Hela genomet sekvensering av Candida glabrata för detektion av markörer av svampdödande läkemedelsresistens
Summary
Denna studie genomförs hela Genomsekvensering för analys av mutationer i gener som ger resistens mot svampdödande läkemedel i Candida glabrata. C. glabrata isolat resistenta mot echinocandiner, azoler och 5-flucytosin, var sekvenserade för att illustrera metoden. Känslighet profiler av isolaten korrelerade med närvaro eller frånvaro av specifika mutation mönster i gener.
Abstract
Candida glabrata kan snabbt skaffa mutationer som leder till läkemedelsresistens, särskilt azoler och echinocandiner. Identifiering av genetiska mutationer är viktigt, som resistens upptäcks i vitro kan ofta korreleras med kliniska misslyckande. Vi undersökte möjligheten att använda hela Genomsekvensering (WGS) för genome-wide analys av svampdödande läkemedelsresistens i C. glabrata. Målet var torecognize enablers och hinder i genomförandet WGS och mäta dess effektivitet. Detta dokument beskriver de viktiga kvalitetskontroll kontrollpunkter och väsentliga komponenter av WGS metod att undersöka genetiska markörer associerade med minskad känslighet för antimykotika. Det uppskattar också noggrannheten av dataanalys och turn-around-tid testning.
Fenotypisk känslighet 12 kliniska och en ATCC stam av C. glabrata bestämdes genom svampdödande resistensbestämning. Dessa inkluderade tre isolera par, från tre patienter, som utvecklat ökning drog de minsta hämmande koncentrationerna. I två par isolera andra av varje par utvecklat resistens mot echinocandiner. Isolatet av andra tredje paret utvecklat resistens mot 5-flucytosin. De återstående består av mottagliga och azol resistenta isolat. Enda nukleotid polymorfismer (SNP) i gener kopplade till echinocandin, azol och 5-flucytosin motstånd bekräftades i resistenta isolat genom WGS använder nästa generations sekvensering. Icke-synonymt SNP i svampdödande motstånd gener såsom FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 och FCY2 identifierades. Totalt, genomsnitt 98% av WGS läser av C. glabrata isolat mappas till referens genomet med ca 75-fold Läs djup täckning. Den handläggningstid och kostnaden var jämförbara med Sanger sekvensering.
Sammanfattningsvis, var WGS av C. glabrata genomförbart i avslöjar kliniskt signifikant genmutationer som är inblandade i resistens mot olika svampdödande läkemedel klasser utan behov av flera PCR/DNA sekvensering reaktioner. Detta utgör ett positivt steg mot att inrätta WGS kapacitet i kliniska laboratorium för samtidiga upptäckt av svampdödande resistenssubstitutioner om tilldelning.
Introduction
Candida glabrata är en alltmer förekommande patogen med vikten som en art som uppvisar motstånd till azoler samt mer nyligen, den echinocandiner1,2,3. Till skillnad från det diploida C. albicans, kan haploida genomet hos C. glabrata tillåta det att förvärva mutationer och utveckla flera läkemedelsresistens lättare. Samtidig resistens till båda drog klasser har också rapporterat4. Tidig utvärdering av svampdödande känslighet och upptäckt av läkemedelsresistens i C. glabrata är därför avgörande för korrekt, riktad terapi samt som i sammanhanget av svampdödande förvaltarskap att begränsa förare av antimikrobiell resistens1 , 5 , 6. att upprätta ett effektivt arbetsflöde att snabbt upptäcka förekomst av bekräftande mutationer kopplade till motstånd biomarkörer i resistenta isolat kommer också bidra till att förbättra förskrivning beslut och kliniska resultat.
