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Medicine

検出のマーカーの抗真菌薬剤耐性のカンジダ glabrataの全ゲノム シーケンス

Published: December 28, 2017 doi: 10.3791/56714
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 4,5, 6, 7, 1,3, 1,2,3
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology-Public Health, Westmead Hospital, 2Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, ICPMR, 3Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity, The University of Sydney, 4Department of Microbiology and Infectious Diseases, Canberra Hospital and Health Services, Australian National University Medical School, 5Infection Management Services, Australian National University Medical School, 6Department of Microbiology and Infectious Diseases, St. Vincent's Hospital, 7Department of Infectious Diseases, Peter MacCallum Cancer Centre
* These authors contributed equally

Summary

本研究は、カンジダ glabrataで抗真菌薬耐性遺伝子で突然変異の分析の全ゲノム配列を実装します。カプソファンギン、アゾールと 5-フルシトシン、耐性菌のC. glabrataは、方法論を説明するために配列されました。菌株の感受性プロファイルは、遺伝子に特定の変異パターンの有無と相関。

Abstract

カンジダ glabrata も急速に薬剤耐性、特にアゾールやカプソファンギンにつながる変異を取得できます。抵抗は体外臨床的障害にしばしば関連付けることが検出されると、遺伝の突然変異の同定が不可欠です。C. glabrata抗真菌薬抵抗性のゲノム広い分析の全ゲノム配列 (WGS) を使用しての可能性を検討しました。目的はめざしイネーブラーをされ、実装 WG の障壁とその効果を測定します。このペーパーは、重要品質管理チェックポイントと抗真菌薬に対する感受性の低下と関連する遺伝マーカーを検討する WG 方法論の重要なコンポーネントを説明します。また、データ分析の正確性とテストの時間の周りのターンを見積もっています。

12 臨床表現型の感受性とC. glabrata ATCC 株の 1 つは、抗真菌薬感受性試験により決定されました。これらの含まれている 3 つは、薬剤の最小発育阻止濃度の上昇を開発する 3 つの患者からのペアを分離します。2 つのペアで 2 番目はカプソファンギンに各開発ペア抵抗の分離します。3 番目のペアの 2 番目の分離 5 フルシトシンへの抵抗を開発しました。残りは菌株の感受性およびアゾール耐性で構成。5 フルシトシン、アゾール系 echinocandin 抵抗性遺伝子の一塩基多型 (SNPs) は、次世代シーケンシングによる WG による耐性菌で確認されました。   FKS1、 FKS2 CgPDR1、CgCDR1 、 FCY2などの遺伝子を同定した抗真菌薬抵抗性の非同義の SNPs。全体的にみて、約 75-fold の読み取りの深さカバレッジを参照ゲノムにマップされるC. glabrata分離株の WGS 読み取りの 98% の平均。納期も費用もサンガーに匹敵するシーケンス。

結論としては、 C. glabrataの WGS は複数 PCR/DNA シーケンシング反応を必要とせずに別の抗真菌薬クラスに耐性に関与する臨床的に重大な遺伝子変異を明らかに可能だった。これは薬剤耐性授与置換の同時検出法の臨床検査室で WGS 能力を確立に向けた前向きな一歩を表します。

Introduction

カンジダ glabrataは、抵抗、アゾールおよびもっと最近、カプソファンギン1,2,3種としての重要性をますます発生病原体です。異なり、二倍体のc. アルビカンス、 C. glabrataの半数体のゲノム変異を取得し、多剤耐性をより簡単に開発することができます。両方の薬剤クラスでも共同の抵抗は、4を報告しました。したがって、抗真菌薬感受性の初期評価とC. glabrataの薬剤耐性の検出は抗菌薬耐性1のドライバーを制限する抗真菌薬の管理のコンテキストのように正しい、ターゲットを絞った治療も重要,5,6。 耐性菌の抵抗性バイオ マーカーにリンクされている確証的突然変異の存在がまた処方を改善するための意思決定を迅速に検出する効率的なワークフローと臨床転帰を確立します。

抗真菌薬感受性は通常薬物のない成長と比較して微生物の成長に大幅な削減結果最低薬物濃度として定義されている最小発育阻止濃度 (MIC) を測定することによって評価されます。コントロール。臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) 欧州委員会抗菌薬の感受性テスト (EUCAST) に感受性のマイクの決定を行うために試験方法を標準化してより正確で一貫性のある7、 8。ただし、抗真菌のマイクのユーティリティはカプソファンギン、特に限られている特に厚生比較に関して、様々 な方法論と条件が使用される9。また echinocandin 治療、WT を区別することができないに応答にマイクの不確かな相関関係がある (または影響を受けやすい) FKS 変異 (echinocandin 耐性菌)10,11をかくまっているそれらから分離されました。験の単一遺伝子 Pcr とサンガーの可用性も薬剤耐性マーカーのシーケンスを設定して、結果の実現は頻繁により遅れている複数抵抗マーカー5,12の同時検出の欠如。したがって、全ゲノム シーケンスに基づく解析により、ゲノム内の異なる場所での耐性付与突然変異の同時検出は、現在の方法より重要な利点を提供しています。

全ゲノム シーケンス (WGS) は、流行中の病気の感染だけでなく、ゲノム全体のリスク評価と薬剤耐性細菌やウイルスの13のテストのアプローチを追跡する正常に実装されています。核酸塩基配列決定技術の最近の進歩した全ゲノム配列 (WGS) 病原体の臨床的に実用的な時間の周りのターンで技術的、経済的に可能。DNA の配列では、病原体の同定および微生物学研究所14,,1516で採用の他の方法上の重要な利点を提供しています。まず、高スループット、スピードと品質で普遍的なソリューションを提供します。シーケンスは、微生物のいずれかに適用することができ、ローカルまたは地域研究所で規模の経済を可能します。第二に、国家および国際レベルで比較に従う '将来' 形式のデータが生成されます。最後に、医学の WGS の潜在的な有用性は、追加の臨床的および疫学的メタデータ17 を含む同等のデータ基地にリンクすることができます参照ゲノムを含むパブリック データ基盤の急速な成長によって補強されています、18。

最近の調査はCandida sppの臨床分離株の薬剤耐性マーカーの同定の WGS の有用性を示した。10,19,20します。 これは主に高スループット ベンチトップ シーケンサー、確立されたバイオインフォマティクス パイプラインおよび21,22のシーケンス処理のコストが低下の可用性。真菌 WGS のシーケンスは WGS が 1 回の実行で複数ゲノムのシーケンスをことができますサンガー優位。さらに、カンジダゲノムの WGS は特定の薬剤標的変異解析、遺伝的進化と臨床的に関連するシーケンス タイプ20,22,23の出現を追跡できます。最も重要なことは、本質的な耐性菌の場合は WGS は治療選択22,24前に耐性付与突然変異の早期発見に役立ちます。

