Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ganze Genom-Sequenzierung von Candida Glabrata für Erkennung von Markierungen von Antimykotika Resistenz

Published: December 28, 2017 doi: 10.3791/56714
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 4,5, 6, 7, 1,3, 1,2,3
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology-Public Health, Westmead Hospital, 2Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, ICPMR, 3Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity, The University of Sydney, 4Department of Microbiology and Infectious Diseases, Canberra Hospital and Health Services, Australian National University Medical School, 5Infection Management Services, Australian National University Medical School, 6Department of Microbiology and Infectious Diseases, St. Vincent's Hospital, 7Department of Infectious Diseases, Peter MacCallum Cancer Centre
* These authors contributed equally

Summary

Diese Studie implementiert kompletten Genoms für die Analyse von Mutationen in Genen konferieren antimykotische Resistenzen in Candida Glabrata. Resistent gegen Echinocandine, Azole und 5-Flucytosine, C. Glabrata Isolate wurden sequenziert, um die Methodik zu veranschaulichen. Profile der Anfälligkeit der Isolate korreliert mit Vorhandensein oder Fehlen von spezifischen Mutation Muster in den Genen.

Abstract

Candida Glabrata erwerben rasch Mutationen, die zu Resistenzen, vor allem Azole und Echinocandine führen. Identifizierung von genetischen Mutationen ist wichtig, da Widerstand erkannt, dass in-vitro- oft mit klinischen Versagen korreliert werden können. Wir untersuchten die Machbarkeit der Verwendung von kompletten Genoms (WGS) für genomweite Analyse von Antimykotika Resistenzen in C. Glabrata. Das Ziel war Torecognize Enabler und Hindernisse bei der Umsetzung WGS und seine Effektivität zu messen. Dieses Papier beschreibt die wichtigsten Qualitätskontrolle Checkpoints und wesentliche Bestandteile der WGS Methodik, genetische Marker, die mit verringerte Empfänglichkeit gegenüber Antimykotika zu untersuchen. Er schätzt auch die Genauigkeit der Datenanalyse und Zug-um-Zeit der Erprobung.

Phänotypische Anfälligkeit von 12 klinische und ein ATCC Stamm von C. Glabrata wurde durch antimykotische Empfindlichkeitsprüfungen ermittelt. Diese enthalten drei isolieren Paare aus drei Patienten, die Anstieg der Droge minimalen inhibitorischen Konzentration entwickelt. Zwei Paare die zweite jedes Paar entwickelt Resistenz gegen Echinocandine isolieren. Das zweite Isolat des dritten Paares entwickelt Resistenz gegen 5-Flucytosine. Die restlichen bestehend anfällig und Azole resistente Isolate. Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) in Verbindung mit Echinocandin, Azole und 5-Flucytosine Widerstand Gene wurden in resistenten Isolate durch WGS mit der nächsten Generation-Sequenzierung bestätigt.  Non-Synonyme SNPs in antimykotische Widerstand Gene wie FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 und FCY2 wurden identifiziert. Alles in allem, durchschnittlich 98 % des WGS lautet C. Glabrata Isolate auf das Referenz-Genom mit ca. 75-fold lesen Sie Tiefe Abdeckung abgebildet. Die Turnaround-Zeit und die Kosten waren vergleichbar mit Sanger Sequenzierung.

Zusammenfassend war WGS von C. Glabrata möglich bei der Aufdeckung klinisch signifikanten Genmutationen, die Resistenz gegen verschiedene Antimykotika Medikamentenklassen ohne die Notwendigkeit für mehrere PCR/DNA Sequenzierung Reaktionen beteiligt. Dies ist einen positiven Schritt hin zu WGS Fähigkeit im klinischen Labor für simultane Detektion von Antimykotika Widerstand Verleihung Substitutionen.

Introduction

Candida Glabrata ist eine zunehmend auftretende Erreger mit Bedeutung als eine Art, der Widerstand der azole sowie in jüngerer Zeit, die Echinocandine1,2,3aufweist. Im Gegensatz zu den diploiden C. Albicanskönnen die haploide Genom von C. Glabrata Mutationen zu erwerben und entwickeln Multi-Resistenzen leichter. Co-Resistenz an beide Substanzklassen wurde auch berichtet,4. Daher ist frühzeitige Bewertung der pilzbefallverhütende Anfälligkeit und Erkennung von Resistenzen in C. Glabrata entscheidend für die richtige und gezielte Therapie sowie im Zusammenhang mit Antimykotika Treuhandschaft, Fahrer von Antibiotikaresistenzen1 zu begrenzen , 5 , 6. Gründung einen effizienten Workflow, schnell zu erkennen, das Vorhandensein von bestätigenden Mutationen verbunden mit Widerstand Biomarker in resistenten Isolate werden auch Entscheidungen zur Verbesserung der Verschreibung und klinische Ergebnisse.

Pilzbefallverhütende Anfälligkeit bemisst sich in der Regel durch die Messung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) definiert als die niedrigste Wirkstoffkonzentration, die Ergebnisse in einer signifikanten Reduktion Wachstum eines Mikroorganismus im Vergleich zu einem drogenfreien Wachstum Kontrolle. Klinische und Labor Standards Institute (CLSI) und European Committee auf antimikrobielle Empfindlichkeit Testing (EUCAST) haben standardisierte Anfälligkeit Prüfmethoden um MIC Bestimmung, präzise und konsistente7, 8. Bleibt jedoch das Dienstprogramm antimykotische MIC begrenzt, vor allem für die Echinocandine, insbesondere in Bezug auf laborübergreifenden Vergleiche wo sind unterschiedliche Methoden und Bedingungen verwendeten9. Es gibt auch unsicher Korrelation von Mikrofonen mit Reaktion auf Echinocandin Behandlung und Unfähigkeit WT zu unterscheiden (oder anfällig) Isolate von denen beherbergen FKS Mutationen (Echinocandin-resistente Stämme)10,11. Trotz der Verfügbarkeit von bestätigenden Single-gen PCRs und Sanger Sequenzierung von Antimykotika Antibiotikaresistenz-Markern, Realisierung der Ergebnisse ist oft verzögert aufgrund mangelnder simultane Detektion von mehreren Widerstand Markierungen5,12. Gleichzeitige Erfassung von Widerstand konferieren Mutationen an verschiedenen Orten im Genom, aktiviert durch die gesamte Genom-Sequenzierung basierende Analyse bietet somit erhebliche Vorteile gegenüber aktuellen Ansätzen.

Gesamte Genom-Sequenzierung (WGS) wurde erfolgreich umgesetzt, um die Übertragung von Krankheiten während der Ausbrüche als auch einen Ansatz zur genomweiten Risiko Bewertung und Resistenz in Bakterien und Viren13Tests zu verfolgen. Jüngste Fortschritte in der Technologie der Nukleinsäure-Sequenzierung unternommen des kompletten Genoms (WGS) von Krankheitserregern in einen klinisch verwertbare Zug-um-Time technisch und wirtschaftlich machbare. DNA-Sequenzierung bietet wichtige Vorteile gegenüber anderen Methoden der Erreger Identifizierung und Charakterisierung in Mikrobiologie Labors14,15,16beschäftigt. Erstens bietet es eine universelle Lösung mit hohem Durchsatz, Schnelligkeit und Qualität. Sequenzierung kann auf alle Mikroorganismen angewendet werden und ermöglicht Skaleneffekte auf lokaler oder regionaler Laboratorien. Zum anderen produziert sie Daten in einem "zukunftssicher" Format zugänglich Vergleich nationaler und internationaler Ebene. Schließlich hat der potenzielle Nutzen von WGS in der Medizin ergänzt durch das rasante Wachstum der öffentlichen Datenbanken mit Referenz Genome, die entsprechende Datenbanken verknüpft werden können, die zusätzliche klinische und epidemiologische Metadaten17 enthalten ,18.

