों CMRL-5 (5-flucytosine अतिसंवेदनशील) और CMRL-6 (प्रतिरोधी) (तालिका 6) में पाया गया । हालांकि, FCY2 में SNPs अन्य phenotypically-WT (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24में भी पाए गए । अलग CMRL-6 और CMRL-12 उनके पान अज़ोल प्रतिरोधी/गैर WT चरित्र के लिए ध्यान देने योग्य थे और दोनों में SNPs था CgCDR1 (एंकोडिंग अज़ोल समाप्ति पंप्स) और CgPDR1 (प्रतिलेखन समाप्ति पंपों को विनियमित करने का पहलू एंकोडिंग) (तालिका 6)26 ,27. एक और समाप्ति पंप जीन में उत्परिवर्तनों की उपस्थिति, CgFLR1 दोनों अज़ोल-अतिसंवेदनशील, और अज़ोल-प्रतिरोधी में हुई26,28अलग । ERG9 (कोडिंग squalene सिंथेस) के भीतर SNPs के लिए जांच उत्परिवर्तनों का पता चला लेकिन ERG1124में पहचाने गए उत्परिवर्तनों नहीं थे ।

WGS विश्लेषण भी Candida सेल दीवार आसंजन अर्थात् जीन, EPA1, EPA6, PWP2 और PWP5में कई गैर पर्यायी SNPs से पता चला । EPA6 उत्परिवर्तनों 9/12 में अलग मौजूद थे । SNPs में PWP2 और PWP5 के अलावा भी लगभग सभी अलग-अलग CMRL-1 और CMRL-1124में मौजूद थे.

अलग अंब अनी mif कैस 5-एफसी पॉस vrc आईटीआर flc रोधी संवेदनशीलता की व्याख्या जीन प्रदान प्रतिरोध WGS द्वारा पहचान
CMRL-1 ०.५ ०.०३ < ०.००८ ०.१२ < ०.०६ ०.५ ०.१२ ०.२५ 8 सभी के लिए अतिसंवेदनशील -
CMRL-2 ०.५ 1 1 8 < ०.०६ ०.२५ ०.०६ ०.१२ 4 सभी echinocandins के लिए प्रतिरोधी केवल FKS1
CMRL-3 ०.२५ ०.०१५ ०.०१५ ०.१२ < ०.०६ 1 ०.२५ ०.५ 8 सभी के लिए अतिसंवेदनशील -
CMRL-4 2 1 1 > 8 < ०.०६ ०.५ ०.१२ ०.२५ 8 सभी echinocandins के लिए प्रतिरोधी केवल FKS2
CMRL-5 1 ०.१२ ०.०१५ ०.१२ < ०.०६ 1 ०.५ ०.५ 16 सभी के लिए अतिसंवेदनशील -
CMRL-6 1 ०.०६ ०.०१५ ०.०६ > ६४ > 8 8 > 16 २५६ 5-एफसी और azoles के लिए प्रतिरोधी FCY2, CgPDR1, CgCDR1
CMRL-7 ०.२५ ०.०६ ०.०१५ ०.२५ < ०.०६ 1 8 ०.५ २५६ सभी azoles के लिए प्रतिरोधी केवल CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1
CMRL-8 ०.५ ०.०३ ०.००८ ०.०६ < ०.०६ ०.५ ०.२५ ०.२५ 4 सभी के लिए अतिसंवेदनशील -
CMRL-9 1 ०.०३ ०.०१५ ०.२५ < ०.०६ 1 ०.५ 1 16 सभी के लिए अतिसंवेदनशील -
CMRL-10 1 ०.०३ < ०.००८ ०.५ < ०.०६ 1 ०.५ ०.५ 16 सभी के लिए अतिसंवेदनशील -
CMRL-11 ०.५ ०.०३ < ०.००८ ०.०३ < ०.०६ ०.५ ०.२५ ०.५ 8 सभी के लिए अतिसंवेदनशील -
CMRL-12 ०.५ ०.०३ ०.०१५ ०.०६ < ०.०६ > 8 2 8 १२८ सभी azoles के लिए प्रतिरोधी केवल CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1
ATCC ९००३० 1 ०.०३ ०.०१५ ०.०६ < ०.०६ 1 ०.५ ०.५ 8 सभी के लिए अतिसंवेदनशील -
संक्षिप्त: MIC, न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता; अंब, amphotericin बी; ANI, anidulafungin; कैस, caspofungin; FLC, fluconazole; आईटीआर, itraconazole; MIF, micafungin; पीओएस, posaconazole; VRC, voriconazole; ५-एफसी, ५-flucytosine.