ここでは、抗真菌剤の異なるクラスに薬剤耐性に関連する変異の WGS が有効なスクリーニングの可能性を調べた。エンドユーザーと診断真菌学研究室展望から WGS の実装のための方法論を提案します。我々 は、この分析の 3 つの分離を体外でカプソファンギンと 5 フルシトシンへの抵抗は次の抗真菌治療時間をかけて開発 3 つの独立した臨床例から培養のペアに含まれて。

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Protocol

この研究のために必要な倫理的な承認がありませんでした。

1. サブカルチャーと菌カンジダ glabrataに備えて

  1. また少なくとも 1 つC. glabrataアメリカン タイプ文化コレクション (ATCC) 知られている感受性パターンを含める必要があります勉強するC.glabrata菌株のパネルを選択します。
  2. 単一コロニーを触れることにより、特定のサブカルチャー滅菌使い捨てプラスチック ループを用いるとサブローのデキスト ロース寒天培地 (SDA) にストリー キング プレート8。
  3. 順調な成長で分離の純粋培養の 35 ° C で 24-48 h の SDA プレートを孵化させなさい。

2. 抗真菌薬感受性の決定

  1. たて継C. glabrataから約 1 mm 径の 4-5 コロニーをピックアップする滅菌使い捨てプラスチック ループを SDA プレートの分離に使用します。滅菌蒸留水 3 mL に再懸濁します。均一な懸濁液を取得する穏やかなピペッティングでよく混ぜます。
  2. 5 x 10 の6セル/ml の濃度計8を使用して 1 × 106に相当する 0.5 マクファーランドに細胞の密度を調整します。
  3. 感受性は、商業の試金を使用してテストを実行 (テーブルの材料および試薬を参照) すべてC. glabrataの製造元の指示に従ってを分離します。CLSI ガイドラインに従って抗真菌薬の結果としてマイクに基づく分離株の感受性を解釈し、レポート (表 1)8を準備します。

3. シークエンシングのためゲノム DNA の抽出

  1. 1.5 mL チューブに 50 ミリメートルの EDTA の 300 μ L で新たに育てられた SDA プレートからコロニーの loopful を再懸濁します。
  2. ザイモリエイス (10 mg/mL) の 40 μ L に懸濁液と優しくピペット 5 回追加懸濁液が均一になるまで。
  3. 細胞壁を消化する 1-2 h を 37 ° C でサンプルをインキュベートします。5 分間室温で冷却します。
  4. 2 分 14,000 × gの懸濁液を遠心し、上清を慎重に取り外します。
  5. DNA 抽出キット ガイドライン (材料の表を参照)、次の genomic DNA を抽出します。
  6. 10 mm Tris バッファー (pH 7.5 8.5) は、キットで提供される溶出バッファーの代わりに 50 μ L の DNA の餌を抽出再懸濁します。
  7. 260/280 nm25の光学濃度 (外径) の測定による DNA の純度を確認してください。

4. ゲノム DNA の定量化

  1. 蛍光アッセイの製造元のガイドラインに基づくアッセイ キットで提供されるトリス EDTA (TE) バッファー × 1 を準備 (材料の表を参照してください)。
  2. テ アッセイバッファー (希釈率 1:50 100 μ L の最終巻) 使い捨て 96 well プレート x 1 の 98 μ L に 2 μ L を追加することによって DNA のサンプルを希釈します。この希釈手順は、いずれかのマルチ チャンネル ピペットを使用して手動で実行すること、リキッドハンド リング ワークステーション。
  3. ラムダ DNA を希釈して標準の範囲を準備 (100 μ g/mL) 蛍光アッセイ キット (表 2) で提供される、サンプルと一緒に測定が含まれます。
  4. 100 μ L に蛍光染料を 100 μ l 添加希釈 DNA サンプルと反応のための基準を追加します。光から保護、室温で 5 分間インキュベートします。
  5. 製造元のガイドラインに基づいてすべてのサンプルの蛍光を測定します。
  6. 蛍光の測定値を使用して標準の曲線をプロットし、DNA サンプルの元の濃度を計算します。
  7. 0.2 ng/μ L の DNA 濃度を調整する追加する DNA と 10 mM Tris バッファー (pH 8) のボリュームを決定します。
  8. 自動液体処理ワークステーションを用いた DNA 希釈を実行します。この手順は、手動ピペッティングによっても実現できます。