Svampdödande känslighet bedöms vanligtvis genom att mäta minsta hämmande koncentration (MIC) som definieras som den lägsta drog koncentration som resulterar i en betydande minskning av tillväxten av en mikroorganism jämfört med en Drogfri-tillväxt kontroll. Klinisk och Laboratory Standards Institute (CLSI) och Europeiska kommittén på antimikrobiell känslighet Testing (EUCAST) har standardiserat resistensbestämning metoder för att göra MIC beslutsamhet mer exakt och konsekvent7, 8. Nyttan av svampdödande MIC förblir dock begränsad speciellt för echinocandiner, särskilt när det gäller genomför mellan olika laboratorier jämförelser där varierande metoder och villkor är användas9. Det finns också osäkra korrelation av mikrofoner med behandlingssvar echinocandin och oförmåga att urskilja WT (eller mottagliga) isolat från dem härbärgerat FKS mutationer (echinocandin-resistenta stammar)10,11. Trots tillgången till bekräftande singel-gen primärvården och Sanger sekvensering av svampdödande motstånd markörer, förverkligandet av resultaten är ofta försenats på grund av bristande samtidiga upptäckt flera motstånd markörer5,12. Därav, samtidiga detektion av resistens-ger mutationer på olika platser i arvsmassan, aktiverad av hela genomet sekvensering-baserad analys, erbjuder betydande fördelar jämfört med nuvarande metoder.
Hela genomet sekvensering (WGS) har genomförts framgångsrikt för att spåra sjukdomsspridning under utbrott samt en strategi för genome-wide risk bedömning och drog resistens testning i bakterier och virus13. Senaste framstegen inom nukleinsyra sekvenseringsteknologi har gjort hela Genomsekvensering (WGS) av patogener i en kliniskt angripbara slå-runt-tid både tekniskt och ekonomiskt genomförbara. DNA-sekvensering erbjuder viktiga fördelar över andra metoder för patogen identifiering och karakterisering sysselsatt i mikrobiologi laboratorier14,15,16. Först, det ger en universell lösning med hög genomströmning, hastighet och kvalitet. Sekvensering kan tillämpas på någon av mikroorganismer och tillåter stordriftsfördelar på lokala eller regionala laboratorier. För det andra, den producerar data i ett ‘framtidssäker’ format mottagliga för jämförelse på nationell och internationell nivå. Slutligen, den potentiella nyttan av WGS i medicin har varit förstärkt av den snabba tillväxten av offentliga databaser som innehåller referens genomen, som kan kopplas till motsvarande databaser som innehåller ytterligare kliniska och epidemiologiska metadata17 ,18.
Nyligen genomförda studier har visat nyttan av WGS för identifiering av svampdödande motstånd markörer från kliniska isolat av Candida spp. 10 , 19 , 20. Detta beror främst på tillgången till hög genomströmning bänkmonterade sequencers, etablerade bioinformatik pipelines och minskar kostnaden för sekvensering21,22. Fördelen med svamp WGS över Sanger sekvensering är att WGS gör sekvensering av flera genom att på en enda körning. Dessutom kan WGS av Candida genom identifiera nya mutationer i läkemedelsmål, spåra genetisk evolution, och uppkomsten av kliniskt relevanta sekvens-typer20,22,23. Viktigast av allt, i fall av inneboende multidrug motstånd, kan WGS hjälpa tidig detektion av resistens-ger mutationer före behandling urval22,24.
Här, undersökte vi möjligheten att WGS-aktiverade screening för mutationer som förknippas med resistens mot olika klasser av antimykotika. Vi presenterar en metod för genomförandet av WGS från slutanvändare och diagnostiska mykologi laboratorium perspektiv. Vi ingår i den här analysen tre isolera paren odlade från tre separata kliniska fall i som in vitro- resistens mot de echinocandiner och 5-flucytosin utvecklats över tiden efter antimykotisk behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie fastställt genomförbarhet, ungefärliga tidslinjer och precision av WGS-guidad upptäckt av läkemedelsresistens i C. glabrata. Handläggningstid (TAT) för bibliotek förberedelse och sekvensering var fyra dagar och rapportering av analyserade resultaten one-two dagar. Detta kan jämföras med minst ett liknande belopp TAT för känslighet analyser från kultur plattor och Sanger sekvensering med betydligt högre antal prover. Runt 30-90 C. glabrata genomen kan sekvenseras baserat på se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av centrum för infektionssjukdomar och mikrobiologi, folkhälsa. Författarna har inte fått någon annan finansiering för denna studie. Författarna tackar Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann och Ranjeeta Menon för deras expertråd och hjälp med hela genomet sekvensering experimentet.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