Jüngsten Studien belegen den Nutzen der WGS zur Identifizierung von Antimykotika Antibiotikaresistenz-Markern von klinischen Isolaten von Candida Spp. 10 , 19 , 20. Dies ist vor allem aufgrund der Verfügbarkeit von Hochdurchsatz-Benchtop-Sequenzer, etablierten Bioinformatik Rohrleitungen und sinkenden Kosten der Sequenzierung21,22. Der Vorteil von Pilz WGS über Sanger-Sequenzierung ist, dass WGS Sequenzierung mehrere Genome auf einem einzigen Lauf ermöglicht. Darüber hinaus können WGS von Candida Genomen Roman Mutationen im Drogeziele zu identifizieren, verfolgen Sie genetische Entwicklung und Entstehung von klinisch relevanten Sequenztypen20,22,23. Im Falle einer intrinsischen multidrug-Resistenz helfen WGS vor allem bei der Früherkennung von Widerstand konferieren Mutationen vor Behandlung Auswahl22,24.

Hier untersuchten wir die Machbarkeit der WGS-fähigen Screening auf Mutationen im Zusammenhang mit Resistenzen auf verschiedene Klassen von Antimykotika. Wir präsentieren eine Methodik für die Durchführung der WGS von End-User und Diagnose Mykologie Labor Perspektiven. Wir enthalten in dieser Analyse, dass drei Paare aus drei separaten klinische Fälle in die in-vitro- Widerstand gegen die Echinocandine und 5-Flucytosine entwickelt im Laufe der Zeit nach antimykotische Behandlung kultiviert zu isolieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Es bedurfte keine ethischen Genehmigung für diese Studie.

(1) Subkultur und Inokulum Vorbereitung auf Candida glabrata

  1. Wählen Sie eine Schalttafel C.glabrata Isolate untersucht werden, auch mindestens ein C. Glabrata American Art Kultur Sammlung (ATCC) mit bekannten Anfälligkeit Muster umfassen sollte.
  2. Subkultur Isolat durch Berühren einer einzigen Kolonie mit einer sterilen Einweg-Kunststoff-Schleife und Streifen auf einem Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) Platte8.
  3. Inkubieren Sie die SDA-Platte für 24-48 h bei 35 ° C für Isolat mit gutem Wachstum in Reinkultur.

2. Bestimmung der pilzbefallverhütende Anfälligkeit

  1. Verwendung eine sterile Einweg Kunststoff Schleife um 4-5 Kolonien von etwa 1 mm Durchmesser aus einem frisch subcultured C. Glabrata isolieren auf SDA-Platte. In 3 mL sterilem destilliertem Wasser Aufschwemmen. Mischen Sie gut durch sanfte Pipettieren um homogene Suspension zu erhalten.
  2. Passen Sie die Zelldichte, 0,5 McFarland, 1 x 106 , 5 x 106 Zellen/mL mit einem Densitometer 8entspricht.
  3. Anfälligkeitstests mit kommerziellen Assay durchzuführen (siehe Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) auf alle C. Glabrata isoliert nach Anweisungen des Herstellers. Interpretieren Sie die Anfälligkeit der Isolate basierend auf daraus resultierende MICs von Antimykotika nach CLSI Richtlinien zu und bereiten Sie Bericht (Tabelle 1)8.

(3) genomische DNA-Extraktion für die Sequenzierung

  1. Aufschwemmen Sie eine Impföse Kolonien von einer frisch gewachsenen SDA-Platte in 300 µL 50 mM EDTA in der 1,5 mL Tube.
  2. Hinzu kommen 40 µL Zymolyase (10 mg/mL) die Aussetzung und sanft Pipettieren 5 Mal bis Aussetzung einheitlich ist.
  3. Inkubation der Probe bei 37 ° C für ca. 1-2 h, die Zellwand zu verdauen. Bei Raumtemperatur für 5 min abkühlen.
  4. Zentrifugieren Sie die Federung bei 14.000 × g für 2 min und dann entfernen Sie vorsichtig den überstand.
  5. Genomischen DNA DNA-Extraktion Kit Richtlinien (siehe Tabelle der Materialien) zu extrahieren.
  6. Aufschwemmen extrahiert DNA-Pellet in 50 µL 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5-8,5) anstelle der Elution Puffer im Kit enthalten.
  7. Überprüfen Sie die Reinheit der DNA durch Messung der optischen Dichte (O.D) um 260/280 nm25.

4. genomische DNA Quantifizierung

  1. Bereiten Sie eine 1 x Tris-EDTA (TE) Puffer im Assay Kit enthalten basierend auf Richtlinien des Herstellers für die Fluoreszenz-Assay (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Verdünnen Sie die DNA-Probe durch Zugabe von 2 µL bis 98 µL 1 x TE-Assay-Puffer (Endvolumen von 100 µL, Verdünnung Faktor 01:50) in eine Einweg-96-well-Platte. Dieser Verdünnungsschritt kann entweder manuell über einen Mehrkanal-Pipette durchgeführt werden oder durch automatisierte Handhabung Workstation Flüssigkeit.
  3. Bereiten Sie das Spektrum der Normen durch Verdünnung der Lambda DNA (100 µg/mL) im Fluoreszenz-Assay Kit enthalten (Tabelle 2) und sind für die Messung zusammen mit Proben.
  4. Fügen Sie 100 µL der Fluoreszenzfarbstoff zu 100 µL DNA-Proben und Standards für die Reaktion verdünnt. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt werden.
  5. Messung der Fluoreszenz aller Proben anhand der Anweisungen des Herstellers.
  6. Plot der Standardkurve mit der Fluoreszenz-Lesungen und berechnen Sie die ursprüngliche Konzentration der DNA-Proben.
  7. Bestimmen Sie die Lautstärke von DNA und 10 mM Tris-Puffer (pH 8) hinzugefügt werden, die DNA-Konzentration auf 0,2 ng/µL einzustellen.
  8. Führen Sie die DNA-Verdünnungen mit automatisierten Flüssigkeit Umgang mit Workstation aus. Dieser Schritt kann auch durch manuelle Pipettieren erreicht werden.