5. DNA ライブラリの準備

注: ライブラリの準備とシーケンスを製造元のプロトコルおよび会社 (図 1A) から提供されたガイドラインに従って行った (材料の表を参照してください)。

  1. Tagmentation および PCR 増幅
    1. 新しい 96 ウェル ハードシェル薄い壁板にラベルを付けます。
    2. 0.2 ng/μ L、5 μ L の DNA の定量化された入力を追加 (1 合計 ng) プレートの各サンプルに。
    3. Tagmentation バッファーの 10 μ L を追加して軽く混ぜてピペット増幅の 5 μ L 各も含む dna バッファーします。プレートをシール接着プレート シールを。
    4. サーマルサイクラーにプレートを置き、次の PCR プログラムを実行: 55 ° C、10 ° C で 5 分押しサンプルでは、10 ° C に達すると、中和するためにすぐに進みます。
    5. 増幅反応を中和するためにプレートに中和バッファーの 5 μ L を追加し、ミックスを優しくピペットします。プレート シールし、5 分間室温でインキュベートします。
    6. 15 μ L のサンプルを PCR マスター ミックスをインデックスに追加します。
    7. インデックス テンプレート (表 3) に基づいたインデックスのユニークな組み合わせを取得する各サンプルように 96 ウェル プレート形式のセットアップのインデックス プライマー チューブ使用のボックスを使用します。
    8. 表 3 のテンプレートで提供順序を使用してインデックス プレート ラック (図 1B) にインデックス プライマー管を配置し、テンプレートのインデックスの位置を記録します。
    9. 順序でインデックス管インデックス プレート ラックに追加された PCR マスター ミックスと tagmentation プレートを配置します。
    10. 垂直配置でインデックスのプライマー 1 管およびインデックス プライマー 2 管を入れてインデックス ラックの水平方向の配置。マルチ チャンネル ピペットを使用して、慎重に各サンプルにインデックスのプライマーの 5 μ L を追加します。
    11. インデックス管の古いインデックス間の交差汚染を避けるために新しいキャップを取り付けます。
    12. 96 ウェル クリア プレート シーラーを使用してプレートをシールし、2 番目の PCR を次のように実行: 95 ° C、30 s、12 サイクル 95 ° C の 10 s、55 ° C、30 s、72 ° C、30 s と 5 分の 72 ° C。
  2. PCR の一掃
    1. ディープウェル プレート tagmentation プレートから PCR 後処理用 PCR の製品を転送 (材料の表を参照してください)。
    2. 渦商業磁気ビーズ ソリューション (材料の表を参照してください) 製造元の指示に基づいて、ビーズの 30 μ L をディープ ウェル プレートで各 PCR の製品に追加します。
    3. 2 分間 1800 rpm でマイクロ プレート シェーカーでプレートを振るし、5 分間振盪せず室温で孵化させなさい。
    4. 上清がクリアまで 2 分、マグネット スタンドにプレートを配置します。
    5. マグネット スタンドにまだプレートと慎重に上清を破棄します。
    6. また、マグネット スタンドにプレートと作りたての 80% エタノール 200 μ L を追加します。
    7. 30 のマグネット スタンドに板を孵化させなさい s と慎重に削除し、ビーズを乱すことがなく上澄みを廃棄します。
    8. あれば 15 分削除余分なエタノールの風乾にビーズができ洗浄ステップを繰り返します。
    9. マグネット スタンドからプレートを外し、ビーズに再懸濁バッファーの 52.5 μ L を追加します。
    10. 2 分間 1800 rpm でマイクロ プレート シェーカーでプレートを振るし、振ることがなく 2 分間室温でインキュベートします。
    11. マグネット スタンドにプレートを置き、上澄みをクリアするを許可します。
    12. マルチ チャンネル ピペットを使用して、上澄みの 50 μ L の新しいハードシェル プレートに慎重にクリーンアップ プレートから転送します。
  3. ライブラリの正規化
    1. 製造元のガイドライン (表の材料を参照) によるとライブラリ正規化試薬を解凍します。
    2. クリーンアップ プレートから上澄みの 20 μ L を新しいディープ ウェル プレートに転送します。
    3. 磁気ビーズ懸濁液の 45 μ L を追加し、プレート板シーラーでシールします。
    4. プレートは、1800 rpm で 30 分間のマイクロ プレート シェーカーで横に振る。このインキュベーション時間は非常に重要です、超えることができません。
    5. 2 分、マグネット スタンドにプレートを置き、上澄みが (図 1B) をクリアすることを確認します。
    6. 取り外してマグネット スタンドにまだプレートと適切な有害廃棄物コンテナーの上澄みを廃棄します。
    7. マグネット スタンドからプレートを削除し、45 μ L 洗浄バッファーでビーズを洗浄します。
    8. 洗浄バッファーでプレートは、1800 rpm で 5 分間のマイクロ プレート シェーカーで横に振る。
    9. それが明確になるとき、2 分及び破棄上澄みのマグネット スタンドにプレートを配置します。
    10. マグネット スタンドからプレートを削除し、洗浄バッファーで洗浄を繰り返します。
    11. マグネット スタンドからプレートを削除し、0.1 N NaOH の 30 μ L を追加します。
    12. 1800 rpm で 5 分間のマイクロ プレート シェーカーで 0.1 N NaOH で板を振るし、2 分または液体がクリアされるまで、マグネット スタンドにプレートを配置します。
    13. 新しい 96 ウェル ハードシェル薄肉最終的な正規化されたライブラリ プレートの各ウェルに 30 μ L の溶出バッファーを追加します。
    14. 最終巻 60 μ L をする最終的な正規化されたライブラリ プレートに正規化プレートから上澄みの 30 μ L を転送します。ライブラリは、シーケンスする準備が整いました。
  4. QPCR による DNA ライブラリ濃度の定量
    1. マスター ミックス、プライマーおよび製造元のガイドライン (表の材料を参照) によると qPCR キットで提供される標準を解凍します。
    2. PCR 試薬マスター ミックスと製造元の指示に従って qPCR キットに付属のプライマーを組み合わせて、因数は-20 ° C で保存することができます。
    3. DNA ライブラリの濃度を決定するには、ホームキット希釈 (158 μ L Tris バッファーに 1: 100 から 2 μ L) 続く 1: 100 希釈 (1.5 μ L DNA ライブラリ 148.5 μ L トリスバッファーする) を実行することによって 10 mM Tris バッファー (pH 8) を用いた DNA ライブラリの 1/8000 希釈を行います。
    4. 少なくとも 1 分の 700 rpm で希釈プレートを振るし、1 分 14000 × gで遠心分離します。
    5. 希釈した DNA ライブラリまたは DNA 規格の 4 μ L とマスター ミックスの 16 μ L を混合することによって最終的な PCR の反作用の 20 μ L を準備します。
    6. 以下の製造元の設定たちで PCR を実行: 95 ° C、5 分、95 の 35 サイクル 45 s、および最終の 65 ° C ~ 95 ° C、融解曲線分析の 30 s と 60 ° C の ° C。
    7. QPCR たちから DNA のサンプル ライブラリと標準の Ct 値を取得します。
    8. 基準 (図 2) の Ct 値から標準曲線を生成します。平均から 3 サイクル ± して上限と下限の QC の範囲を定義します。たとえば、平均 Ct 値が 13 サイクルの場合、QC 範囲は 16 と 10 のサイクルの間です。
    9. 標準曲線と Ct 値から個々 および平均ライブラリ濃度 (ALC) を決定します。
    10. 合計プールされたライブラリ (PAL) 使用される量 1.4-13:08 間ターゲット ライブラリ濃度であることを考慮した最終的なシーケンスに対して下記の計算に基づいて決定します。
      注:QPCR から得られるライブラリ濃度の平均 = ALC;プールされたライブラリ (PAL) の合計 = ALC/2;PAL (DAL) を変性 PAL = * 0.666
      バッファーと混合される DAL の量、に応じてフロー ・ セルに追加するライブラリの濃度であります。たとえば、バッファーの 835 μ L にライブラリの 65 μ L を追加する場合、この希釈 (Dil 1) 195 からが追加されます 1300 μ L の総ボリューム: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = 最終濃度 (1.4-13:08 の間する必要があります)