तालिका 1. इन विट्रो में 13 Candida glabrata की संवेदनशीलता CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 और CMRL-5/CMRL-6 सहित अलग-अलग जोड़े से पहले और बाद में रोधी चिकित्सा प्राप्त

मानकों डीएनए मानक मात्रा (μL) 1x ते बफर रिएजेंट (μL) ९६ में कुल-अच्छी तरह से प्लेट (μL) अंतिम डीएनए एकाग्रता (एनजी/
एसटीडी-पिको 1 8 (मानक डीएनए ट्यूब १०० µ g/ १९९२ १०० २०० १०००
एसटीडी-पिको 2 10 (एसटीडी-पीकू 1 से) ९० १०० २०० १००
एसटीडी-पिको 3 5 (एसटीडी-पीकू 1 से) ९५ १०० २०० ५०
एसटीडी-पिको 4 2 (एसटीडी-पीकू 1 से) १९८ १०० २०० 10
एसटीडी-पिको 5 10 (एसटीडी-पीकू 4) ९० १०० २०० 1
रिक्त - १०० १०० २०० रिक्त

तालिका 2. डीएनए ठहराव के लिए मानक वक्र पीढ़ी के लिए मानक तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल

Figure 1
चित्र 1 . अनुक्रमण कार्यप्रवाह: (क) एक benchtop sequencer पर पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए प्रमुख विश्लेषणात्मक कदम की एक रूपरेखा. (ख) डीएनए पुस्तकालय की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण घटक के रूप में इस तरह के (सही करने के लिए छोड़ दिया) सूचकांक की व्यवस्था के लिए तर्जनी प्लेट रैक के लिए गहरी ९६ अच्छी तरह से चुंबकीय मनका आधारित डीएनए पुस्तकालयों की साफ-अप के लिए प्लेट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
सूचकांक
सेट एक		 N701 n702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715
एक S502 नमुना १ नमूना 2 नमुना ३ नमुना ४ नमुना ५ नमुना ६ नमुना ७ नमुना ८ नमुना ९ नमुना १० नमुना ११ नमुना १२
बी S503 नमुना १३ नमुना १४ नमुना १५ नमुना १६ नमुना १७ नमुना १८ नमुना १९ नमुना २० नमुना २१ सैंपल 22 नमुना २३ नमुना २४
सी S505 नमुना २५ नमुना २६ नमुना २७ नमुना २८ नमुना २९ नमुना ३० नमुना ३१ सैंपल ३२ सैंपल ३३ सैंपल ३४ सैंपल ३५ सैंपल ३६
डी S506 सैंपल ३७ सैंपल ३८ सैंपल ३९ सैंपल ४० सैंपल ४१ सैंपल ४२ सैंपल ४३ सैंपल ४४ सैंपल ४५ सैंपल ४६ सैंपल ४७ सैंपल ४८
ई S507 सैंपल ४९ सैंपल ५० सैंपल ५१ सैंपल ५२ सैंपल ५३ सैंपल ५४ सैंपल ५५ सैंपल ५६ सैंपल ५७ सैंपल ५८ सैंपल ५९ सैंपल ६०
च S508 सैंपल ६१ सैंपल ६२ सैंपल ६३ सैंपल ६४ सैंपल ६५ सैंपल ६६ सैंपल ६७ सैंपल ६८ सैंपल ६९ सैंपल ७० सैंपल ७१ सैंपल ७२
जी S510 सैंपल ७३ सैंपल ७४ सैंपल ७५ सैंपल ७६ सैंपल ७७ सैंपल ७८ सैंपल ७९ सैंपल ८० सैंपल ८१ सैंपल ८२ सैंपल ८३ सैंपल ८४
h S511 सैंपल ८५ सैंपल ८६ सैंपल ८७ सैंपल ८८ सैंपल ८९ सैंपल ९० सैंपल ९१ सैंपल ९२ सैंपल ९३ सैंपल ९४ सैंपल ९५ सैंपल ९६
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
अनुक्रमणिका सेट B N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729
एक S502 नमुना १ नमूना 2 नमुना ३ नमुना ४ नमुना ५ नमुना ६ नमुना ७ नमुना ८ नमुना ९ नमुना १० नमुना ११ नमुना १२
बी S503 नमुना १३ नमुना १४ नमुना १५ नमुना १६ नमुना १७ नमुना १८ नमुना १९ नमुना २० नमुना २१ सैंपल 22 नमुना २३ नमुना २४
सी S505 नमुना २५ नमुना २६ नमुना २७ नमुना २८ नमुना २९ नमुना ३० नमुना ३१ सैंपल ३२ सैंपल ३३ सैंपल ३४ सैंपल ३५ सैंपल ३६