(5) DNA-Bibliothek Vorbereitung

Hinweis: Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung erfolgte nach Herstellerangaben Protokolle und Richtlinien von Unternehmen (Abb. 1A) zur Verfügung gestellt (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Tagmentation und PCR-Amplifikation
    1. Beschriften Sie eine neue 96-Well Hartschalen dünne Wand Platte.
    2. Hinzufügen von 5 µL der quantifizierten Eingabe DNA auf 0,2 ng/µL (1 ng insgesamt) zu jeder Probe gut der Platte.
    3. Jeder gut mit DNA 10 µL Tagmentation-Puffer und 5 µL Puffer Verstärkung hinzu und pipette vorsichtig mischen. Dichtplatte mit einer Haftplatte Dichtung.
    4. Die Platte in einem Thermocycler und führen Sie das folgende PCR-Programm: 55 ° C für 5 min und halten bei 10 ° C. Wenn die Probe 10 ° C erreicht, gehen Sie sofort zu neutralisieren.
    5. Die Platte, die Amplifikate Reaktion zu neutralisieren 5 µL der Neutralisation Puffer hinzu, und pipette vorsichtig mischen. Die Dichtplatte und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Fügen Sie 15 µL der Indizierung PCR Mastermix zu Proben.
    7. Verwenden Sie einen Karton Index Grundierung Röhren zur Verfügung für eine Einrichtung von 96-Well-Plattenformat, so dass jede Probe eine einzigartige Kombination von Indizes basierend auf Index der Vorlage (Tabelle 3 wird).
    8. Index Grundierung Röhren im Index Tellerhalter (Abbildung 1B) unter Verwendung der in der Vorlage auf Tabelle 3 angegebenen Reihenfolge ordnen und die Stellung der Indizes auf der Vorlage aufnehmen.
    9. Legen Sie die Tagmentation Platte mit zusätzlichen PCR Mastermix auf die Tellerhalter Index mit der Index-Rohre in Ordnung.
    10. Setzen Sie Index-Primer 1-Röhren in vertikaler Anordnung und Index Grundierung 2 Röhren in horizontale Anordnung auf dem Index-Rack. Mit einer Mehrkanal-Pipette, sorgfältig fügen Sie 5 µL Index Zündkapseln jede Probe hinzu.
    11. Ersetzen Sie alte Kappen der Index Röhren mit neuen Kappen um Kreuzkontaminationen zwischen Indizes zu vermeiden.
    12. Die Dichtplatte mit klaren 96-Well Platte Versiegelungen und die zweiten PCR wie folgt durchführen: 95 ° C für 30 s, 12 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s und 72 ° C für 5 Minuten.
  2. PCR-Bereinigung
    1. Das PCR-Produkt für die PCR-Bereinigung, von der Tagmentation-Platte, eine Deep-Well-Platte zu übertragen (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Wirbel der kommerziellen magnetische Beads-Lösung (siehe Tabelle der Materialien) basierend auf Angaben des Herstellers und jeder PCR-Produkt in Deep-Well-Platte 30 µL Perlen hinzufügen.
    3. Schütteln Sie die Platte auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 2 min und ohne Schütteln für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Legen Sie die Platte auf ein Magnetstativ für 2 min bis der Überstand abgeklungen.
    5. Den Überstand vorsichtig mit der Platte noch auf die Magnetstativ zu verwerfen.
    6. Fügen Sie 200 µL von frisch zubereiteten 80 % Ethanol mit der Platte auf die Magnetstativ.
    7. Inkubieren Sie die Platte auf die Magnetstativ für 30 s und sorgfältig entfernen und entsorgen den Überstand ohne zu stören die Perlen.
    8. Der Waschschritt wiederholen und die Perlen 15 min. entfernen überschüssige Ethanol ggf. an der Luft trocknen lassen.
    9. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetstativ und die Perlen fügen Sie 52,5 µL Wiederfreisetzung Puffer hinzu.
    10. Schütteln Sie die Platte auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 2 min und ohne Schütteln bei Raumtemperatur für 2 min inkubieren.
    11. Legen Sie die Platte auf die Magnetstativ und erlauben des Überstands zu löschen.
    12. Transfer mit einer Mehrkanal-Pipette, sorgfältig 50 µL des Überstands von der Bereinigung-Platte auf eine neue Hartschalen-Platte.
  3. Bibliothek-Normalisierung
    1. Tauen Sie Bibliothek Normalisierung Reagenzien gemäß Richtlinien des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Übertragen Sie 20 µL des Überstands von der Bereinigung Platte auf einen neuen Deep-Well-Platte.
    3. Fügen Sie 45 µL magnetischer Wulst Suspension und Dichtplatte mit einer Platte-Versiegelung.
    4. Schütteln Sie die Platte auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 30 min. Diese Inkubationszeit ist entscheidend und sollte nicht überschritten werden.
    5. Legen Sie die Platte auf einem Magnetstativ für 2 min und bestätigen Sie, dass der Überstand (Abbildung 1B) gelöscht hat.
    6. Entfernen und entsorgen des Überstands in einem entsprechenden Sondermüll-Behälter mit der Platte noch auf die Magnetstativ.
    7. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetstativ und waschen Sie die Perlen mit 45 µL Waschpuffer.
    8. Schütteln Sie die Platte mit Waschpuffer auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 5 min.
    9. Stellen Sie Platte auf Magnetstativ für 2 min und überstand verwerfen, wenn es klar wird.
    10. Entfernen Sie die Platte aus der magnetischen stehen und wiederholen Sie das Waschen mit Waschpuffer.
    11. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetstativ und fügen Sie 30 µL von 0,1 N NaOH hinzu.
    12. Schütteln Sie die Platte mit 0,1 N NaOH auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 5 min und legen Sie die Platte auf Magnetstativ 2 min. lang oder bis die Flüssigkeit klar ist.
    13. Jede Vertiefung einer neuen 96-Well Hartschalen dünnwandige endgültige normalisierte Bibliothek Platte 30 µL Elution Puffer hinzufügen.
    14. Übertragen Sie 30 µL des Überstands von Normalisierung Platte auf endgültige normalisierte Bibliothek Teller Endvolumen 60 µL zu machen. Die Bibliotheken sind jetzt bereit, sequenziert werden.
  4. Bestimmung der DNA-Bibliothek Konzentration von qPCR
    1. Tauen Sie den Mastermix, Primer und Standards in der qPCR-Kit nach Herstellerangaben (siehe Tabelle der Materialien) zur Verfügung gestellt.
    2. Kombinieren Sie die PCR Reagenz Mastermix und Grundierung mitgelieferten qPCR nach Anweisungen des Herstellers und Aliquote können bei-20 ° c gelagert werden
    3. Um die DNA-Bibliothek-Konzentration zu bestimmen, stellen Sie eine Verdünnung von 1/8000 von den DNA-Bibliotheken mit 10 mM Tris-Puffer (pH 8) durch die Durchführung einer Verdünnung von 1: 100 (1,5 µL DNA-Bibliothek auf 148,5 µL Tris-Puffer), gefolgt von einer Verdünnung von 1: 80 (2 µL von 1: 100 auf 158 µL Tris-Puffer).
    4. Die Verdünnung Platte bei 700 u/min für mindestens 1 Minute schütteln und dann bei 14000 × g für 1 min zentrifugieren.
    5. Bereiten Sie 20 µL der letzten PCR-Reaktion durch Mischen von 4 µL verdünnter DNA-Bibliothek oder DNA-Standards und 16 µL Mastermix vor.
    6. Führen Sie folgenden Einstellungen des Herstellers im Thermocycler PCR: 95 ° C für 5 min, 35 Zyklen von 95 ° C für 30 s und 60 ° C für 45 s und endgültige 65 ° C bis 95 ° C für Schmelze Kurvenanalyse.
    7. Erhalten Sie die Ct-Werte der Probe DNA-Bibliotheken und Standards von qPCR Thermocycler.
    8. Generieren Sie eine Standardkurve aus den Ct-Wert von Standards (Abbildung 2). Definieren Sie den oberen und unteren QC-Bereich von ± 3 Zyklen vom Mittelwert. Beispielsweise ist der Mittelwert Ct Wert 13 Zyklen ist dann der QC-Bereich zwischen 16 und 10 Zyklen.
    9. Die individuelle und durchschnittliche Bibliothek-Konzentrationen (ALC) aus der Standardkurve und Ct-Werte zu bestimmen.
    10. Bestimmen Sie das Volumen der gesamten gepoolten Bibliotheken (PAL) verwendet werden anhand der Berechnung, die unten gegeben werden, für die endgültige Sequenzierung, wenn man bedenkt, dass Zielkonzentration Bibliothek zwischen 1,4-13:08.
      Hinweis: Bibliothek-Konzentration von qPCR erhalten im Durchschnitt = ALC; Gepoolte Bibliotheken (PAL) Gesamt = ALC / 2; Denaturiert PAL (DAL) = PAL * 0.666
      Je nach der Anzahl von DAL, der mit Puffer gemischt wird, ist die Konzentration der Bibliothek hinzugefügt werden, der Messzelle. Zum Beispiel wenn 835 µL Puffer 65 µL der Bibliothek hinzugefügt wird, dann von dieser Verdünnung (Dil 1) 195 wird hinzugefügt auf ein Gesamtvolumen von 1300 µL: (65/900) * DnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = Endkonzentration (sollte zwischen 1,4-13:08)