6. ライブラリのプールとベンチトップ シーケンサーの開始シーケンス

  1. 製造元のガイドラインによると試薬カートリッジを解凍します。4 ° C のストレージからそのパッケージから新しいフローセルを取り出して室温少なくともシーケンスの前に 30 分をもたらします。バッファー カートリッジと使用する前に prechill 配列バッファーを取る (材料の表を参照してください)。
  2. コントロール ライブラリをライブラリの 5 μ L を混合することによって準備 (1 nM) と 0.2 N NaOH の 5 μ L。渦を簡単に単一繊維にコントロール ライブラリを変性する室温で 5 分間インキュベートし、。
  3. 200 ミリメートル トリス-HCl、pH 7 と渦の 5 μ L を追加します。235 μ L prechilled 配列バッファーを加え、軽く混ぜます。総量が 20 でコントロール ライブラリの最終濃度で 250 μ L 分。
  4. 単一の低バインド 1.5 mL チューブに最終的な正規化されたライブラリ プレートからシーケンスする各サンプルのライブラリの 5 μ L を転送することによってプール DNA ライブラリ。
  5. プールされたライブラリの 30 μ L と管内別低バインド ライブラリを変性する 0.2 N NaOH の 30 μ L を追加します。
  6. 渦低バインド チューブし、単一繊維にライブラリを変性する室温で 5 分間インキュベートします。
  7. 200 mM トリス-HCl、反応を中和するために変性のライブラリとチューブに pH 7 の 30 μ L を追加します。
  8. 中和変性ライブラリ懸濁液の 65 μ L と中古冷蔵配列バッファーとよく混ぜて渦の 835 μ L を追加します。
  9. 最終低バインド チューブで次は組み合わせる: 中和変性ライブラリ、コントロール ライブラリと配列バッファーの 1103.70 μ L の 1.30 μ L から 195 μ L。ミックスが適切。
  10. 試薬カートリッジを所定の場所に最後のライブラリ ミックス (1300 μ L) をロードします。
  11. セットアップ シーケンスをシーケンサーでプロジェクトとサンプルの詳細を入力して、実行指定ウェブサイト ガイドラインに従います。
  12. 開始シーケンスはガイドラインに従います。フロー ・ セル、ライブラリと試薬カートリッジとベンチトップ シーケンサーでバッファーのカートリッジをロードします。
  13. すべての試薬キットと、シーケンスで使用されているカートリッジのロット番号を記録します。

7. データのシーケンスの web サイトからダウンロードします。

  1. ウェブサイト上で提供の製造元の指示に従って FASTQ ファイルをダウンロードします。
  2. 良い品質チェックを実行率 Q30 は ≥ 75%、クラスター密度は 170 280 K/mm2の間 200 210 K/mm2 (表 4) に最適。

8. シーケンス データ解析

  1. データ分析ソフトウェアを統合したパッケージにシーケンスされたサンプルの FASTQ ファイルをインポート (材料の表を参照してください)。
  2. すなわちトリミング リストから機能を追加するソフトウェアのシーケンス ワークフローを作成、参照 ([参照ゲノム) へのマッピング、ローカル再編およびバリアント解析 (図 3A) 設定を使用して表 5 に記載。
  3. 1 つのサンプルまたはサンプル FASTQ ファイルのバッチを選択してワークフローを実行し、指定のサンプル フォルダーに出力ファイルを保存します。
  4. (図 3B) のゲノム シーケンスのカバレッジの深さ、マップされた領域と構造変形の一覧レポートを生成します。
  5. 構造変形のリストを使用すると、抵抗性と病原性を付与する遺伝子の非同義一塩基多型 (SNPs) を検索します。
  6. レポートを準備するには、SNP の場所、遺伝子、および抵抗性または感受性の菌株 (表 6) の数を一覧表示します。

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Representative Results

13 C. glabrata C. glabrata 90030 と 12 ATCC 由来 (CMRL12 に CMRL1 を隔離集団) 臨床真菌参照実験室を含む、ウエストミード病院、シドニーを調べた (表 1)。これらは分離株 CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 と CMRL-5/CMRL-6 間に疫学的リンクのない抗真菌治療前後の 3 つのペアが含まれている24 (表 1)。

9 抗真菌剤すなわち、アムホテリシン (AMB)、Anidulafungin (ANI)、ミカファンギン (MIF)、CLSI 解釈ブレークポイントを使用して、マイクを求めたキャスポファンギン (CAS)、5 フルシトシン (5 FC)、ポサコナゾール (POS)、ボリコナゾール (VRC)、イトラコナゾール (ITR) やフルコナゾール (FLC)。カンジダ parapsilosisATCC 22019 とカンジダ救急ATCC 6258 品質管理系統として使用されました。CMRL 1、CMRL 2、特定のペアの間で第 2 分離 CMRL 2 だったキャスポファンギン (0.12 mg/L、テーブル 1 対 8 マイク) に強かった。CMRL 2 も同様の比例した増加 anidulafungin とミカファンギンの mics (≥ 0.5 mg/L) すべての 3 つのカプソファンギン24への抵抗の in vitroの結果します。同様に、分離 CMRL 4 は、echinocandin 抵抗分離 CMRL 3 より (表 1) を開発していた。3 番目のペア間分離 CMRL 6 いた 5 フルシトシン マイク (> 0.06 mg/L 対 64)24。両方のこれらの特定のペアは、テスト他の抗真菌薬に対する感受性/ワイルド-タイプ (WT) をだった。隔離の CMRL 6 と CMRL 12 はすべてアゾールに抵抗性または非 WT をことがわかった。CMRL 7 だったフルコナゾールやボリコナゾール (表 1) に非 WT に耐性。C. glabrata ATCC 90030 と菌株 CMRL 8 CMRL 11 すべての抗真菌剤24に影響を受けやすいの影響を受けやすい/重量であった。

13 菌株の WGS は、ベンチトップのシーケンサーを使用して行った。平均では、中間出力シーケンス実行が 0.5 1.4 間エラー率 27 40 GB データの得られた %。Q30 取得割合の平均値は 80-85% 前後通常だった。200-250 (表 4) の間であった、流体セルのクラスター密度 (K/mm2)この研究から塩基配列データをプロジェクト番号 PRJNA310057 の下 NCBI シーケンス読み取りアーカイブ (SRA) に堆積しました。統合データ分析ソフトウェアで分析を通してC. glabrata参照ゲノム (株 CBS138) にマップ読み込みシーケンスの 98%。平均深さ範囲は平均 143 跪く構造バリアント検出、50 以上の識別された分離あたり 000 SNPs の長さを読む 75 x を読みます。特に、CMRL1/CMRL-2、各分離株、合計の SNPs の頃 CMRL-3/CMRL - 4、79,000 ひずみのペアを分析する際、SNPs の総数約 6万で、56,000 CBS13824と比較されたときよりも CMRL-5/CMRL-6 があった。SNP の違いひずみペアの分離株間の比較時 25 未満であった。

FKS1、 FKS2 FKS3 (echinocandin 抵抗)、 FCY1 FCY2 (5-バイオ マーカー解析24、特に、選択された抵抗を知られている菌株の感受性プロファイルに基づいてください。フルシトシン抵抗)、 ERG9、ERG11、CgCDR1、CgPDR1 、 CgFLR1 (アゾール抵抗)。遺伝子は、知られている突然変異と遺伝子多型の出現頻度をチェックされました。だけで遺伝子の非同義の SNPs は、すなわち ≥20 の深さ範囲を読み取り、高品質 SNPs (hq SNPs) 具体的に検討しました。