डी S506 सैंपल ३७ सैंपल ३८ सैंपल ३९ सैंपल ४० सैंपल ४१ सैंपल ४२ सैंपल ४३ सैंपल ४४ सैंपल ४५ सैंपल ४६ सैंपल ४७ सैंपल ४८
ई S507 सैंपल ४९ सैंपल ५० सैंपल ५१ सैंपल ५२ सैंपल ५३ सैंपल ५४ सैंपल ५५ सैंपल ५६ सैंपल ५७ सैंपल ५८ सैंपल ५९ सैंपल ६०
च S508 सैंपल ६१ सैंपल ६२ सैंपल ६३ सैंपल ६४ सैंपल ६५ सैंपल ६६ सैंपल ६७ सैंपल ६८ सैंपल ६९ सैंपल ७० सैंपल ७१ सैंपल ७२
जी S510 सैंपल ७३ सैंपल ७४ सैंपल ७५ सैंपल ७६ सैंपल ७७ सैंपल ७८ सैंपल ७९ सैंपल ८० सैंपल ८१ सैंपल ८२ सैंपल ८३ सैंपल ८४
h S511 सैंपल ८५ सैंपल ८६ सैंपल ८७ सैंपल ८८ सैंपल ८९ सैंपल ९० सैंपल ९१ सैंपल ९२ सैंपल ९३ सैंपल ९४ सैंपल ९५ सैंपल ९६
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
अनुक्रमणिका सेट C N701 n702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715
एक S513 नमुना १ नमूना 2 नमुना ३ नमुना ४ नमुना ५ नमुना ६ नमुना ७ नमुना ८ नमुना ९ नमुना १० नमुना ११ नमुना १२
बी S515 नमुना १३ नमुना १४ नमुना १५ नमुना १६ नमुना १७ नमुना १८ नमुना १९ नमुना २० नमुना २१ सैंपल 22 नमुना २३ नमुना २४
सी S516 नमुना २५ नमुना २६ नमुना २७ नमुना २८ नमुना २९ नमुना ३० नमुना ३१ सैंपल ३२ सैंपल ३३ सैंपल ३४ सैंपल ३५ सैंपल ३६
डी S517 सैंपल ३७ सैंपल ३८ सैंपल ३९ सैंपल ४० सैंपल ४१ सैंपल ४२ सैंपल ४३ सैंपल ४४ सैंपल ४५ सैंपल ४६ सैंपल ४७ सैंपल ४८
ई S518 सैंपल ४९ सैंपल ५० सैंपल ५१ सैंपल ५२ सैंपल ५३ सैंपल ५४ सैंपल ५५ सैंपल ५६ सैंपल ५७ सैंपल ५८ सैंपल ५९ सैंपल ६०
च s520 सैंपल ६१ सैंपल ६२ सैंपल ६३ सैंपल ६४ सैंपल ६५ सैंपल ६६ सैंपल ६७ सैंपल ६८ सैंपल ६९ सैंपल ७० सैंपल ७१ सैंपल ७२
जी S521 सैंपल ७३ सैंपल ७४ सैंपल ७५ सैंपल ७६ सैंपल ७७ सैंपल ७८ सैंपल ७९ सैंपल ८० सैंपल ८१ सैंपल ८२ सैंपल ८३ सैंपल ८४
h S522 सैंपल ८५ सैंपल ८६ सैंपल ८७ सैंपल ८८ सैंपल ८९ सैंपल ९० सैंपल ९१ सैंपल ९२ सैंपल ९३ सैंपल ९४ सैंपल ९५ सैंपल ९६
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
अनुक्रमणिका सेट D N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729
एक S513 नमुना १ नमूना 2 नमुना ३ नमुना ४ नमुना ५ नमुना ६ नमुना ७ नमुना ८ नमुना ९ नमुना १० नमुना ११ नमुना १२
बी S515 नमुना १३ नमुना १४ नमुना १५ नमुना १६ नमुना १७ नमुना १८ नमुना १९ नमुना २० नमुना २१ सैंपल 22 नमुना २३ नमुना २४
सी S516 नमुना २५ नमुना २६ नमुना २७ नमुना २८ नमुना २९ नमुना ३० नमुना ३१ सैंपल ३२ सैंपल ३३ सैंपल ३४ सैंपल ३५ सैंपल ३६
डी S517 सैंपल ३७ सैंपल ३८ सैंपल ३९ सैंपल ४० सैंपल ४१ सैंपल ४२ सैंपल ४३ सैंपल ४४ सैंपल ४५ सैंपल ४६ सैंपल ४७ सैंपल ४८
ई S518 सैंपल ४९ सैंपल ५० सैंपल ५१ सैंपल ५२ सैंपल ५३ सैंपल ५४ सैंपल ५५ सैंपल ५६ सैंपल ५७ सैंपल ५८ सैंपल ५९ सैंपल ६०
च s520 सैंपल ६१ सैंपल ६२ सैंपल ६३ सैंपल ६४ सैंपल ६५ सैंपल ६६ सैंपल ६७ सैंपल ६८ सैंपल ६९ सैंपल ७० सैंपल ७१ सैंपल ७२
जी S521 सैंपल ७३ सैंपल ७४ सैंपल ७५ सैंपल ७६ सैंपल ७७ सैंपल ७८ सैंपल ७९ सैंपल ८० सैंपल ८१ सैंपल ८२ सैंपल ८३ सैंपल ८४
h S522 सैंपल ८५ सैंपल ८६ सैंपल ८७ सैंपल ८८ सैंपल ८९ सैंपल ९० सैंपल ९१ सैंपल ९२ सैंपल ९३ सैंपल ९४ सैंपल ९५ सैंपल ९६