6. Bibliothek pooling und initiieren Sequenzierung im Benchtop-Sequenzer

  1. Tauen Sie Reagenzkassette nach Richtlinien des Herstellers. Nehmen Sie eine neue Messzelle aus der Packung von 4 ° C Lagerung und bringen auf Raumtemperatur mindestens 30 min vor der Sequenzierung. Puffer-Patrone und prechill Sequenzierung Puffer vor dem Gebrauch herausnehmen (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Bereiten Sie eine Steuerelementbibliothek durch Mischen 5 µL der Bibliothek (1 nM) und 5 µL 0,2 N NaOH. Vortex kurz und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur auf der Steuerelementbibliothek in Einzelstränge zu denaturieren.
  3. Fügen Sie 5 µL 200 mM Tris-HCl, pH 7 und Wirbel. 235 µL prechilled Sequenzierung Puffer hinzufügen und vorsichtig mischen. Das Gesamtvolumen beträgt 250 µL mit Kontrolle Bibliothek Endkonzentration um 20 Uhr.
  4. Pool DNA-Bibliotheken durch die Übertragung von 5 µL jedes Sample-Library von der endgültigen normalisierte Bibliothek-Platte in ein einzelnes Low-Bind 1,5 mL Röhrchen sequenziert werden.
  5. Fügen Sie 30 µL der gepoolten Bibliothek und 30 µL 0,2 N NaOH zu Bibliotheken in einem anderen niedrigen Bind Gefäß zu denaturieren.
  6. Wirbel der niedrig-Bind tube und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur zu Bibliotheken in Einzelstränge zu denaturieren.
  7. Fügen Sie 30 µL 200 mM Tris-HCl, pH 7 und Rohr mit denaturierten Bibliotheken Reaktion zu neutralisieren.
  8. Fügen Sie 65 µL neutralisierte denaturierten Bibliotheken Suspension und 835 µL vorgekühlt Sequenzierung Puffer und Vortex gut mischen.
  9. In einem letzten niedrigen Bind-Rohr verbinden Folgendes: 195 µL aus neutralisierten denaturierten Bibliotheken, 1,30 µL Steuerelementbibliothek und 1103.70 µL Sequenzierung Puffer. Mischen Sie richtig.
  10. Laden Sie den endgültigen Bibliothek Mix (1300 µL) in der dafür vorgesehenen Stelle auf Reagenzkassette.
  11. Aufbau der Sequenzierung durch Eingabe von Projekt-und Probe im Sequenzer gestartet bezeichneten Website nach Richtlinien.
  12. Initiieren Sequenzierung nach Richtlinien. Durchflusszelle, Reagenzkassette mit Bibliotheken und Puffer Patrone in Benchtop-Sequenzer zu laden.
  13. Notieren Sie Batch-Nummern aller Reagenz-Kits und Patronen, die in der Sequenzierung verwendet.

7. Daten herunterladen von Sequenzierung Website

  1. Dateien Sie FASTQ nach Anweisungen des Herstellers auf der Website zur Verfügung gestellt.
  2. Für eine gute Qualität führen Sie, dass der Anteil Q30 ≥ 75 % und Cluster-Dichte liegt zwischen 170-280 K/mm2 mit optimalen bei 200-210 K/mm2 (Tabelle 4).

8. die Sequenzierung Datenanalyse

  1. FASTQ Dateien von sequenzierten Proben in Daten-Analyse-integriertes Software-Paket importieren (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Erstellen Sie einen Sequenzierung Workflow Software durch Hinzufügen von Features aus Liste nämlich trimmen, Zuordnung zu Referenz (Wählen Sie Referenz-Genom), lokale Neuausrichtung und variant Analyse (Bild 3A) Einstellungen in Tabelle 5 aufgeführt.
  3. Führen Sie Workflow durch die Auswahl einer einzigen Probe oder einen Stapel von FASTQ Beispieldateien und speichern Sie Ausgabedateien in dafür vorgesehenen Probe Ordnern zu.
  4. Bericht für Sequenz Abdeckung Tiefe, zugeordneten Regionen und Liste der strukturellen Varianten im Genom (Abbildung 3B) generieren.
  5. Verwenden Sie Liste der strukturellen Varianten zum suchen nicht gleichbedeutend single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) in den Genen verleiht Resistenz und Virulenz.
  6. Bericht von SNP Lage, gen und Anzahl der resistenten oder anfällig Isolate (Tabelle 6) auflisten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dreizehn C. Glabrata bestehend aus C. Glabrata ATCC 90030 und 12 Isolaten aus der klinischen Mykologie Referenzlabor (isoliert CMRL1, CMRL12), Westmead Hospital, Sydney wurden untersucht (Tabelle 1). Dazu gehörten die drei Paare von Isolaten CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 und CMRL-/ CMRL 5-6 vor und nach der antimykotischen Therapie mit keine epidemiologischen Zusammenhänge zwischen ihnen erhalten 24 (Tabelle 1).

Die Mikrofone wurden anhand CLSI interpretativen Haltepunkt für neun Antimykotika nämlich Amphotericin (AMB), Anidulafungin (ANI), Hautausschlag (MIF), Caspofungin (CAS), 5-Flucytosine (5-Fu), Posaconazol (POS), Voriconazol (VRC), Itraconazol () ITR) und Fluconazol (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 und Candida ausdrücklich ATCC 6258 dienten als Qualitätskontrolle Stämmen. Unter das isolieren paar CMRL-1 und CMRL-2, war der zweite isolieren CMRL-2 resistent gegenüber Caspofungin (MIC 8 vs. 0,12 mg/L, Tabelle 1). CMRL-2 hatte auch ähnliche proportional steigt in die Mikrofone von Anidulafungin und Hautausschlag (≥ 0,5 mg/L) in-vitro- Resistenz gegen alle drei Echinocandine24führt. Ebenso entwickelte Isolat CMRL-4 Echinocandin Widerstand als Isolat CMRL-3 (Tabelle 1). Zwischen dem dritten paar isolieren CMRL-6 hatte einen 5-Flucytosine MIC (> 64 vs. 0,06 mg/L)24. Beide diese isolieren Paare waren anfällig/Wildtyp (WT) zu anderen Antimykotika getestet. Isolieren CMRL-6 und CMRL-12 erwiesen sich beständig oder nicht-WT, alle Azole. CMRL-7 war resistent gegen Fluconazol und nicht-WT, Voriconazol (Tabelle 1). C. Glabrata ATCC 90030 und Isolate CMRL-8 CMRL-11 waren anfällig anfällig/WT auf alle Antimykotika24.

WGS 13 Isolate erfolgte mittels des Benchtop-Sequencers. Im Durchschnitt ein Lauf Mitte Ausgabe Sequenzierung ergab 27-40 GB Daten mit einer Fehlerquote zwischen 0,5-1,4 %. Die durchschnittliche Prozentsatz Q30 erhalten war in der Regel ca. 80-85 %. Die Fluss-Cluster Zelldichte (K/mm2) lagen zwischen 200-250 (Tabelle 4). Die rohen Sequenzdaten aus dieser Studie wurden bei NCBI Reihenfolge lesen Archiv (SRA) unter der Projektnummer PRJNA310057 hinterlegt. 98 % der Sequenzierung liest C. Glabrata Bezug Genom (Stamm CBS138) durch Analyse in integrierte Software zur Datenanalyse zugeordnet. Im Durchschnitt lesen Sie Tiefe Abdeckung 75 X mit durchschnittlichen Länge von 143-BP. strukturelle variant-Erkennung identifiziert und mehr als 50, 000 SNPs pro Isolat zu lesen war. Insbesondere wurden bei der Analyse die Stamm-Paare waren CMRL1/CMRL-2, insgesamt SNPs gefunden auf jedes Isolat rund 79.000 CMRL-3/CMRL-4, die Gesamtzahl der SNPs rund 60.000 und für CMRL-5/CMRL-6, mehr als 56.000 im Vergleich zu CBS13824. Der SNP Unterschied zwischen Isolate in einem Stamm-paar war weniger als 25.