特に、 FKSの突然変異は、両方の echinocandin 耐性菌24のゲノムで識別されました。最初の 2 つのペア、echinocandin 菌株の CMRL 2 を抱いてFKS2単一 S629P、突然変異、 FKS2変異 S663P CMRL 4 (表 6)。3 番目のペアのFCY2 (Ala237Thr) の SNP は、CMRL 5 (5 フルシトシン敏感) と CMRL 6 (耐) (表 6) の両方で発見されました。しかし、 FCY2では、他の表現型 WT 菌株 (CMRL 1、CMRL 2、CMRL 10)24にも見つかりました。分離株 CMRL 6 と CMRL 12 はそのパン アゾール耐性/非顕著だった-WT 文字CgCDR1 (エンコード アゾール系流出ポンプ) とCgPDR1 (エンコード流出ポンプを制御する転写因子) の Snp を持っていたと (表 6)26 ,27。別の排出ポンプの遺伝子の突然変異の存在、両方アゾール感受性、およびアゾール耐性菌株26,28でCgFLR1が発生しました。Snp ERG9 (コーディング スクアレン合成酵素) の調査は、突然変異を明らかにしたが、突然変異ERG1124ではありませんでした。

WGS 解析はまた、カンジダ細胞壁付着遺伝子EPA1、EPA6、PWP2 、 PWP5すなわち、複数の非同義 SNPs を明らかにしました。EPA6変異株 9/12 に存在していた。PWP2とPWP5でも菌株 CMRL 1 と CMRL 1124を除くほぼすべての菌株で存在していた。

分離 AMB アニ MIF CA 5 FC POS VRC ITR 強誘電性液晶 抗真菌薬感受性の解釈 WGS で識別される耐性遺伝子
CMRL 1 0.5 0.03 < 0.008 0.12 < 0.06 0.5 0.12 0.25 8 受けやすい -
CMRL 2 0.5 1 1 8 < 0.06 0.25 0.06 0.12 4 すべてのカプソファンギンのみに耐性 FKS1
CMRL 3 0.25 0.015 0.015 0.12 < 0.06 1 0.25 0.5 8 受けやすい -
CMRL 4 2 1 1 > 8 < 0.06 0.5 0.12 0.25 8 すべてのカプソファンギンのみに耐性 FKS2
CMRL 5 1 0.12 0.015 0.12 < 0.06 1 0.5 0.5 16 受けやすい -
CMRL 6 1 0.06 0.015 0.06 > 64 > 8 8 > 16 256 5 FC とアゾール耐性 FCY2、CgPDR1、CgCDR1
CMRL 7 0.25 0.06 0.015 0.25 < 0.06 1 8 0.5 256 すべてアゾールのみに耐性 CgPDR1、CgCDR1、CgFLR1
CMRL 8 0.5 0.03 0.008 0.06 < 0.06 0.5 0.25 0.25 4 受けやすい -
CMRL 9 1 0.03 0.015 0.25 < 0.06 1 0.5 1 16 受けやすい -
CMRL 10 1 0.03 < 0.008 0.5 < 0.06 1 0.5 0.5 16 受けやすい -
CMRL 11 0.5 0.03 < 0.008 0.03 < 0.06 0.5 0.25 0.5 8 受けやすい -
CMRL 12 0.5 0.03 0.015 0.06 < 0.06 > 8 2 8 128 すべてアゾールのみに耐性 CgPDR1、CgCDR1、CgFLR1
ATCC 90030 1 0.03 0.015 0.06 < 0.06 1 0.5 0.5 8 受けやすい -
略語: マイク、最小発育阻止濃度;AMB、アムホテリシン B;アニ、anidulafungin;CAS、キャスポファンギン;FLC、フルコナゾール;ITR、イトラコナゾール;MIF、ミカファンギン;POS、ポサコナゾール;VRC、ボリコナゾール;5 FC 5-フルシトシン。

表 1.13 のin vitro感受性カンジダ glabrata分離を含む CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 CMRL-5/CMRL-6 分離抗真菌治療前後を取得のペア

基準 DNA 標準量 (μ L) 1 X TE バッファー 試薬 (μ L) 96 ウェル プレート (μ L) の合計します。 最終的な DNA 濃度 (ng/mL)
Std-ピコ 1 8 (標準的な DNA チューブ 100 μ g/mL) 1992 100 200 1000
Std-ピコ 2 (Std ピコ 1) から 10 90 100 200 100
Std-ピコ 3 (から Std ピコ 1) 5 95 100 200 50
Std-ピコ 4 (Std ピコ 1) から 2 198 100 200 10
Std-ピコ 5 10 (Std-ピコ 4) 90 100 200 1
空白 - 100 100 200 空白