तालिका 3. विभिंन अनुक्रमणिका व्यवस्था का टेंपलेट

Figure 2
चित्र 2 : एक मानक ग्राफ मानकों के सीटी मूल्यों के साथ उत्पंन । डुप्लिकेट में नमूना पुस्तकालयों के सीटी मान से औसत पुस्तकालय एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए मानक वक्र अवरोधन और ढलान मूल्यों का उपयोग करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मीट्रिक मानक मान प्राप्त मान (औसत)
उपज 32.5-मध्य आउटपुट के लिए 50 Gb मिड-आउटपुट के लिए ४२ Gb
उच्च उत्पादन के लिए 100-130 Gb उच्च उत्पादन के लिए १२० Gb
प्रतिशत Q30 ≥ ७५% ८०%
क्लस्टर घनत्व 170-230 k/mm2, २०० k/mm2 पर इष्टतम २१० K/mm2.
फिल्टर गुजर क्लस्टर > ७०% ८९.०९%
तीव्रता चक्र द्वारा flowcell में प्रत्येक टाइल के लिए १००० से ऊपर flowcell में प्रत्येक टाइल के लिए १५०० से ऊपर
त्रुटि दर १.५ के नीचे १.४

तालिका 4. Benchtop sequencer में चलाने के लिए एक मानक अनुक्रमण के लिए मीट्रिक

Figure 3
चित्र 3 : अनुक्रमण डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर । (a) अनुक्रम ट्रिमिंग, संदर्भ और गुणवत्ता आधारित भिन्नता का पता लगाने के लिए मैपिंग सहित एक वांछित कार्यप्रवाह बनाएँ । नमूना FASTQ फ़ाइलें (बैच में व्यक्तिगत या एकाधिक नमूने) का चयन करके कार्यप्रवाह चलाएँ । (ख) संदर्भ स्थिति, कवरेज, न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन और नमूना दृश्यों के विश्लेषण के लिए प्राप्त एमिनो एसिड परिवर्तन दिखा संरचनात्मक वेरिएंट की सूची । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

1. ट्रिम अनुक्रम उपयोग की सेटिंग
ट्रिम कुर्सियां डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स
reads में न्यूक्लियोटाइड की अधिकतम संख्या के साथ लंबाई पर फ़िल्टर करें १०००
reads में न्यूक्लियोटाइड की ंयूनतम संख्या के साथ लंबाई पर फ़िल्टर करें ५०
2. मानचित्रण संदर्भ के लिए पढ़ता है
चयनित संदर्भ CBS138
मास्किंग मोड के साथ संदर्भ मास्किंग कोई मास्किंग
मैपिंग विकल्प डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स
3. स्थानीय पुनर्संरेखण
संरेखण सेटिंग्स डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स
4. गुणवत्ता आधारित संस्करण का पता लगाने
पड़ोस त्रिज्या 5
न्यूनतम अंतर और बेमेल गणना 2
न्यूनतम पड़ोस गुणवत्ता 15
न्यूनतम केंद्रीय गुणवत्ता 20
फ़िल्टर पढ़ें डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स
न्यूनतम कवरेज 4
न्यूनतम संस्करण आवृत्ति (%) ७५
भिन् न फ़िल्टर्स डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स
अधिकतम अपेक्षित alleles (Ploidy) 2
जेनेटिक कोड मानक