Basierend auf dem Anfälligkeit Profil der Isolate, Widerstand, die Biomarker für Analyse24, insbesondere ausgewählt wurden bekannt, FKS2 und FKS3 (Echinocandin Widerstand), FCY1 , FKS1und FCY2 (5) Flucytosine Widerstand), und ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 und CgFLR1 (Azole Widerstand). Die Gene wurden zum bekannten Mutationen und die Häufigkeit der SNP vorkommen überprüft. Nur nicht gleichbedeutend SNPs in Genen mit Tiefe Abdeckung von ≥20 d.h. lesen, wurden qualitativ hochwertige SNPs (hq-SNPs) speziell untersucht.

Insbesondere wurden FKS Mutationen im Genom der beiden Echinocandin-resistente Isolate24identifiziert. Der ersten beiden Paare, die Echinocandin resistenter Isolate CMRL-2 hegte eine einzige Mutation FKS2 S629P und CMRL-4, die FKS2 Mutation S663P (Tabelle 6). Das dritte Paar fand ein SNP in FCY2 (Ala237Thr) in CMRL-5 (5-Flucytosine anfällig) und CMRL-6 (resistent) (Tabelle 6). SNPs in FCY2 fanden sich jedoch auch in anderen phänotypisch WT Isolate (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24. Isolate CMRL-6 und CMRL-12 waren bemerkenswert für ihre Pan-Azole resistent/non-WT Charakter und hatte SNPs in CgCDR1 (Codierung Azole Efflux Pumpen) und CgPDR1 (Codierung der Transkriptionsfaktor reguliert die Efflux-Pumpen) (Tabelle 6)26 ,27. Die Anwesenheit von Mutationen in ein anderes Efflux-Pumpen-gen, trat CgFLR1 in beiden Azole anfällig und Azole-resistente Isolate26,28. Untersuchung für SNPs innerhalb der ERG9 (Codierung Squalen-Synthase) ergab Mutationen, aber es gab keine Mutationen in ERG1124identifiziert.

WGS Analyse ergab auch mehrere nicht gleichbedeutend SNPs in Candida Zellwand Adhäsion Gene nämlich EPA1, EPA6, PWP2 und PWP5. EPA6 -Mutationen wurden in 9/12-Isolate. SNPs in PWP2 und PWP5 waren auch fast alle Isolate, mit Ausnahme von Isolaten CMRL-1 und CMRL-11-24.

Isolieren AMB ANI MIF CAS 5-FC POS VRC ITR FLC Interpretation der pilzbefallverhütende Anfälligkeit Gene, die Übertragung der Widerstand von WGS identifiziert
CMRL-1 0,5 0,03 < 0,008 0.12 < 0,06 0,5 0.12 0,25 8 Anfällig für alle -
CMRL-2 0,5 1 1 8 < 0,06 0,25 0,06 0.12 4 Resistent gegenüber allen Echinocandine nur FKS1
CMRL-3 0,25 0,015 0,015 0.12 < 0,06 1 0,25 0,5 8 Anfällig für alle -
CMRL-4 2 1 1 > 8 < 0,06 0,5 0.12 0,25 8 Resistent gegenüber allen Echinocandine nur FKS2
CMRL-5 1 0.12 0,015 0.12 < 0,06 1 0,5 0,5 16 Anfällig für alle -
CMRL-6 1 0,06 0,015 0,06 > 64 > 8 8 > 16 256 Resistent gegen 5-FC und Azole FCY2, CgPDR1, CgCDR1
CMRL-7 0,25 0,06 0,015 0,25 < 0,06 1 8 0,5 256 Resistent gegen alle Azole nur CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1
CMRL-8 0,5 0,03 0,008 0,06 < 0,06 0,5 0,25 0,25 4 Anfällig für alle -
CMRL-9 1 0,03 0,015 0,25 < 0,06 1 0,5 1 16 Anfällig für alle -
CMRL-10 1 0,03 < 0,008 0,5 < 0,06 1 0,5 0,5 16 Anfällig für alle -
CMRL-11 0,5 0,03 < 0,008 0,03 < 0,06 0,5 0,25 0,5 8 Anfällig für alle -
CMRL-12 0,5 0,03 0,015 0,06 < 0,06 > 8 2 8 128 Resistent gegen alle Azole nur CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1
ATCC 90030 1 0,03 0,015 0,06 < 0,06 1 0,5 0,5 8 Anfällig für alle -
Abkürzungen: MIC, minimale inhibitorische Konzentration; AMB, Amphotericin B; ANI, Anidulafungin; CAS, Caspofungin; FLC, Fluconazol; ITR, Itraconazol; MIF, Hautausschlag; POS, Posaconazol; VRC, Voriconazol; 5-FC 5-Flucytosine.

Tabelle 1. In-vitro- Empfindlichkeit von 13 Candida Glabrata isoliert einschließlich CMRL-1/CMRL-2, isolieren CMRL-3/CMRL-4 und CMRL-/ CMRL 5-6 Paare vor und nach antimykotische Therapie

Normen DNA-Normvolumen (μL) 1 X TE-Puffer Reagenz (μL) Gesamt in 96-Well-Platte (μL) Endgültige DNA-Konzentration (ng/mL)
Std-Pico 1 8 (standard-DNA Rohr 100 µg/mL) 1992 100 200 1000
Std-Pico 2 10 (Std-Pico 1) 90 100 200 100
Std - Pico 3 5 (von Std-Pico 1) 95 100 200 50
Std-Pico 4 2 (ab 1 Std-Pico) 198 100 200 10
Std-Pico 5 10 (Std-Pico 4) 90 100 200 1
Leere - 100 100 200 Leere

Tabelle 2. Protokoll für die Zubereitung von Standards für die Standardkurve Generation für DNA-Quantifizierung