表 2.DNA の定量化のための標準的な曲線の生成のための標準の準備のためのプロトコル

Figure 1
図 1.シーケンス ワークフロー: (A)ライブラリの準備とベンチトップ シーケンサーのシーケンスの主な分析手順の概要です。(B)は、(左から右へ) などの DNA ライブラリの準備のための重要なコンポーネントのインデックスのインデックス作成時にインデックス配置板ラックと磁気ラックベース磁気ビーズに深い 96 ウェル プレートでの DNA ライブラリのクリーンアップ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
インデックス
セット A		 N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715
A S502 サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3 サンプル 4 サンプル 5 サンプル 6 サンプル 7 サンプル 8 サンプル 9 サンプル 10 サンプル 11 サンプル 12
B S503 サンプル 13 サンプル 14 サンプル 15 サンプル 16 サンプル 17 サンプル 18 サンプル 19 サンプル 20 サンプル 21 サンプル 22 サンプル 23 サンプル 24
C S505 サンプル 25 サンプル 26 サンプル 27 サンプル 28 サンプル 29 サンプル 30 サンプル 31 サンプル 32 サンプル 33 サンプル 34 サンプル 35 サンプル 36
D S506 サンプル 37 サンプル 38 サンプル 39 サンプル 40 サンプル 41 サンプル 42 サンプル 43 サンプル 44 サンプル 45 サンプル 46 サンプル 47 サンプル 48
E S507 サンプル 49 サンプル 50 サンプル 51 サンプル 52 サンプル 53 サンプル 54 サンプル 55 サンプル 56 サンプル 57 サンプル 58 サンプル 59 サンプル 60
F S508 サンプル 61 サンプル 62 サンプル 63 サンプル 64 サンプル 65 サンプル 66 サンプル 67 サンプル 68 サンプル 69 サンプル 70 サンプル 71 サンプル 72
G S510 サンプル 73 サンプル 74 サンプル 75 サンプル 76 サンプル 77 サンプル 78 サンプル 79 サンプル 80 サンプル 81 サンプル 82 サンプル 83 サンプル 84
H S511 サンプル 85 サンプル 86 サンプル 87 サンプル 88 サンプル 89 サンプル 90 サンプル 91 サンプル 92 サンプル 93 サンプル 94 サンプル 95 サンプル 96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
インデックスのセット B N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729
A S502 サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3 サンプル 4 サンプル 5 サンプル 6 サンプル 7 サンプル 8 サンプル 9 サンプル 10 サンプル 11 サンプル 12
B S503 サンプル 13 サンプル 14 サンプル 15 サンプル 16 サンプル 17 サンプル 18 サンプル 19 サンプル 20 サンプル 21 サンプル 22 サンプル 23 サンプル 24
C S505 サンプル 25 サンプル 26 サンプル 27 サンプル 28 サンプル 29 サンプル 30 サンプル 31 サンプル 32 サンプル 33 サンプル 34 サンプル 35 サンプル 36
D S506 サンプル 37 サンプル 38 サンプル 39 サンプル 40 サンプル 41 サンプル 42 サンプル 43 サンプル 44 サンプル 45 サンプル 46 サンプル 47 サンプル 48
E S507 サンプル 49 サンプル 50 サンプル 51 サンプル 52 サンプル 53 サンプル 54 サンプル 55 サンプル 56 サンプル 57 サンプル 58 サンプル 59 サンプル 60
F S508 サンプル 61 サンプル 62 サンプル 63 サンプル 64 サンプル 65 サンプル 66 サンプル 67 サンプル 68 サンプル 69 サンプル 70 サンプル 71 サンプル 72
G S510 サンプル 73 サンプル 74 サンプル 75 サンプル 76 サンプル 77 サンプル 78 サンプル 79 サンプル 80 サンプル 81 サンプル 82 サンプル 83 サンプル 84
H S511 サンプル 85 サンプル 86 サンプル 87 サンプル 88 サンプル 89 サンプル 90 サンプル 91 サンプル 92 サンプル 93 サンプル 94 サンプル 95 サンプル 96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
インデックスのセット C N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715
A S513 サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3 サンプル 4 サンプル 5 サンプル 6 サンプル 7 サンプル 8 サンプル 9 サンプル 10 サンプル 11 サンプル 12
B S515 サンプル 13 サンプル 14 サンプル 15 サンプル 16 サンプル 17 サンプル 18 サンプル 19 サンプル 20 サンプル 21 サンプル 22 サンプル 23 サンプル 24
C S516 サンプル 25 サンプル 26 サンプル 27 サンプル 28 サンプル 29 サンプル 30 サンプル 31 サンプル 32 サンプル 33 サンプル 34 サンプル 35 サンプル 36
D S517 サンプル 37 サンプル 38 サンプル 39 サンプル 40 サンプル 41 サンプル 42 サンプル 43 サンプル 44 サンプル 45 サンプル 46 サンプル 47 サンプル 48
E S518 サンプル 49 サンプル 50 サンプル 51 サンプル 52 サンプル 53 サンプル 54 サンプル 55 サンプル 56 サンプル 57 サンプル 58 サンプル 59 サンプル 60
F S520 サンプル 61 サンプル 62 サンプル 63 サンプル 64 サンプル 65 サンプル 66 サンプル 67 サンプル 68 サンプル 69 サンプル 70 サンプル 71 サンプル 72
G S521 サンプル 73 サンプル 74 サンプル 75 サンプル 76 サンプル 77 サンプル 78 サンプル 79 サンプル 80 サンプル 81 サンプル 82 サンプル 83 サンプル 84
H S522 サンプル 85 サンプル 86 サンプル 87 サンプル 88 サンプル 89 サンプル 90 サンプル 91 サンプル 92 サンプル 93 サンプル 94 サンプル 95 サンプル 96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
インデックス セット D N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729
A S513 サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3 サンプル 4 サンプル 5 サンプル 6 サンプル 7 サンプル 8 サンプル 9 サンプル 10 サンプル 11 サンプル 12
B S515 サンプル 13 サンプル 14 サンプル 15 サンプル 16 サンプル 17 サンプル 18 サンプル 19 サンプル 20 サンプル 21 サンプル 22 サンプル 23 サンプル 24
C S516 サンプル 25 サンプル 26 サンプル 27 サンプル 28 サンプル 29 サンプル 30 サンプル 31 サンプル 32 サンプル 33 サンプル 34 サンプル 35 サンプル 36
D S517 サンプル 37 サンプル 38 サンプル 39 サンプル 40 サンプル 41 サンプル 42 サンプル 43 サンプル 44 サンプル 45 サンプル 46 サンプル 47 サンプル 48
E S518 サンプル 49 サンプル 50 サンプル 51 サンプル 52 サンプル 53 サンプル 54 サンプル 55 サンプル 56 サンプル 57 サンプル 58 サンプル 59 サンプル 60
F S520 サンプル 61 サンプル 62 サンプル 63 サンプル 64 サンプル 65 サンプル 66 サンプル 67 サンプル 68 サンプル 69 サンプル 70 サンプル 71 サンプル 72
G S521 サンプル 73 サンプル 74 サンプル 75 サンプル 76 サンプル 77 サンプル 78 サンプル 79 サンプル 80 サンプル 81 サンプル 82 サンプル 83 サンプル 84
H S522 サンプル 85 サンプル 86 サンプル 87 サンプル 88 サンプル 89 サンプル 90 サンプル 91 サンプル 92 サンプル 93 サンプル 94 サンプル 95 サンプル 96

表 3.別のインデックス配列のテンプレート

Figure 2
図 2: 標準の Ct 値で生成された標準グラフ。標準曲線の切片と勾配の値を使用して、重複のサンプル ライブラリの Ct 値から平均ライブラリの濃度を決定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

メトリック 標準値 得られた値 (平均)
収量 32.5 中間出力の - 50 ギガバイト 中間出力の 42 Gb
高出力の 100-130 Gb 高出力の 120 Gb
割合 Q30 ≥ 75% 80%
クラスター密度 170-230 K/mm2, 200 K/mm2に最適な 210 K/mm2。
フィルターを通過するクラスター > 70% 89.09%
サイクルによる強度 フローセル内の各タイルの 1000 年以上 1500 フローセル内の各タイルの上
誤り率 1.5 倍以内 1.4

表 4.ベンチトップ Sequencer で実行標準的な配列のための指標

Figure 3
図 3: データ解析ソフトウェアを配列します。(A)シーケンス トリミングを含む必要なワークフローを作成、参照および品質へのマッピングによるバリアント検出。サンプル FASTQ ファイル (個別またはバッチで複数のサンプル) を選択してワークフローを実行します。(B)基準位置、カバレッジ、ヌクレオチドの変更およびサンプル シーケンスの解析のために得られたアミノ酸変化を示す構造の変形のリスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

1 シーケンスをトリミングします。 使用する設定
拠点をトリムします。 既定の設定
ヌクレオチドの最大数と長さの読み取りフィルターします。 1000
読み取りのヌクレオチドの最小数を長にフィルターします。 50
2. マッピングの読み取りを参照するには
選択した参照 CBS138
参照モードをマスキングしてマスキング マスキングなし
マッピング オプション 既定の設定
(3) 地域再編
配置の設定 既定の設定
4. 品質によるバリアント検出
近所の半径 5
最小ギャップと不一致の数 2
最低限の近所の品質 15
中央の最低品質 20
読み取りフィルター 既定の設定
最小範囲 4
最小周波数 (%) 75
バリアントのフィルター 既定の設定
最大予想される対立遺伝子 (倍数) 2
遺伝コード 標準

表 5 。ワークフロー パラメーターとソフトウェアの設定

構造のバリアントの塩基位置 遺伝子 薬 見つかりました
数
分離株		 耐性菌 影響を受けやすい株
SNP_Cg_95352_S629P_fks1 CgFKS1 CAS、アニ、MIF 1 CMRL 2 -
SNP_Cg_375361_S633P_fk2 CgFKS2 CAS、アニ、MIF 1 CMRL 4 -
SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 CgFCY2 5 FC 2 CMRL 6 CMRL 5
SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 CgFCY2 5 FC 2 0 CMRL 1、CMRL 2
SNP_Cg_720995_C128F_erg9 CgERG9 FLC、POS、VRC、ITR 3 CMRL 6 CMRL 5、CMRL-10
SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 CgPDR1 FLC、POS、VRC、ITR 1 CMRL 6 -
SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 CgPDR1 FLC、POS、VRC、ITR 1 CMRL 7 -
SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 CgPDR1 FLC、POS、VRC、ITR 1 0 CMRL 11
SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 CgPDR1 FLC、POS、VRC、ITR 1 CMRL 12 -
SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 CgCDR1 FLC、POS、VRC、ITR 5 CMRL-6, CMRL-12 CMRL 5、CMRL 10, CMRL-11
SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 CgCDR1 FLC、POS、VRC、ITR 1 CMRL 7 -
SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 CgCDR1 FLC、POS、VRC、ITR 1 CMRL 7 -
SNP_Cg_589884_I116V_flr1 CgFLR1 FLC、POS、VRC、ITR 4 CMRL 7 CMRL 1、CMRL 2、CMRL-9
SNP_Cg_589470_V254I_flr1 CgFLR1 FLC、POS、VRC、ITR 1 CMRL 12 -

表 6.C. glabrataの菌数は、抗真菌の薬剤耐性に関与する遺伝子の構造のバリアントの位置のレポート

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Discussion

本研究には、可能性、おおよそタイムライン、 C. glabrataの薬剤耐性の WGS 誘導検出精度が決定されます。ライブラリの準備とシーケンスのターンアラウンド ・ タイム (TAT) は 4 日、ワンツー日数分析結果報告だったこれは少なくとも同じような量 TAT 培養皿サンガーから感受性試金のための比較サンプル数の大幅増加によるシーケンスします。約 30-90 C. glabrataゲノム シーケンス シーケンス率 80-100% のフローセル容量に基づいてシーケンス処理できます。本研究ではコスト/リソース要件はサンガーの現在のコストに相当するシーケンスは、社内の WGS 研究室セットアップで実行された、サンプルあたり 80-100 (aud) の推定コストは、順序付けとプローブ ベースの試金。すべての菌株の感受性は視覚的に読書ミラーを使用して読まれた商業アッセイ キットにより決定しました。文化成長が青から比色成長指標の変化によって示されたピンク色に。ピンク (成長) のシリーズがすなわち、井戸後マイクはよく最初の青として読まれた成長を大幅に阻害する抗真菌剤の最低濃度。WG の genomic DNA ライブラリはライブラリ作成キットを使用して準備されました。特定のライブラリは、qPCR による定量化されました。ベンチトップ sequencer で実行を実行最終的な配列のため定量化されたライブラリを一緒に集めた。

我々 の分析で、高架の in vitroマイク薬に対してとよく相関した分離株における耐性遺伝子の SNPs の存在。FKS2識別における変異FKS1 の S629Pと S663P は、明らかにカプソファンギンへの抵抗と関連付けられました。両方の突然変異が表現型抵抗29,30を授与するよく知られています。同時のゲノム シーケンスがまた活性化を介して抵抗に関連付けられている 5 フルシトシン (遺伝子FCY2) とアゾール抵抗 (CgPDR1、 CgCDR1 、 CgFLR1) にリンクされた遺伝子の突然変異を明らかに/排出ポンプ26,27,28として発現します。ただし、機能追加による確認アゾール系と 5 フルシトシンの抵抗31ニーズにリンクされた遺伝子の突然変異の効果を遺伝子発現レベルを評価するために分析します。興味深いことに、SNPs の多数はまた分離32,33カ国すべてにおける細胞壁の中心で発見されました。接着EPA6、バイオ フィルム形成を符号化する遺伝子の突然変異は33を比較的よく発生しました。さらに、CMRL 3、CMRL 4、アゾール耐性遺伝子に欠けていた突然変異がなかったこと文書化された Snp EPA1とEPA624,34CMRL 8 を分離します。しかし、全体的にみて、アドヘシンと薬物のマイクで SNPs 間の特定のアソシエーション見つかりませんでした含まれてテスト分離株の数が少ないため。

臨床真菌の WGS の実装には、堅牢な品質管理システムの実装が必要です。実験では、各ステップを同行高品質ゲノム DNA および品質管理のチェックポイントは良い WGS 結果に不可欠です。紫外線吸光度法を用いた検証できるライブラリの準備のためC. glabrataサンプル DNA の純度が提出された (吸光度 260/280 nm から 260/230 nm25。我々 の経験でC. glabrata DNA の 260/280 は 1.8-2 と 2 2.2 間 260/230 の推奨範囲内にあると予想します。DNA 抽出物は、これらの品質要件を満たしていない場合、は、エタノールの沈殿物によって新たに浄化を実行できます。Tagmentation は、バー_コードを一意のシーケンスと呼ばれるインデックス プライマー (多重) シーケンス処理中に複数のサンプルの分化を可能にするための追加の手順は不可欠です。したがって、インデックス作成処理でインデックスの一意性を維持するためにインデックス管とサンプル間の交差汚染を避けるために特別な注意を取られなければなりません。シーケンスの正規化は、シーケンス データにバイアスを導入可能性がありますサンプル DNA ライブラリの生じる違いを排除することを保証します。正規化の手順を使用してビーズによるクリーン アップ通常ライブラリの準備中に発生する可能性があります、ライブラリのサイズに余分な dna ライブラリとバリエーションの除去を可能に。したがって 30 分インキュベーションは、最適なクラスター密度が重要です。Q30 スコア、合計データ出力のようなクラスター密度クローン影響データ品質をシーケンス処理中に大規模な増幅によって生成されるサンプル ライブラリ群の密度であります。Underclustering は高い質のデータを与えるかもしれないが中も出力 overclustering Q30 スコアが低いに対し下のデータになります。DNA ライブラリは、データ品質をシーケンスに干渉できる PCR の一掃ととして正規化中に磁性体ビーズ残渣の無料する必要があります。QPCR 参照株のインデックスの特定のセットからの肯定的な制御 (ATCC のひずみC. glabrataこの場合) など、少なくともいくつかの代表的なサンプル ライブラリで実行してください。平均 Ct 値は、15-18 サイクルの間にする必要があります。この範囲内の任意のサンプルはシーケンス実行のために受諾可能考慮されます。しかし、Ct 値がこの範囲外にある場合、qPCR を繰り返す必要があります。QPCR いずれか低品質入力 DNA またはエラーによりライブラリの準備時に時々 失敗しますサンプル。肯定的な制御の計算に基づいて、良いシーケンス データを生成するライブラリの最小濃度を設立する必要があります。QPCR から得られたライブラリの平均濃度を使用して、シーケンスに追加する最後のライブラリのボリュームを計算できます。これは 1.4-13:08 の間最終的なライブラリの推奨濃度を生成する必要があります。C. glabrataライブラリC. glabrata ATCC 菌株を使用して確立された Ct の範囲は 300 から 500 の平均ライブラリ濃度範囲で 16-18 サイクルの間午後。プールされた変性 DNA ライブラリの対応するボリュームは、クラスター密度の範囲 200-250 K/mm2間の 60-65 μ L の範囲内だった。