तालिका 5. सॉफ़्टवेयर पर कार्यप्रवाह पैरामीटर और सेटिंग्स

स्ट्रक्चरल वैरिएंट न्यूक्लियोटाइड पोजीशन जीन दवा (ओं) में मिला
की संख्या
आइसोलेट्स		 प्रतिरोधी अलग अतिसंवेदनशील अलग
SNP_Cg_95352_S629P_fks1 CgFKS1 कैस, अनी, MIF 1 CMRL-2 -
SNP_Cg_375361_S633P_fk2 CgFKS2 कैस, अनी, MIF 1 CMRL-4 -
SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 CgFCY2 5-एफसी 2 CMRL-6 CMRL-5
SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 CgFCY2 5-एफसी 2 0 CMRL-1, CMRL-2
SNP_Cg_720995_C128F_erg9 CgERG9 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 3 CMRL-6 CMRL-5, CMRL-10
SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 CgPDR1 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 1 CMRL-6 -
SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 CgPDR1 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 1 CMRL-7 -
SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 CgPDR1 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 1 0 CMRL-11
SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 CgPDR1 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 1 CMRL-12 -
SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 CgCDR1 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 5 CMRL-6, CMRL-12 CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11
SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 CgCDR1 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 1 CMRL-7 -
SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 CgCDR1 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 1 CMRL-7 -
SNP_Cg_589884_I116V_flr1 CgFLR1 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 4 CMRL-7 CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9
SNP_Cg_589470_V254I_flr1 CgFLR1 FLC, एसेसरीज, VRC, आईटीआर 1 CMRL-12 -

तालिका 6. सी. glabrata के अलग की संख्या में पाया रोधी दवा प्रतिरोध से जुड़े जीन में संरचनात्मक संस्करण की स्थिति की रिपोर्ट

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Discussion

इस अध्ययन में व्यवहार्यता निर्धारित, अनुमानित समय और WGS की परिशुद्धता- C. glabrataमें दवा प्रतिरोध का मार्गदर्शन का पता लगाने । पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए बदलाव समय (जैसे) चार दिन और विश्लेषण परिणाम एक-दो दिनों की रिपोर्टिंग थी । इस संस्कृति प्लेटों और नमूनों की काफी अधिक संख्या के साथ सैंज अनुक्रमण से संवेदनशीलता परख के लिए एक समान मात्रा जैसे के साथ तुलना करता है । लगभग 30-90 C. glabrata जीनोम 80-100% अनुक्रमण कवरेज के साथ, अनुक्रमण प्रवाह सेल क्षमता के आधार पर अनुक्रम किया जा सकता है । अनुक्रमण के बाद से एक में घर WGS प्रयोगशाला सेटअप पर प्रदर्शन किया गया था, लागत/इस अध्ययन में संसाधनों की आवश्यकताओं के लिए नमूने प्रति AUD 80-100 की अनुमानित लागत के साथ सैंज अनुक्रमण और जांच आधारित परख की वर्तमान लागत के बराबर था । सभी अलग की संवेदनशीलता एक वाणिज्यिक परख किट है कि नेत्रहीन पढ़ रहे थे एक पढ़ने के दर्पण का उपयोग करके निर्धारित किया गया । संस्कृति वृद्धि नीले रंग से गुलाबी वर्णमिति विकास संकेतक में परिवर्तन के द्वारा संकेत दिया गया था । MIC पहले नीले रंग के रूप में अच्छी तरह से गुलाबी (विकास) वेल्स यानी की एक श्रृंखला के रूप में पढ़ा था, रोधी एजेंट की सबसे कम एकाग्रता है कि काफी वृद्धि को रोकता है । WGS के लिए, जीनोमिक डीएनए पुस्तकालयों पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग कर तैयार किया गया । पृथक पुस्तकालयों को qPCR द्वारा मात्रा गया. मात्रा पुस्तकालयों benchtop sequencer में प्रदर्शन अंतिम अनुक्रमण चलाने के लिए एक साथ परित थे ।

हमारे विश्लेषण में, SNPs की उपस्थिति में प्रतिरोध प्रदान जीन में अलग अच्छी तरह से उन्नत इन विट्रो में दवाओं के खिलाफ MIC. FKS1 और S663P में FKS2 में उत्परिवर्तनोंS629P की पहचान स्पष्ट रूप से echinocandins के प्रतिरोध के साथ जुड़े थे । दोनों उत्परिवर्तनों phenotypic प्रतिरोध29,30प्रदान करने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है । एक साथ जीनोम चौड़ा अनुक्रमण भी 5-flucytosine (जीन FCY2) और अज़ोल प्रतिरोध (CgPDR1, CgCDR1 और CgFLR1) है कि सक्रियण के माध्यम से प्रतिरोध के साथ जुड़े रहे है से जुड़े जीन में उत्परिवर्तनों का पता चला/ समाप्ति पंप26,27,28के रूप में व्यक्त । हालांकि, अज़ोल और 5-flucytosine प्रतिरोध31 से जुड़े जीन में उत्परिवर्तन के प्रभाव को अतिरिक्त कार्यात्मक द्वारा पुष्टि की जरूरत है जीन अभिव्यक्ति स्तर का आकलन विश्लेषण करती है । मजे की बात तो यह है कि बड़ी संख्या में SNPs३२,३३में भी सेल वॉल adhesins में पाए गए । आसंजन जीन EPA6 में उत्परिवर्तनों , जो एनकोडर फिल्म गठन, अपेक्षाकृत अक्सर३३हुई । इसके अतिरिक्त, अलग CMRL-3, CMRL-4 और CMRL-8 कि अज़ोल प्रतिरोध जीन में उत्परिवर्तनों की कमी थी कोई प्रलेखित SNPs में EPA1 और EPA624,३४। हालांकि, कुल मिलाकर, adhesins और दवा MICs में SNPs के बीच कोई विशेष संबद्धता शामिल परीक्षण की कम संख्या के कारण पाया जा सकता है.

नैदानिक कवक में WGS के कार्यांवयन के लिए मजबूत गुणवत्ता प्रबंधन प्रणाली के कार्यांवयन की आवश्यकता है । उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए और गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों है कि प्रयोग में हर कदम के साथ एक अच्छा WGS परिणाम के लिए आवश्यक है । C. glabrata नमूना डीएनए की पवित्रता पुस्तकालय की तैयारी के लिए प्रस्तुत यूवी अवशोषक विधि (260/280 एनएम और 260/230 एनएम25पर अवशोषित का उपयोग कर मान्य किया जा सकता है । हमारे अनुभव में, के लिए C. glabrata डीएनए 260/280 की सिफारिश की सीमा के भीतर होने की संभावना है 1.8-2 और के लिए 260/230 के बीच 2-2.2 । यदि डीएनए निष्कर्षों इन गुणवत्ता आवश्यकताओं को पूरा नहीं करते हैं, इथेनॉल वर्षण द्वारा अतिरिक्त शुद्धि प्रदर्शन किया जा सकता है । Tagmentation एक आवश्यक कदम है जोड़ने के अद्वितीय बार कोड अनुक्रम अनुक्रमण प्राइमरों कहा जाता है तो के रूप में एकाधिक नमूना के रूप में sequencing (division) के भेदभाव को सक्षम करें । इसलिए, अनुक्रमण प्रक्रिया में, सूचकांकों की विशिष्टता बनाए रखने के लिए तर्जनी नलियों और नमूनों के बीच परस्पर संदूषण से बचने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरती जानी चाहिए । sequencing में सामांयीकरण सुनिश्चित करता है कि sequencing डेटा में बायस लागू हो सकता है नमूना डीएनए लायब्रेरी में उत्पंन होने वाले किसी भी अंतर समाप्त हो जाता है । एक सामांय मनका आधारित साफ-अप का उपयोग कर कदम आमतौर पर अतिरिक्त डीएनए पुस्तकालय टुकड़े और पुस्तकालय के आकार में बदलाव है कि पुस्तकालय की तैयारी के दौरान उत्पंन हो सकती है हटाने की अनुमति देता है । इसलिए 30 मिनट की मशीन इष्टतम क्लस्टर घनत्व के लिए महत्वपूर्ण है । क्लस्टर घनत्व जो sequencing के दौरान बड़े पैमाने पर प्रवर्धन द्वारा उत्पंन नमूना पुस्तकालयों के क्लोनिंग क्लस्टर का घनत्व है Q30 स्कोर और कुल डेटा उत्पादन की तरह डेटा की गुणवत्ता प्रभावित करता है । जबकि क्लस्टरिंग उच्च डेटा गुणवत्ता दे सकता है, यह भी कम डेटा उत्पादन में परिणाम होगा, जबकि अधिक Q30 स्कोर क्लस्टरिंग । डीएनए पुस्तकालयों के रूप में है कि अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं पीसीआर सफाई और सामान्यीकरण के दौरान चुंबकीय मनका अवशेषों से मुक्त होना चाहिए । QPCR एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक संदर्भ तनाव (इस मामले में सी. glabrata के ATCC तनाव) के सूचकांकों के एक विशेष सेट से कम पर कुछ प्रतिनिधि नमूना पुस्तकालयों पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । औसत सीटी मान 15-18 चक्र के बीच होना चाहिए । इस श्रेणी में कोई भी नमूना sequencing चलाने के लिए स्वीकार्य माना जाता है । हालांकि, यदि सीटी मान इस श्रेणी के बाहर है qPCR दोहराया जाना चाहिए । नमूनों में पुस्तकालय की तैयारी के दौरान या तो कम गुणवत्ता वाले इनपुट डीएनए या त्रुटि के कारण qPCR कभी भी विफल हो सकते हैं । सकारात्मक नियंत्रण से गणना के आधार पर, पुस्तकालयों है कि अच्छा अनुक्रम डेटा का उत्पादन होगा की ंयूनतम एकाग्रता स्थापित किया जाना चाहिए । qPCR से प्राप्त पुस्तकालयों की औसत एकाग्रता का उपयोग करना, अनुक्रमण के लिए जोड़ा जा करने के लिए अंतिम पुस्तकालय की मात्रा की गणना की जा सकती है. यह 1.4-1.8 के बीच अनुशंसित अंतिम लाइब्रेरी एकाग्रता का उत्पादन करना चाहिए । c. glabrata पुस्तकालयों के लिए, स्थापित सीटी सी. glabrata ATCC अलग का उपयोग कर रेंज 300-500 बजे की एक औसत पुस्तकालय एकाग्रता सीमा के साथ 16-18 चक्र के बीच था । परित विकृत डीएनए पुस्तकालयों की इसी मात्रा में 200-250 K/mm2के बीच एक क्लस्टर घनत्व रेंज के लिए 60-65 µ l की सीमा के भीतर था ।