Figure 1
Abbildung 1 . Sequenzierung Workflow: (A) einen Überblick über wichtige analytische Schritte für die Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung auf einem Benchtop-Sequenzer. (B) wichtige Komponenten für DNA-Bibliothek Vorbereitung wie (links nach rechts) index Tellerhalter für Anordnung der Indizes bei der Indizierung und magnetische Rack mit tief 96-Well-Platte für magnetische Bead basierte clean-Up von DNA-Bibliotheken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Index
Serie A		 N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715
A S502 Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Beispiel 8 Beispiel 9 Beispiel 10 Beispiel 11 Beispiel 12
B S503 Beispiel 13 Probe 14 Beispiel 15 Beispiel 16 Beispiel 17 Beispiel 18 Beispiel 19 Probe 20 Beispiel 21 Beispiel 22 Beispiel 23 Probe 24
C S505 Probe 25 Probe 26 Probe 27 Probe 28 Probe 29 Beispiel 30 Probe 31 Beispiel 32 Probe 33 Probe 34 Probe 35 Probe 36
D S506 Probe 37 Probe 38 Probe 39 Beispiel 40 Probe 41 Probe 42 Stichprobe 43 Beispiel 44 Beispiel 45 Probe 46 Beispiel 47 Probe 48
E S507 Beispiel 49 Probe 50 Beispiel 51 Probe 52 Probe 53 Beispiel 54 Beispiel 55 Probe 56 Probe 57 Probe 58 Probe 59 Probe 60
F S508 Probe 61 Probe 62 Muster 63 Beispiel 64 Probe 65 Probe 66 Probe 67 Probe 68 Probe 69 Probe 70 Probe 71 Probe 72
G S510 Probe 73 Probe 74 Probe 75 Probe 76 Probe 77 Probe 78 Probe 79 Probe 80 Beispiel 81 Probe 82 Probe 83 Beispiel 84
H S511 Probe 85 Muster 86 Probe 87 Probe 88 Probe 89 Probe 90 Probe-91 Probe-92 Probe-93 Probe-94 Probe-95 Probe-96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Index-Set B N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729
A S502 Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Beispiel 8 Beispiel 9 Beispiel 10 Beispiel 11 Beispiel 12
B S503 Beispiel 13 Probe 14 Beispiel 15 Beispiel 16 Beispiel 17 Beispiel 18 Beispiel 19 Probe 20 Beispiel 21 Beispiel 22 Beispiel 23 Probe 24
C S505 Probe 25 Probe 26 Probe 27 Probe 28 Probe 29 Beispiel 30 Probe 31 Beispiel 32 Probe 33 Probe 34 Probe 35 Probe 36
D S506 Probe 37 Probe 38 Probe 39 Beispiel 40 Probe 41 Probe 42 Stichprobe 43 Beispiel 44 Beispiel 45 Probe 46 Beispiel 47 Probe 48
E S507 Beispiel 49 Probe 50 Beispiel 51 Probe 52 Probe 53 Beispiel 54 Beispiel 55 Probe 56 Probe 57 Probe 58 Probe 59 Probe 60
F S508 Probe 61 Probe 62 Muster 63 Beispiel 64 Probe 65 Probe 66 Probe 67 Probe 68 Probe 69 Probe 70 Probe 71 Probe 72
G S510 Probe 73 Probe 74 Probe 75 Probe 76 Probe 77 Probe 78 Probe 79 Probe 80 Beispiel 81 Probe 82 Probe 83 Beispiel 84
H S511 Probe 85 Muster 86 Probe 87 Probe 88 Probe 89 Probe 90 Probe-91 Probe-92 Probe-93 Probe-94 Probe-95 Probe-96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Index-Set C N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715
A S513 Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Beispiel 8 Beispiel 9 Beispiel 10 Beispiel 11 Beispiel 12
B S515 Beispiel 13 Probe 14 Beispiel 15 Beispiel 16 Beispiel 17 Beispiel 18 Beispiel 19 Probe 20 Beispiel 21 Beispiel 22 Beispiel 23 Probe 24
C S516 Probe 25 Probe 26 Probe 27 Probe 28 Probe 29 Beispiel 30 Probe 31 Beispiel 32 Probe 33 Probe 34 Probe 35 Probe 36
D S517 Probe 37 Probe 38 Probe 39 Beispiel 40 Probe 41 Probe 42 Stichprobe 43 Beispiel 44 Beispiel 45 Probe 46 Beispiel 47 Probe 48
E S518 Beispiel 49 Probe 50 Beispiel 51 Probe 52 Probe 53 Beispiel 54 Beispiel 55 Probe 56 Probe 57 Probe 58 Probe 59 Probe 60
F S520 Probe 61 Probe 62 Muster 63 Beispiel 64 Probe 65 Probe 66 Probe 67 Probe 68 Probe 69 Probe 70 Probe 71 Probe 72
G S521 Probe 73 Probe 74 Probe 75 Probe 76 Probe 77 Probe 78 Probe 79 Probe 80 Beispiel 81 Probe 82 Probe 83 Beispiel 84
H S522 Probe 85 Muster 86 Probe 87 Probe 88 Probe 89 Probe 90 Probe-91 Probe-92 Probe-93 Probe-94 Probe-95 Probe-96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Index-Gruppe D N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729
A S513 Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Beispiel 8 Beispiel 9 Beispiel 10 Beispiel 11 Beispiel 12
B S515 Beispiel 13 Probe 14 Beispiel 15 Beispiel 16 Beispiel 17 Beispiel 18 Beispiel 19 Probe 20 Beispiel 21 Beispiel 22 Beispiel 23 Probe 24
C S516 Probe 25 Probe 26 Probe 27 Probe 28 Probe 29 Beispiel 30 Probe 31 Beispiel 32 Probe 33 Probe 34 Probe 35 Probe 36
D S517 Probe 37 Probe 38 Probe 39 Beispiel 40 Probe 41 Probe 42 Stichprobe 43 Beispiel 44 Beispiel 45 Probe 46 Beispiel 47 Probe 48
E S518 Beispiel 49 Probe 50 Beispiel 51 Probe 52 Probe 53 Beispiel 54 Beispiel 55 Probe 56 Probe 57 Probe 58 Probe 59 Probe 60
F S520 Probe 61 Probe 62 Muster 63 Beispiel 64 Probe 65 Probe 66 Probe 67 Probe 68 Probe 69 Probe 70 Probe 71 Probe 72
G S521 Probe 73 Probe 74 Probe 75 Probe 76 Probe 77 Probe 78 Probe 79 Probe 80 Beispiel 81 Probe 82 Probe 83 Beispiel 84
H S522 Probe 85 Muster 86 Probe 87 Probe 88 Probe 89 Probe 90 Probe-91 Probe-92 Probe-93 Probe-94 Probe-95 Probe-96

Tabelle 3. Vorlage von anderen Index-Arrangement

Figure 2
Abbildung 2 : Ein standard Diagramm generiert mit der Ct-Werte der Normen. Verwenden Sie die Standardkurve Achsenabschnitt und Steigung Werte zur Bestimmung der durchschnittlichen Bibliothek Konzentration von Ct-Wert von Sample-Bibliotheken in Duplikate. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Metriken Standard-Werte Erhaltenen Werte (Durchschnitt)
Ertrag 32,5-50 Gb für Mid-Ausgang 42 Gb für Mid-Ausgang
100-130 Gb für Hochleistungs 120 Gb für Hochleistungs
Prozentsatz Q30 ≥ 75 % 80 %
Cluster-Dichte 170-230 K/mm2, Optimal bei 200 K/mm2 210 K/mm2.
Cluster bestehen Filter > 70 % 89.09 %
Intensität mit dem Fahrrad Über 1000 für jede Kachel in Durchflusszelle Über 1500 für jede Kachel in Durchflusszelle
Fehlerquote Unter 1,5 1.4

Tabelle 4. Metriken für ein standard-Sequenzierung im Benchtop Sequencer ausgeführt

Figure 3
Abbildung 3 : Sequenzierung Datenanalyse-Software. (A) erstellen Sie einen gewünschte Workflow einschließlich Sequenz trimmen, Zuordnung zu Referenz- und Qualität basierte Variante erkennen. Führen Sie Workflow durch die Auswahl FASTQ Beispieldateien (einzelne oder mehrere Proben im Batch). (B) Liste der strukturellen Varianten zeigen Referenzposition, Abdeckung, Nukleotid ändern und Aminosäure-Änderung für die Analyse der Probe Sequenzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

1. Schneiden Sie Sequenzen Einstellung verwendet
Grundlagen zu trimmen Standard-Einstellungen
Filtern Sie nach Länge mit maximal Nukleotid in mal gelesen 1000
Filtern Sie nach Länge mit minimalen Anzahl von Nukleotid in mal gelesen 50
2. Zuordnung liest zu verweisen
Referenz ausgewählt CBS138
Referenz-Maskierung mit Maskierung Modus Keine Maskierung
Mapping-Optionen Standard-Einstellungen
3. lokale Neuausrichtung
Ausrichtungseinstellungen Standard-Einstellungen
4. Qualität basierte Variante Erkennung
Nachbarschaft-radius 5
Lücke und Missverhältnis Mindestpunktzahl 2
Minimale Nachbarschaft Qualität 15
Mindestanforderungen an die zentrale Qualität 20
Filter zu lesen Standard-Einstellungen
Mindestdeckung 4
Minimale Variante Häufigkeit (%) 75
Variant-Filter Standard-Einstellungen
Maximale erwartete Allele (Diploidie) 2
Genetischen code Standard