シーケンス データ ファイルは、さらに分析の前に反多重送信する必要があります。これは、シーケンス処理が行われた後に、バーコードを使用して、それぞれのライブラリに並べ替えを行うことができます。データ分析の前に FASTQ ファイルの品質トリミングのオプションの手順を実行できます。WGS 由来のシーケンス リードは、標準的なソフトウェア パッケージで作成したカスタム ワークフローを使用して行った。これは低品質の読み取りのトリミングと、参照カンジダゲノムへのマッピングを許可しました。参照ゲノム、CBS138、カンジダゲノム データベース (CGD) からをダウンロードし、解析の前にワークフローにリンクされています。カンジダのゲノムの DNA の存在が繰り返されます (たとえば、付着性遺伝子がある DNA の繰り返し) 短鎖リード シーケンスと SNP 呼び出しの配置が複雑になる可能性があります。これは、マップされたシーケンスの追加のローカル米軍再編によって改善できます。ワークフローから出力された非同義と同義の SNP の位置およびカバレッジ注釈された遺伝子を提供する構造のバリエーションの一覧。これは興味の遺伝子の SNPs を識別し、分離株 (表 6) の最終的な分析レポートを準備する使用されました。

研究のアプローチのいくつかの制限が認められる必要があります。当社の報告書は菌の数が少ないに基づいており臨床真菌真菌 resistome の標準的なデータベースはありません。サンガー DNA の配列は現在より臨床研究所にアクセスできるが、それは同時にカンジダ属菌の薬剤耐性を与える複数の遺伝子変異を検出する機能を限られています (> 20 FKSの変異echinocandin 抵抗だけで)。病理学サービス、シーケンシング コスト、サンガーと比べた WGS の実用性の統合と、シーケンスが増加しそう。しかし、重要な考慮事項は初期研究室のセットアップと WGS 機器実装のコスト、およびエンドユーザーのトレーニング研究者。シーケンス試薬キットおよび付属品を調達、長期的なコストが本質的に含まれます。WGS 楽器が社内ではない場合は、追加料金と高い TAT を期待すべき。さらに、ゲノムの DNA の繰り返し配列の存在は、短鎖リード シーケンスと SNP 呼び出しの配置を複雑にするかもしれない。高品質の参照ゲノム シーケンスを使用して可用性長い読み取り技術は、SNP 識別の品質を維持するのに役立ちます。

将来、WGS は、簡単に身近で臨床医20,22によって解釈する高速トラッキング レポート診断設定の時間によって臨床療法で改善をもたらすと予想されます。これは、小説と薬剤耐性を推論する確証的突然変異のキュレーションと最新の WGS 抗真菌薬抵抗性データベースの開発で実現できます。臨床的に関連する既知のフェノタイプ薬剤感受性酵母のより多くのゲノム分析用になると、新しいマーカーと抗真菌薬耐性機構が検出される可能性が。これらの開発は大幅に多薬剤耐性と薬物の毒性による治療失敗のリスクを削減します。結論としては、適切な品質管理プロトコルの次世代シーケンシングが突然変異表現型真菌学研究所でテストを強化できますカンジダ glabrataで耐性のゲノム規模の検出を可能にします。臨床的に関連するカンジダ属の急速なゲノム配列決定によって提供される洞察力が根本的に抗真菌剤の別のクラスへの抵抗のメカニズムの私達の理解を変更し、侵襲的な患者の管理を向上させる真菌症は。

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Disclosures

著者があるない競合する金銭的な利益とない利益相反を開示します。

Acknowledgments

この作品は、感染症・微生物学・公衆衛生学の中心によって支えられました。著者は、この研究のため他の資金を受信していません。著者は、専門家のアドバイスと支援全ゲノム シーケンス実験 Drs アリシア アーノット、ネイサン バッハマンと Ranjeeta メノンをありがとうございます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DensiCHECK Plus BioMérieux Inc K083536 Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOne TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific YO10 Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific 22-363-605 Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma Aldrich, Merck T2795    Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus MP Biomedicals, LLC 8320921 Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit  Promega  A1120 Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific P7589  Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit Illumina FC-131-1096 Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		 Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2  Illumina FC-404-2004 300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 Kit Illumina FC-404-2003 300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control Kit Illumina FC-110-3001 To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture Kit FC-130-1005  2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		 KAPA Biosystems KK4824 Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system  PerkinElmer YJS4NGS Used for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage Plate Thermo Scientific AB0765B MIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881  Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96 Thermo Fisher Scientific AM10027 Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP  Benchmark Scientific BT1502 96-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR Plate BioRad HSP9601 Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II  Roche  5015278001 Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical  BioRad  MSB1001 Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics Workbench Qiagen CLCBio Software for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrument Illumina  Illumina  Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

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References

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医学、問題 130、カンジダ glabrata も、全ゲノム配列、抗真菌薬剤耐性、カプソファンギン、アゾール、5 フルシトシン、ゲノム-広い分析
検出のマーカーの抗真菌薬剤耐性の<em>カンジダ glabrata</em>の全ゲノム シーケンス
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Biswas, C., Chen, S. C. A.,… More

Biswas, C., Chen, S. C. A., Halliday, C., Martinez, E., Rockett, R. J., Wang, Q., Timms, V. J., Dhakal, R., Sadsad, R., Kennedy, K. J., Playford, G., Marriott, D. J., Slavin, M. A., Sorrell, T. C., Sintchenko, V. Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance. J. Vis. Exp. (130), e56714, doi:10.3791/56714 (2017).

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