आगे के विश्लेषण से पहले अनुक्रम डेटा फ़ाइलों को मल्टीप्लेक्स किया जाना चाहिए । इस अनुक्रमण के बाद उनके बार कोड का उपयोग कर अपने संबंधित पुस्तकालयों में छंटाई द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जगह ले ली है । FASTQ फ़ाइलों की गुणवत्ता ट्रिमिंग करने का एक वैकल्पिक कदम डेटा विश्लेषण करने से पहले किया जा सकता है । अनुक्रम पढ़ता WGS से अलग की एक मानक सॉफ़्टवेयर पैकेज़ में बनाए गए कस्टम वर्कफ़्लो का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । यह कम गुणवत्ता की छंटनी की अनुमति पढ़ता है और फिर संदर्भ Candida जीनोम के लिए मानचित्रण । संदर्भ जीनोम, CBS138, Candida जीनोम डाटाबेस (CGD) से डाउनलोड किया गया था और कार्यप्रवाह से जुड़े विश्लेषण से पहले । डीएनए की उपस्थिति Candida जीनोम में दोहराता है (उदाहरण के लिए, adhesin जीन डीएनए दोहराता है) कम पढ़ने के दृश्यों और SNP बुला के संरेखण जटिल हो सकता है । यह मैप किए गए अनुक्रम के अतिरिक्त स्थानीय पुनर्संरेखण द्वारा सुधारा जा सकता है । कार्यप्रवाह से उत्पादन एक संरचनात्मक वेरिएंट की सूची है कि गैर पर्याय और पर्याय SNP पदों और कवरेज के साथ व्याख्या की जीन प्रदान की गई थी । यह ब्याज की जीन में SNPs की पहचान और अलग (तालिका 6) के लिए अंतिम विश्लेषण रिपोर्ट तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

हमारे अध्ययन और दृष्टिकोण की कुछ सीमाएं स्वीकार की जानी चाहिए । हमारी रिपोर्ट अलग की छोटी संख्या पर आधारित है और नैदानिक कवक के लिए कोई मानक कवक resistome डेटाबेस है । हालांकि सैंज डीएनए अनुक्रमण वर्तमान में नैदानिक प्रयोगशालाओं के लिए और अधिक सुलभ है, यह एक साथ कई जीन उत्परिवर्तनों है कि Candida एसपीपी में दवा प्रतिरोध प्रदान का पता लगाने के लिए सीमित क्षमता है । (> 20 FKS उत्परिवर्तनों के लिए echinocandin प्रतिरोध अकेले) । पैथोलॉजी सेवाओं के समेकन और अनुक्रमण लागत को कम करने के साथ, WGS पर सैंज अनुक्रमण का उपयोग करने की व्यावहारिकता, वृद्धि होने की संभावना है । तथापि, एक महत्वपूर्ण विचार प्रारंभिक प्रयोगशाला सेटअप और WGS साधन कार्यांवयन की लागत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रयोगशाला कर्मियों के अंत प्रयोक्ता प्रशिक्षण है । दीर्घकालिक लागत अनिवार्य रूप से शामिल होगा, अनुक्रमण एजेंट किट की खरीद, और सामान । अतिरिक्त लागत और एक उच्च ताट अगर WGS साधन घर में नहीं है की उंमीद की जानी चाहिए । इसके अलावा, डीएनए की उपस्थिति के जीनोम में दोहराने दृश्यों का संरेखण जटिल हो सकता है कम पढ़ने के दृश्यों और SNP कॉलिंग । उच्च गुणवत्ता वाले संदर्भ जीनोम की उपलब्धता लंबी पढ़ने प्रौद्योगिकियों का उपयोग अनुक्रम SNP पहचान की गुणवत्ता को बनाए रखने में मदद मिलेगी ।

भविष्य में, WGS आसानी से सुलभ और चिकित्सकों20,22द्वारा व्याख्या की है कि नैदानिक सेटिंग्स में तेजी से ट्रैकिंग रिपोर्टिंग समय से नैदानिक चिकित्सा में सुधार लाने की उम्मीद है. इस के विकास के साथ प्राप्त किया जा सकता है उपचारात्मक और अप करने की तारीख WGS रोधी दवा प्रतिरोध डेटाबेस उपंयास और पुष्टि उत्परिवर्तनों के लिए रोधी प्रतिरोध का अनुमान है । ज्ञात phenotypic दवा संवेदनशीलता के नैदानिक प्रासंगिक खमीर के अधिक जीनोम के रूप में विश्लेषण के लिए उपलब्ध हो जाते हैं, उपंयास मार्करों और रोधी दवा प्रतिरोध के तंत्र की खोज की संभावना है । इन घटनाओं में काफी उपचार बहु दवा प्रतिरोध और दवा विषाक्तता के कारण विफलताओं के जोखिम को कम करेगा । अंत में, उपयुक्त गुणवत्ता प्रबंधन प्रोटोकॉल के साथ अगली पीढ़ी अनुक्रमण Candida glabrata जो कवक प्रयोगशालाओं में phenotypic परीक्षण में वृद्धि कर सकते है में प्रतिरोध प्रदान उत्परिवर्तनों के जीनोम चौड़ा पता लगाने में सक्षम बनाता है । चिकित्सकीय प्रासंगिक Candida एसपीपी के तेजी से जीनोम अनुक्रमण द्वारा प्रदान की अंतर्दृष्टि मौलिक रूप से रोधी एजेंटों के विभिंन वर्गों के लिए प्रतिरोध के तंत्र की हमारी समझ बदल सकते है और इनवेसिव के साथ रोगियों के प्रबंधन में सुधार कवक रोगों ।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों और ब्याज की कोई संघर्ष का खुलासा किया है ।

Acknowledgments

इस कार्य में संक्रामक रोगों एवं माइक्रोबायोलॉजी, जन स्वास्थ्य के लिए केंद्र का सहयोग लिया गया । इस अध्ययन के लिए लेखकों को कोई अन्य फंडिंग नहीं मिली है । लेखक डीआरएस एलिसिया Arnott, नातान Bachmann और रंजीता मेनन उनके विशेषज्ञ सलाह और सहायता के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रयोग के साथ धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DensiCHECK Plus BioMérieux Inc K083536 Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOne TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific YO10 Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific 22-363-605 Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma Aldrich, Merck T2795    Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus MP Biomedicals, LLC 8320921 Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit  Promega  A1120 Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific P7589  Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit Illumina FC-131-1096 Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		 Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2  Illumina FC-404-2004 300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 Kit Illumina FC-404-2003 300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control Kit Illumina FC-110-3001 To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture Kit FC-130-1005  2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		 KAPA Biosystems KK4824 Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system  PerkinElmer YJS4NGS Used for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage Plate Thermo Scientific AB0765B MIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881  Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96 Thermo Fisher Scientific AM10027 Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP  Benchmark Scientific BT1502 96-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR Plate BioRad HSP9601 Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II  Roche  5015278001 Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical  BioRad  MSB1001 Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics Workbench Qiagen CLCBio Software for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrument Illumina  Illumina  Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

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चिकित्सा १३० अंक Candida glabrata पूरे जीनोम अनुक्रमण रोधी दवा प्रतिरोध echinocandins azoles 5-flucytosine जीनोम चौड़ा विश्लेषण
रोधी दवा प्रतिरोध के मार्करों का पता लगाने के लिए <em>Candida glabrata</em> के पूरे जीनोम अनुक्रमण
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