Tabelle 5. Workflow-Parameter und Einstellungen in der Software

Strukturelle Variante Nukleotid-Position Gen Gefäßsystem Gefunden in
Anzahl der
Isolate		 Resistente Isolate Anfällig für Isolate
SNP_Cg_95352_S629P_fks1 CgFKS1 CAS, ANI, MIF 1 CMRL-2 -
SNP_Cg_375361_S633P_fk2 CgFKS2 CAS, ANI, MIF 1 CMRL-4 -
SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 CgFCY2 5-FC 2 CMRL-6 CMRL-5
SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 CgFCY2 5-FC 2 0 CMRL-1, CMRL-2
SNP_Cg_720995_C128F_erg9 CgERG9 FLC, POS, VRC, ITR 3 CMRL-6 CMRL-5, CMRL-10
SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 CgPDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-6 -
SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 CgPDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-7 -
SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 CgPDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 0 CMRL-11
SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 CgPDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-12 -
SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 CgCDR1 FLC, POS, VRC, ITR 5 CMRL-6, CMRL-12 CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11
SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 CgCDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-7 -
SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 CgCDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-7 -
SNP_Cg_589884_I116V_flr1 CgFLR1 FLC, POS, VRC, ITR 4 CMRL-7 CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9
SNP_Cg_589470_V254I_flr1 CgFLR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-12 -

Tabelle 6. Bericht des strukturellen Variante Position in Genen verbunden mit Antimykotika Resistenzen in der Reihe von Isolaten von C. Glabrata gefunden

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Diese Studie stellte fest, Machbarkeit, ungefähre Timelines und Präzision der WGS-geführte Nachweis von Resistenzen in C. Glabrata. Die Bearbeitungszeit (TAT) für die Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung wurde vier Tage und Berichterstattung der analysierten Ergebnisse ein bis zwei Tage. Im Vergleich dazu mindestens einer ähnlichen Menge TAT für Anfälligkeit Assays von Kultur Teller und Sanger-Sequenzierung mit deutlich höheren Anzahl von Proben. Ca. 30-90 C. Glabrata Genome sequenziert werden können, basierend auf Sequenzierung Durchflusszelle Kapazität, mit 80-100 % Sequenzierung Abdeckung. Da die Sequenzierung auf einem hauseigenen WGS Laboraufbau durchgeführt wurde, die Kosten/Ressourcen-Anforderungen in dieser Studie entsprach zu laufenden Kosten der Sanger Rüst- und Sonde-based Assays mit geschätzten Kosten von 80-100 AUD pro Probe. Anfälligkeit der alle Isolate wurden bestimmt durch ein kommerziellen Assay-Kit, die visuell mit einem Lesung Spiegel gelesen wurden. Kultur Wachstum war gekennzeichnet durch Änderung der kolorimetrischen Wachstum Indikator von blau bis rosa. MIC wurde als die ersten blauen gut gelesen, nachdem eine Reihe von Rosa (Wachstum) d. h. Brunnen die niedrigste Konzentration von Antimykotikum, das im wesentlichen Wachstum hemmt. Für WGS waren genomische DNA-Bibliotheken mit der Bibliothek Vorbereitungssatz zubereitet. Die isolieren Bibliotheken wurden von qPCR quantifiziert. Die quantifizierten Bibliotheken wurden für die endgültige Sequenzierung durchgeführt in der Benchtop-Sequencer ausführen zusammengeführt.

In unserer Analyse das Vorhandensein von SNPs in Gene verleiht Resistenz bei Isolaten korreliert gut mit dem erhöhten in-vitro- MIC gegen die Drogen. Die MutationenS629P in FKS1 und S663P in FKS2 identifiziert wurden Widerstand gegen die Echinocandine eindeutig zugeordnet. Beide Mutationen sind bekannt, phänotypische Resistenz29,30übertragen. Gleichzeitige genomweite Sequenzierung ergab auch Mutationen in Genen, die in Verbindung mit 5-Flucytosine (gen FCY2) und Azole Widerstand (CgPDR1, CgCDR1 und CgFLR1), die mit Widerstand durch Aktivierung / Überexpression Efflux Pumpen26,27,28. Jedoch die Auswirkungen von Mutationen in den Genen verbunden mit Azole und 5-Flucytosine Widerstand31 muss durch zusätzliche funktionale bestätigt werden analysiert, um die Gen-Expression zu beurteilen. Interessanterweise fanden große Anzahl von SNPs auch in Zellwand Adhesins alle Isolate32,33. Mutationen im gen Haftung EPA6, die Biofilmbildung, kodiert ist relativ häufig33aufgetreten. Darüber hinaus isoliert CMRL-3, CMRL-4 und CMRL-8, dass fehlte Mutationen in Genen Azole keine dokumentierten SNPs in EPA1 und EPA624,34 hatte. Jedoch konnte aufgrund der geringen Anzahl von Test-Isolate enthalten insgesamt keine spezifische Assoziation zwischen der SNPs in Adhesins und Droge Mikrofone gefunden werden.

Die Umsetzung der WGS in klinische Mykologie erfordert die Umsetzung der robuste Qualität-Management-System. Qualitativ hochwertige genomische DNA und Qualitätskontrolle Prüfpunkte, die jeden Schritt im Experiment zu begleiten ist essentiell für ein gutes Ergebnis der WGS. Die Reinheit des C. Glabrata Probe DNA eingereicht für Bibliothek Vorbereitung mit UV Absorption Methode validiert werden kann (Extinktion bei 260/280 nm und 260/230 nm25. Nach unserer Erfahrung ist für C. Glabrata DNA 260/280 voraussichtlich innerhalb des empfohlenen Bereichs von 1,8-2 und für 260/230 zwischen 2-2.2. Wenn DNA Extrakte diese Qualitätsanforderungen nicht erfüllen, kann zusätzliche Reinigung durch Ethanol-Fällung durchgeführt werden. Tagmentation ist ein wesentlicher Schritt des Hinzufügens von eindeutigen Strichcode Sequenzen genannt Index Primer so Differenzierung mehrere Probe während der Sequenzierung (multiplexing) zu ermöglichen. Daher muss in den Indizierungsprozess Extravorsicht geboten, um Kreuzkontaminationen zwischen Index Röhren und Proben zu vermeiden, um die Einzigartigkeit der Indizes zu erhalten. Normierung in der Sequenzierung wird sichergestellt, dass Differenzen in der Probe DNA-Bibliotheken, die Verzerrungen bei der Sequenzierungsdaten führen könnten entfällt. Eine Normalisierung Schritt mit Wulst basierte Aufräumarbeiten in der Regel Entfernung von überschüssigen DNA-Fragmente, Bibliothek und Variationen in Bibliotheksgröße ermöglicht, die während der Bibliothek Zubereitung entstehen können. Daher ist die 30 min Inkubation für optimale Cluster Dichte entscheidend. Cluster-Dichte ist die Dichte der klonalen Cluster Sample-Libraries, die durch massive Verstärkung während Sequenzierung Einflüsse Datenqualität wie Q30 Partituren und total Datenausgabe erzeugt. Während underclustering hohe Datenqualität geben könnte, führt es auch zu niedrigeren Datenausgabe während niedrige Q30 Werte overclustering. Die DNA-Bibliotheken sollte frei von magnetischer Wulst Rückständen während PCR Bereinigung und Normalisierung als, die Sequenzierung Datenqualität beeinträchtigen können. QPCR sollte mindestens ein paar repräsentative Stichprobe Bibliotheken einschließlich einen Referenz-Stamm als Positivkontrolle (ATCC Stamm von C. Glabrata in diesem Fall) von einer bestimmten Gruppe von Indizes erfolgen. Die durchschnittliche Ct-Werte sollte zwischen 15-18 Zyklen. Jede Probe innerhalb dieses Bereichs ist für die Sequenzierung Lauf akzeptabel. Wenn die Ct-Werte außerhalb dieses Bereichs sind sollte der qPCR wiederholt werden. Proben können manchmal fehlschlagen, qPCR aufgrund von geringer Qualität Eingabe DNA oder Fehler bei der Vorbereitung der Bibliothek. Nach den Berechnungen von der Positivkontrolle sollte die minimale Konzentration der Bibliotheken, die gute Sequenzdaten produzieren wird eingerichtet werden. Die durchschnittliche Konzentration der gewonnenen qPCR-Bibliotheken verwenden, kann das Volumen der letzten Bibliothek für die Sequenzierung hinzugefügt werden berechnet werden. Dies sollte die empfohlene letzte Bibliothek-Konzentration zwischen 1,4-13:08 produzieren. Bei C. Glabrata Bibliotheken, der etablierten Ct-Bereich mit C. Glabrata ATCC Isolat wurde zwischen 16-18 Zyklen mit einer durchschnittlichen Bibliothek Konzentrationsbereich von 300-500 pM. Das entsprechende Volumen von gepoolten denaturierten DNA-Bibliotheken wurde im Bereich von 60-65 µL für einen Cluster Dichteumfang zwischen 200-250 K/mm2.

Die Sequenz-Datendateien sollte vor der weiteren Analyse demultiplexed. Dies kann erreicht werden durch das Sortieren in ihren jeweiligen Bibliotheken über ihre Barcodes nach Sequenzierung stattgefunden hat. Ein optionaler Schritt Qualität Trimmen der FASTQ Dateien kann vor der Datenanalyse durchgeführt werden. Die Reihenfolge lautet der Isolate von WGS wurden analysiert mit einem benutzerdefinierten Workflow in einem standard-Software-Paket erstellt. Dies ermöglichte es beschneiden von minderwertigen liest und dann die Referenz Candida Genom zuordnen. Das Referenz-Genom, CBS138, wurde heruntergeladen von Candida -Genom-Datenbank (CGD) und an den Workflow vor der Analyse verknüpft. Das Vorhandensein von DNA in das Genom von Candida wiederholt (z. B. Adhäsin Gene haben DNA-Wiederholungen) kann die Ausrichtung der kurz-lesen-Sequenzen und die SNP Berufung erschweren. Dies kann durch die zusätzliche lokale Neuausrichtung der zugeordneten Sequenzen verbessert werden. Der Ausgang aus dem Workflow war eine strukturelle Varianten-Liste, die annotierten Gene nicht Synonym und gleichbedeutend SNP Positionen und Berichterstattung zur Verfügung. Dies wurde zur SNPs in den Genen von Interesse zu identifizieren und den letzten Endes erstellt für die Isolate (Tabelle 6).

Einige Einschränkungen unserer Studie und Ansatz sollte anerkannt werden. Unser Bericht basiert auf kleinen Anzahl von Isolaten und es gibt keine standard Pilz Resistom Datenbank für klinische Mykologie. Obwohl Sanger-Sequenzierung für klinische Labors derzeit leichter zugänglich ist, es hat begrenzte Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Genmutationen, die Resistenzen in Candida spp. verleihen (> 20 FKS Mutationen für Echinocandin Widerstand allein). Mit Konsolidierung der Pathologie Dienste und sinkende Kosten der Sequenzierung, die Zweckmäßigkeit der Verwendung WGS über Sanger-Sequenzierung, dürfte zunehmen. Ein wichtiger Aspekt ist jedoch die ersten Laboraufbau und WGS Instrument Implementierungskosten sowie Endbenutzerschulungen des Laborpersonals. Langfristig Kosten beinhalten im Wesentlichen, Beschaffung von Sequenzierung Reagenz Kits und Zubehör. Zusätzliche Kosten und eine höhere TAT sollte erwartet werden, wenn die WGS-Instrument nicht im Haus ist. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von wiederholten DNA-Sequenzen im Genom die Ausrichtung der kurz-lesen-Sequenzen und die SNP Berufung erschweren. Die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Referenz Genome sequenziert mit lang-lesen, dass Technologien dazu beitragen werden, um die Qualität der SNP Identifikation zu erhalten.

In Zukunft wird WGS voraussichtlich bringen Verbesserungen in der klinischen Therapie durch Fast-Tracking-Berichtszeitpunkt in Diagnoseeinstellungen, die leicht zugänglich und interpretiert von Klinikern20,22ist. Dies lässt sich mit der Entwicklung der kuratierte und aktuelle WGS pilzbefallverhütende Droge Widerstand Datenbanken von Roman und bestätigende Mutationen, antimykotische Widerstand abzuleiten. Sobald weitere Genome von klinisch relevanten Hefen der bekannten phänotypischen Droge Anfälligkeit zur Analyse vorliegen, dürften neue Marker und Resistenzmechanismen pilzbefallverhütende Droge entdeckt zu werden. Diese Entwicklungen werden Risiken der Behandlung Ausfälle durch Multi-Resistenzen und Medikamententoxizität erheblich. Zusammenfassend kann die nächste Generation-Sequenzierung mit entsprechender Qualität-Management-Protokolle genomweite Detektion von Mutationen verleihen Resistenz bei Candida Glabrata die phänotypische Tests im Labor Mykologie erweitern können. Die Erkenntnisse von rapid Genomsequenzierung von klinisch relevanten Candida Spp können grundlegend ändern unser Verständnis der Mechanismen der Resistenz in verschiedene Klassen von Antimykotika und verbessern die Behandlung von Patienten mit invasiven Pilzkrankheiten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt und keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom Zentrum für Infektionskrankheiten und Mikrobiologie, die öffentliche Gesundheit unterstützt. Die Autoren erhielten keine anderen Mittel für diese Studie nicht. Die Autoren danken Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann und Ranjeeta Menon für ihre kompetente Beratung und Unterstützung mit dem gesamten Genom-Sequenzierung-Experiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DensiCHECK Plus BioMérieux Inc K083536 Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOne TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific YO10 Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific 22-363-605 Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma Aldrich, Merck T2795    Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus MP Biomedicals, LLC 8320921 Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit  Promega  A1120 Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific P7589  Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit Illumina FC-131-1096 Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		 Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2  Illumina FC-404-2004 300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 Kit Illumina FC-404-2003 300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control Kit Illumina FC-110-3001 To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture Kit FC-130-1005  2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		 KAPA Biosystems KK4824 Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system  PerkinElmer YJS4NGS Used for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage Plate Thermo Scientific AB0765B MIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881  Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96 Thermo Fisher Scientific AM10027 Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP  Benchmark Scientific BT1502 96-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR Plate BioRad HSP9601 Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II  Roche  5015278001 Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical  BioRad  MSB1001 Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics Workbench Qiagen CLCBio Software for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrument Illumina  Illumina  Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
  3. Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
  4. Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
  6. Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
  7. Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
  8. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
  9. Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
  10. Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
  11. Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
  12. Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
  13. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  14. Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
  15. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
  16. Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
  17. Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
  18. Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
  19. Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
  20. Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
  21. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
  22. Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
  23. Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
  24. Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
  25. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  26. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
  27. Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
  28. Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
  29. Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
  30. Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
  31. Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
  32. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
  33. de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
  34. Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).

Tags

Medizin Ausgabe 130 Candida Glabrata kompletten Genoms antimykotische Resistenzen Echinocandine Azole 5-Flucytosine Genom-breite Analyse
Ganze Genom-Sequenzierung von <em>Candida Glabrata</em> für Erkennung von Markierungen von Antimykotika Resistenz
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biswas, C., Chen, S. C. A.,… More

Biswas, C., Chen, S. C. A., Halliday, C., Martinez, E., Rockett, R. J., Wang, Q., Timms, V. J., Dhakal, R., Sadsad, R., Kennedy, K. J., Playford, G., Marriott, D. J., Slavin, M. A., Sorrell, T. C., Sintchenko, V. Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance. J. Vis. Exp. (130), e56714, doi:10.3791/56714 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter