Summary
Cette étude a mis en place le séquençage du génome entier pour l’analyse des mutations dans les gènes conférant une résistance aux médicaments antifongiques dans Candida glabrata. C. glabrata isolats résistants aux échinocandines, dérivés azolés et 5-flucytosine, ont été séquencés pour illustrer la méthodologie. Profils des isolats en corrélation avec la présence ou l’absence de motifs spécifiques de mutation dans les gènes de susceptibilité.
Abstract
Candida glabrata peut acquérir rapidement des mutations qui entraînent la résistance aux médicaments, surtout pour les dérivés azolés et les échinocandines. Identification des mutations génétiques est essentielle, comme la résistance observée in vitro peut souvent être corrélée avec l’échec clinique. Nous avons examiné la possibilité d’utiliser le séquençage du génome entier (WGS) pour l’analyse du génome de la résistance aux médicaments antifongiques dans c. glabrata. Le but était concrètement catalyseurs et obstacles dans la mise en place de groupes de travail et mesure son efficacité. Cet article décrit les points de contrôle clés contrôle de la qualité et les éléments essentiels de la méthodologie groupes de travail pour étudier les marqueurs génétiques associés à une sensibilité réduite aux agents antifongiques. Il estime également l’exactitude de l’analyse des données et tour-temps de test.
Une sensibilité phénotypique de 12 cliniques et une souche ATCC de c. glabrata a été déterminée par des tests de sensibilité aux antifongique. Ces trois inclus isolent paires, de trois patients, qui a mis au point la hausse des concentrations minimales inhibitrices de drogue. Dans deux paires, la seconde souche de chaque paire développé de résistance aux échinocandines. Le deuxième isolat de la troisième paire développé une résistance aux 5-flucytosine. Le reste comprend sensibles et résistantes aux azolés isolats. Simples de nucléotide simple (SNP) dans les gènes liés à la résistance échinocandine, azole et 5-flucytosine ont été confirmés dans des isolats résistants à travers WGS utilisant le séquençage de la génération suivant. Non-synonymes SNP antifongique résistance gènes tels que FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 et FCY2 ont été identifiés. Dans l’ensemble, une moyenne de 98 % des lectures WGS des isolats de c. glabrata mappées sur le génome de référence avec une couverture d’environ 75-fold profondeur. Le délai d’exécution et le coût ont été comparables à Sanger séquençage.
En conclusion, WGS de c. glabrata était réalisable en révélant des mutations du gène cliniquement significatifs impliqués dans la résistance aux médicaments antifongiques différents classes sans nécessiter de multiples réactions de séquençage PCR/ADN. Il s’agit d’un pas positif vers la mise en place WGS capacité dans les laboratoires cliniques pour la détection simultanée des substitutions attributive de résistance aux antifongiques.
Introduction
Candida glabrata est un pathogène de plus en plus rencontré avec importance comme une espèce qui montre résistance les azoles ainsi que plus récemment, les échinocandines1,2,3. À la différence des diploïdes c. albicans, le génome haploïde de c. glabrata peut lui permettre d’acquérir des mutations et de développer la multirésistance plus facilement. Co la résistance aux deux classes de médicaments a également été rapportée4. Par conséquent, l’évaluation précoce de sensibilité aux antifongique et détection de la résistance aux antituberculeux au c. glabrata sont cruciales pour le bon traitement ciblé ainsi que dans le contexte de l’intendance antifongique pour limiter les facteurs de résistance aux antimicrobiens1 , 5 , 6. création d’un workflow efficace pour détecter rapidement la présence de mutations confirmation liés aux biomarqueurs de résistance dans des isolats résistants va également contribuer à une meilleure prescription les décisions et les résultats cliniques.
Sensibilité aux antifongique est généralement évaluée en mesurant la concentration minimale inhibitrice (CMI) qui est définie comme la plus faible concentration de drogue qui se traduit par une réduction significative de la croissance d’un microorganisme comparée à celle d’une croissance sans drogue contrôle. La clinique et le Laboratory Standards Institute (CLSI) et le Comité européen sur Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ont normalisé la sensibilité des méthodes d’essai afin de rendre la détermination MIC plus précise et cohérente7, 8. Cependant, l’utilité de MIC antifongique reste limitée surtout pour les échinocandines, en particulier en ce qui concerne les comparaisons interlaboratoires où différentes méthodes et les conditions sont utilisés9. Il existe également une corrélation incertaine des PRI avec la réponse au traitement d’échinocandine et incapacité à distinguer WT (ou sensibles) isolats de celles hébergeant FKS mutations (souches résistantes échinocandine)10,11. Malgré la disponibilité de confirmation monogéniques RFT et Sanger séquençage des marqueurs de résistance aux antifongiques, réalisation des résultats est souvent retardée à l’absence de détection simultanée de multiples résistance marqueurs5,12. Par conséquent, détection simultanée des mutations conférant la résistance à différents endroits dans le génome, activée par l’analyse basée sur le séquençage du génome entier, offre des avantages significatifs sur les approches actuelles.
(WGS) le séquençage du génome a été implanté avec succès afin de suivre la transmission de la maladie au cours des flambées, mais aussi une approche de test dans les bactéries et les virus13de résistance évaluation et drogues risque de génome. Avances récentes en technologie de séquençage des acides nucléiques ont fait le séquençage du génome entier (WGS) d’agents pathogènes dans un tour-autour-temps cliniquement exploitable techniquement et économiquement faisable. Séquençage de l’ADN offre d’importants avantages par rapport aux autres méthodes d’identification de l’agent pathogène et caractérisation employées dans les laboratoires de microbiologie14,15,16. Premièrement, il fournit une solution universelle avec la qualité, la vitesse et à haut débit. Séquençage peut être appliqué à l’un des micro-organismes et permet des économies d’échelle dans les laboratoires les ou régionaux. Deuxièmement, il génère des données dans un format « évolutif » se prêtent à la comparaison aux niveaux nationales et international. Enfin, l’utilité potentielle des groupes de travail en médecine a été augmentée par la croissance rapide des bases de données publiques contenant les génomes de référence, qui peuvent être reliés à des bases de données équivalentes qui contiennent des métadonnées supplémentaires de cliniques et épidémiologiques17 ,18.
Des études récentes ont démontré l’utilité des groupes de travail pour l’identification des marqueurs de résistance aux antifongiques des isolats cliniques de Candida spp. 10 , 19 , 20. c’est principalement en raison de la disponibilité des séquenceurs haut débit benchtop, pipelines de bioinformatique établis et diminuant le coût du séquençage21,22. L’avantage de WGS fongique sur Sanger séquençage est que WGS permet le séquençage des génomes de plusieurs sur un même essai. En outre, WGS des génomes de Candida peut identifier des mutations nouvelles cibles de médicaments, la piste évolution génétique et l’émergence des séquences-types cliniquement pertinents20,22,23. Plus important encore, en cas de multirésistance intrinsèque, WGS peut aider à la détection précoce des mutations mutantes résistantes avant traitement sélection22,24.
Ici, nous avons examiné la faisabilité du dépistage WGS-activé des mutations associées à la résistance à différentes classes d’agents antifongiques. Nous présentons une méthodologie pour la mise en œuvre des groupes de travail de l’utilisateur final et les perspectives de laboratoire de diagnostic mycologique. Nous avons inclus dans cette analyse trois isoler des paires d’échantillons de trois cas cliniques distinctes dans lequel in vitro la résistance aux échinocandines et 5-flucytosine au fil du temps suite à un traitement antifongique.
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Protocol
Aucune approbation déontologique a été requise pour cette étude.
1. préparation sous-culture et inoculum à Candida glabrata
- Sélectionnez un groupe d’isolats de C.glabrata à étudier qui devrait également inclure au moins un c. glabrata American Type Culture Collection (ATCC) modèle de sensibilité connue.
- Sous-culture un isolat en touchant une seule colonie à l’aide d’une boucle en plastique jetable stérile et les rayures sur un de Sabouraud dextrose agar (SDA) plaque8.
- Incuber la plaque SDA pendant 24 à 48 heures à 35 ° C pour une culture pure d’isolat avec une bonne croissance.
2. détermination de la sensibilité aux antifongique
- Utiliser une boucle en plastique jetable stérile pour prendre 4-5 colonies d’environ 1 mm de diamètre d’une individualisation fraîchement c. glabrata isoler sur plaque SDA. Resuspendre dans 3 mL d’eau distillée stérile. Bien mélanger en douce de pipetage pour obtenir une suspension homogène.
- Ajuster la densité des cellules à 0,5 McFarland, qui est équivalent à 1 x 106 à 5 x 106 cellules/mL à l’aide d’un densitomètre 8.
- Les épreuves de sensibilité à l’aide de test commercial (voir Table des matières et réactifs) sur tous les c. glabrata isole suivant instructions du fabricant. Interpréter la sensibilité des isolats issu des micros résultantes des médicaments antifongiques, conformément aux lignes directrices CLSI et préparer le rapport (tableau 1)8.
3. génomique extraction de l’ADN pour le séquençage
- Remettre en suspension une anse de colonies sur une plaque SDA fraîchement cultivée dans 300 µL de 50 mM EDTA dans un tube de 1,5 mL.
- Ajouter 40 µL de zymolyase (10 mg/mL) à la suspension et doucement la pipette 5 fois jusqu'à ce que la suspension est uniforme.
- Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 à 2 h digérer la paroi cellulaire. Laisser refroidir à température ambiante pendant 5 min.
- Centrifuger la suspension à 14 000 x g pendant 2 min et puis retirer délicatement le surnageant.
- Extraire l’ADN genomic DNA extraction kit directives (voir Table des matières).
- Remettre extrait granule d’ADN dans 50 µL de 10 mM tampon Tris (pH 7,5-8,5) au lieu de la mémoire tampon d’élution fourni dans le kit.
- Vérifier la pureté de l’ADN par la mesure de la densité optique (O.D) à 260/280 nm25.
4. génomique quantification de l’ADN
- Préparer un 1 x tampon Tris EDTA (TE) fourni dans le kit de test basé sur les directives du fabricant pour le test de détection de fluorescence (voir Table des matières).
- Diluer l’échantillon d’ADN en ajoutant 2 µL à 98 µL de 1 x tampon TE (volume final de 100 µL, dilution facteur 01:50) dans un plaque bien 96 jetables. Cette étape de dilution peut être effectuée soit manuellement en utilisant une pipette multicanaux ou par manipulation workstation de liquides automatique.
- Préparer l’éventail des normes en diluant le lambda de l’ADN (100 µg/mL) fourni dans le kit de test de fluorescence (tableau 2) et notamment pour la mesure ainsi que des échantillons.
- Ajouter 100 µL de colorant fluorescent à 100 µL dilué des échantillons d’ADN et de normes pour la réaction. Incuber 5 min à température ambiante, abrie de la lumière.
- Mesurer la fluorescence de tous les échantillons, fondées sur les directives du fabricant.
- Tracer la courbe d’étalonnage à l’aide de la lecture de fluorescence et calculer la concentration initiale des échantillons ADN.
- Déterminer le volume de l’ADN et un tampon Tris 10 mM (pH 8) d’être ajouté à ajuster la concentration en ADN à 0,2 ng/µL.
- Effectuer des dilutions de l’ADN à l’aide de liquides automatique station de travail. Cette étape est également possible de pipetage manuel.
5. préparation de bibliothèque d’ADN
Remarque : Préparation de la bibliothèque et le séquençage a été réalisée suivant les protocoles et les lignes directrices fournies par la société (Figure 1A) du fabricant (voir Table des matières).
- Tagmentation et PCR amplification
- Une nouvelle plaque 96 puits rigide de paroi mince de l’étiquette.
- Ajouter 5 µL de quantifiés entrée ADN à 0,2 ng/µL (1 ng au total) pour chaque échantillon de puits de la plaque.
- Ajouter 10 µL de tampon de tagmentation et 5 µL de tampon de l’amplification à chaque bien contenant de l’ADN et Pipetez doucement pour bien mélanger. Sceller la plaque avec un joint de la plaque adhésive.
- Placer la plaque dans un thermocycleur et exécutez le programme PCR suivant : 55 ° C pendant 5 min et maintenez à 10 ° C. Lorsque l’échantillon atteint 10 ° C, procéder immédiatement à neutraliser.
- Ajouter 5 µL de tampon de neutralisation à la plaque à neutraliser la réaction de l’amplicon et Pipetez doucement le mélange. Sceller la plaque et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 15 µL d’indexation mastermix PCR aux échantillons.
- Utilisez une boîte de tubes d’apprêt index disponibles pour une configuration du format de la plaque à 96 puits, afin que chaque échantillon obtient une combinaison unique d’indices basés sur le modèle de l’index (tableau 3).
- Disposer les tubes d’apprêt index dans l’index Egouttoir (Figure 1B) en utilisant l’ordre indiqué dans le modèle au tableau 3 et enregistrer la position des indices sur le gabarit.
- Placer la plaque tagmentation avec ajouté mastermix PCR sur l’indice Egouttoir avec les tubes de l’index dans l’ordre.
- Mettre tubes amorce 1 index à disposition verticale et indice amorce 2 tubes en disposition horizontale sur le panier de l’indice. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter avec précaution 5 µL d’amorces d’index pour chaque échantillon.
- Remplacer vieux bouchons de tubes de l’indice avec nouveaux plafonds pour éviter la contamination croisée entre les indices.
- Sceller la plaque à l’aide de chasseurs de plaque 96 puits clair et effectuer la deuxième PCR comme suit : 95 ° C pendant 30 s, 12 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 5 min.
- Nettoyage de la PCR
- Transférer le produit PCR pour PCR-nettoyage, de la plaque tagmentation sur une plaque de fond de puits (voir Table des matières).
- Vortex la solution commerciale de billes magnétiques (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant et ajoutez 30 µL de perles à chaque produit de la PCR dans la plaque de fond de puits.
- Secouer la plaque sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 2 min et incuber à température ambiante sans agiter pendant 5 min.
- Placer la plaque sur un support magnétique pendant 2 min jusqu'à ce que le liquide surnageant a été compensé.
- Jeter le surnageant soigneusement avec la plaque encore sur le support magnétique.
- Ajouter 200 µL d’éthanol à 80 % fraîchement préparée avec la plaque sur le support magnétique.
- Incuber les plaques sur le support magnétique pendant 30 s et soigneusement retirer et jeter le liquide surnageant sans déranger les perles.
- Répéter l’étape de lavage et laisser les perles à sécher à l’air pour l’éthanol excès de 15 min. Retirer le cas échéant.
- Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 52,5 µL de tampon de resuspension aux talons.
- Secouer la plaque sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 2 min et incuber à température ambiante pendant 2 min sans agiter.
- Placer la plaque sur le support magnétique et permettent le surnageant effacer.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, transvaser avec soin 50 µL de surnageant de la plaque de nettoyage pour une nouvelle plaque rigide.
- Normalisation de la bibliothèque
- Décongeler les réactifs de normalisation bibliothèque conformément aux directives du fabricant (voir Table des matières).
- Transférer 20 µL du liquide surnageant de la plaque de nettoyage pour une nouvelle plaque de puits profonds.
- Ajouter 45 µL de suspension de billes magnétiques et sceller la plaque avec un film adhésif.
- Secouez la plaque sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 30 min. Ce temps d’incubation est essentiel et ne doit pas être dépassé.
- Placer la plaque sur un support magnétique pendant 2 min et confirmer que le surnageant a été compensé (Figure 1B).
- Retirer et jeter le surnageant dans un conteneur approprié des déchets dangereux avec la plaque encore sur le support magnétique.
- Retirer la plaque du support magnétique et laver les billes avec 45 µL de tampon de lavage.
- Secouez la plaque tampon de lavage sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 5 min.
- Placer la plaque sur support magnétique pendant 2 min, puis jeter le surnageant lorsqu’il devient clair.
- Retirer la plaque du support magnétique et répéter le lavage avec le tampon de lavage.
- Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 30 µL de NaOH 0,1 N.
- Secouez la plaque avec NaOH 0,1 N sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 5 min, puis placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 min ou jusqu'à ce que le liquide est clair.
- Ajouter 30 µL de tampon d’élution dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 96 puits rigide paroi mince final bibliothèque normalisée.
- Transférer 30 µL de surnageant de plaque de normalisation à la plaque finale bibliothèque normalisée pour rendre le volume final 60 µL. Les bibliothèques sont maintenant prêts à être séquencé.
- Détermination de la Concentration de bibliothèque d’ADN par qPCR
- Décongeler le mastermix, les apprêts et les normes fournies dans le kit de qPCR conformément aux directives du fabricant (voir Table des matières).
- Combiner les mastermix réactif PCR et les amorces fournies dans le kit de qPCR suivant instructions du fabricant et aliquotes peuvent être conservés à-20 ° C.
- Pour déterminer la concentration de bibliothèque d’ADN, faire une dilution de 1/8000 des bibliothèques d’ADN à l’aide d’un tampon Tris 10 mM (pH 8) en effectuant une dilution au 1/100 (bibliothèque d’ADN µL 1,5 à 148,5 µL de tampon Tris) suivie d’une dilution de 1 : 80 (2 µL de 1/100 à 158 µL de tampon Tris).
- Secouer la plaque de dilution à 700 tr/min pendant au moins 1 min et centrifuger à 14000 × g pendant 1 min.
- Préparer 20 µL de réaction PCR finale en mélangeant 4 µL de bibliothèque d’ADN dilué ou de normes de l’ADN et 16 µL de mastermix.
- Effectuer la PCR, les paramètres du constructeur dans le thermocycleur suivants : 95 ° C pendant 5 min, 35 cycles de 95 ° C pendant 30 s et 60 ° C pour 45 s et final 65 ° C et 95 ° C pour l’analyse des courbes de fusion.
- Obtenir les valeurs de Ct des bibliothèques d’échantillons de l’ADN et des normes de la qPCR thermocycleur.
- Générer une courbe d’étalonnage de la valeur de Ct des normes (Figure 2). Définir la plage QC inférieure et supérieure de ± 3 cycles de la moyenne. Par exemple, si la valeur Ct moyenne est de 13 cycles puis le QC se situe entre 16 et 10 cycles.
- Déterminer les concentrations de bibliothèque individuelle et moyenne (ALC) de la courbe d’étalonnage et les valeurs de Ct.
- Déterminer le volume des bibliothèques regroupées totales (PAL) à utiliser basée sur calcul donné ci-dessous pour l’ordonnancement final étant donné que la concentration de bibliothèque cible est entre 1,4-13:08.
Remarque : Bibliothèque concentration obtenue de qPCR moyenne = ALC ; Total des bibliothèques regroupées (PAL) = ALC / 2 ; Dénaturé PAL (DAL) = PAL * 0,666
Selon le volume du DAL qui est mélangée au tampon, est la concentration de bibliothèque pour être ajouté à la cellule de flux. Par exemple, si 65 µL de bibliothèque est ajouté à 835 µL de tampon, puis à partir de cette dilution (Dil 1) 195 est ajouté à un volume total de 1300 µL : (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = Concentration finale (doit être entre 1,4-13:08)
6. Bibliothèque mise en commun et le séquençage de Initiating Benchtop séquenceur
- Cartouche de réactif de dégel conformément aux directives du fabricant. Souscrire à une nouvelle cellule d’écoulement de son emballage de stockage de 4 ° C et porter à température ambiante au moins 30 min avant l’ordonnancement. Sortir de la cartouche de mémoire tampon et tampon de séquençage prechill avant utilisation (voir Table des matières).
- Préparer une bibliothèque de contrôles en mélangeant 5 µL de bibliothèque (1 nM) et 5 µL de 0,2 N NaOH. Vortex brièvement et laisser incuber 5 min à température ambiante pour dénaturer la bibliothèque de contrôles torons.
- Ajouter 5 µL de 200 mM Tris-HCl, pH 7 et vortex. Ajouter 235 µL de tampon de séquençage prérefroidies et mélanger doucement. Le volume total est de 250 µL avec concentration finale de contrôle bibliothèque à 20 h.
- Bibliothèques d’ADN de piscine en transférant 5 µL de chaque bibliothèque d’échantillons à séquencer de la plaque finale bibliothèque normalisée dans un tube unique basse-bind 1,5 mL.
- Ajouter 30 µL de bibliothèque regroupée et 30 µL de 0,2 N NaOH pour dénaturer les bibliothèques dans un autre tube de liaison faible.
- Vortex de la basse-bind tube et laisser incuber 5 min à température ambiante pour dénaturer les bibliothèques torons.
- Ajouter 30 µL de 200 mM Tris-HCl, pH 7 à tube avec des bibliothèques dénaturés à neutraliser la réaction.
- Ajouter 65 µL de suspension neutralisée bibliothèques dénaturé et 835 µL de tampon de séquençage préalablement réfrigérées et vortex pour bien mélanger.
- Dans un tube de liaison faible final combiner ce qui suit : 195 µL de bibliothèques dénaturés neutralisées, 1.30 µL de bibliothèque de contrôles et 1103.70 µL de tampon de séquençage. Mélanger correctement.
- Charger le mix final de bibliothèque (1300 µL) dans l’endroit indiqué sur la cartouche de réactif.
- Mise en place le séquençage géré par entrer dans les détails de projet et l’échantillon dans le séquenceur désigné site suivant les directives.
- Séquençage initier suivant les lignes directrices. Charger la cellule d’écoulement, la cartouche de réactif avec les bibliothèques et la cartouche de mémoire tampon dans le séquenceur de benchtop.
- Enregistrer les numéros de lot de toutes les trousses de réactifs et de cartouches utilisées dans le séquençage.
7. données téléchargement du site Web de séquençage
- Télécharger des fichiers FASTQ, suivez les instructions du fabricant fournies sur le site Web.
- Pour une bonne qualité tourner vérifier que le pourcentage Q30 est ≥ 75 % et cluster densité est entre 170-280 K/mm2 avec optimum à 200-210 K/mm2 (tableau 4).
8. analyse de données de séquençage
- Importer des fichiers FASTQ d’échantillons séquencées dans le progiciel intégré d’analyse données (voir la Table des matières).
- Créer un flux de travail de séquençage dans le logiciel en ajoutant des fonctionnalités de liste à savoir tailler, cartographie de référence (référence select du génome), remaniement des locaux et analyse variante (Figure 3A) en utilisant les paramètres figurant dans le tableau 5.
- Exécuter le workflow en sélectionnant un seul échantillon ou un lot de fichiers d’exemple FASTQ et enregistrer des fichiers de sortie dans des dossiers désignés échantillon.
- Générer rapport pour la profondeur de la couverture de séquence, régions cartographiées et liste des variantes structurelles au génome (Figure 3B).
- Liste des variantes structurelles permet de rechercher des synonymes polymorphismes (SNP) dans les gènes conférant la résistance et virulence.
- Préparer le rapport en énumérant les SNP, gène et nombre d’isolats résistants ou sensibles (tableau 6).
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Representative Results
Treize c. glabrata , comprenant des souches ATCC 90030 et 12 c. glabrata du laboratoire de référence clinique de mycologie (isolats CMRL1 à CMRL12), l’hôpital Westmead, Sydney ont été étudiés (tableau 1). Il s’agissait de trois paires d’isolats CMRL-1/CMRL-2, 3/CMRL CMRL-4 et CMRL-5/CMRL-6 obtient avant et après traitement antifongique sans aucun lien épidémiologique entre eux 24 (tableau 1).
La CMI ont été déterminées à l’aide de point d’arrêt interprétatif CLSI pour neuf agents antifongiques nommément amphotéricine (AMB), l’anidulafungine (ANI), la micafungine (MIF), caspofungine (CAS), 5-Flucytosine (5-FC), Posaconazole (POS), le Voriconazole (RVC), Itraconazole () ITR) et le Fluconazole (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 et Candida krusei ATCC 6258 servaient de souches de contrôle de la qualité. Parmi la paire isolat, CMRL-1 et CMRL-2, le deuxième isolat CMRL-2 résistait aux caspofungine (MIC 8 comparativement à 0,12 mg/L, tableau 1). CMRL-2 a également eu une augmentation proportionnelle semblable dans les micros de l’anidulafungine et micafungine (≥ 0,5 mg/L) in vitro la résistance à tous les trois échinocandines24. De même, isolat CMRL-4 avait développé échinocandine résistance que ceux d’isolat CMRL-3 (tableau 1). Entre la troisième paire, isolat CMRL-6 avait un micro 5-flucytosine (> 64 contre 0,06 mg/L)24. Les deux paires de ces isolats étaient sensibles/sauvage (WT) à d’autres agents antifongiques testés. Isolat CMRL-6 et CMRL-12 se sont avéré pour être résistant ou non-WT à tous les dérivés azolés. CMRL-7 était résistante au fluconazole et non-WT de voriconazole (tableau 1). C. glabrata ATCC 90030 et isolats CMRL-8 au CMRL-11 ont été sensibles/WT sensible à tous les agents antifongiques24.
WGS de 13 isolats a été réalisée en utilisant le séquenceur de benchtop. En moyenne, une course de Mid-sortie séquençage, cédé autour de 27-40 Go de données avec un taux d’erreur entre 0,5 et 1,4 %. Le pourcentage moyen Q30 obtenu était habituellement d’environ 80 à 85 %. La densité de cluster-cellule d’écoulement (K/mm2) varie entre 200-250 (tableau 4). Les données de séquence brute de cette étude ont été déposées à la séquence de NCBI lire Archive (SRA) sous le numéro du projet PRJNA310057. 98 % du séquençage lit mappé dans le génome de référence c. glabrata (souche CBS138) grâce à l’analyse dans le logiciel d’analyse de données intégrées. La moyenne lire la couverture de profondeur était x 75 avec moyenne longueur de 143-BP. structurelle détection variante identifiée plus de 50, 000 SNP par isolat de lire. En particulier, lorsqu’on analyse les paires de souche CMRL1/CMRL-2, total SNP trouvés sur chaque isolat étaient autour de 79 000, CMRL-3/CMRL-4, le nombre total de SNP ont été autour de 60 000 et pour CMRL-5/CMRL-6, plus de 56 000 par rapport à CBS13824. La différence SNP par comparaison entre les isolats dans une paire de souche a été inférieur à 25.
Basé sur le profil de sensibilité des isolats, connu des biomarqueurs ont été sélectionnés pour analyse24, en particulier, la résistance FKS1, FKS2 et FKS3 (échinocandine résistance), FCY1 et FCY2 (5- Flucytosine résistance) et ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 et CgFLR1 (résistance azole). Les gènes ont été vérifiés pour les mutations connues et la fréquence des occurrences de SNP. Seulement non-synonymes SNP dans les gènes avec lu couverture profondeur de ≥20 c'est-à-dire, SNP de haute qualité (hq-SNP) ont été spécifiquement étudiés.
Notamment, les FKS mutations ont été identifiées dans le génome de deux isolats résistants echinocandine à24. Des deux premières paires, les isolats résistants échinocandine, CMRL-2 contenaient une seule mutation de FKS2 S629P et CMRL-4, la mutation de FKS2 S663P (tableau 6). La troisième paire, un SNP dans FCY2 (Ala237Thr) a été constaté dans les deux CMRL-5 (5-flucytosine sensible) et CMRL-6 (résistant) (tableau 6). Cependant, SNP dans FCY2 se retrouvent également dans autres phénotypiquement-WT isolats (CMRL-1, 2-CMRL, CMRL-10)24. Isolats CMRL-6 et CMRL-12 ont été remarquables par leur pan-azole résistant/non-caractère WT et avait des SNP en CgCDR1 (encodage pompes d’efflux azole) et CgPDR1 (codant le facteur de transcription réglementant les pompes d’efflux) (tableau 6)26 ,,27. La présence d’un autre gène de pompe à efflux, CgFLR1 s’est produite dans les deux isolats sensibles azole et résistant à l’azole26,28. Enquête pour les SNP au sein de ERG9 (codage squalène synthétase) a révélé des mutations, mais il n’y a aucune mutation identifiée dans ERG1124.
WGS analyse a aussi révélé plusieurs non-synonymes SNP dans Candida pariétaux gènes d’adhérence à savoir EPA1, EPA6, PWP2 et PWP5. Les mutations EPA6 étaient présentes dans les isolats de 9/12. SNP dans PWP2 et PWP5 était également présents dans presque tous les isolats, sauf les isolats CMRL-1 et CMRL-1124.
| Isoler | AMB | ANI | MIF | NO CAS | 5-FC | POINT DE VENTE | VRC | ITR | FLC | Interprétation de sensibilité aux antifongique | Gènes conférant une résistance identifiée par WGS | ||
| CMRL-1 | 0,5 | 0,03 | 0,008 < | 0,12 | < 0,06 | 0,5 | 0,12 | 0.25 | 8 | Sensible à tous | - | ||
| CMRL-2 | 0,5 | 1 | 1 | 8 | < 0,06 | 0.25 | 0,06 | 0,12 | 4 | Résistant à tous les échinocandines seulement | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0.25 | 0,015 | 0,015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0.25 | 0,5 | 8 | Sensible à tous | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0,06 | 0,5 | 0,12 | 0.25 | 8 | Résistant à tous les échinocandines seulement | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0,12 | 0,015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Sensible à tous | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0,06 | 0,015 | 0,06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | Résistant à la 5-FC et dérivés azolés | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0.25 | 0,06 | 0,015 | 0.25 | < 0,06 | 1 | 8 | 0,5 | 256 | Résistant à tous les dérivés azolés seulement | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0,5 | 0,03 | 0,008 | 0,06 | < 0,06 | 0,5 | 0.25 | 0.25 | 4 | Sensible à tous | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0,03 | 0,015 | 0.25 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 1 | 16 | Sensible à tous | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0,03 | 0,008 < | 0,5 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Sensible à tous | - | ||
| CMRL-11 | 0,5 | 0,03 | 0,008 < | 0,03 | < 0,06 | 0,5 | 0.25 | 0,5 | 8 | Sensible à tous | - | ||
| CMRL-12 | 0,5 | 0,03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | Résistant à tous les dérivés azolés seulement | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0,03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 8 | Sensible à tous | - | ||
| Abréviations : MIC, concentration minimale inhibitrice ; AMB, amphotéricine B ; ANI, l’anidulafungine ; CAS, caspofungine ; FLC, fluconazole ; RIR, itraconazole ; MIF, la micafungine ; POS, posaconazole ; RVC, voriconazole ; 5-FC, 5-flucytosine. | |||||||||||||
Table 1. La sensibilité in vitro de 13 Candida glabrata isolats dont CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 et CMRL-5/CMRL-6 isoler paires obtenus avant et après traitement antifongique
| Normes | ADN Standard Volume (μL) | 1 tampon TE X | Réactif (μL) | Total en plaque 96 puits (μL) | Concentration finale d’ADN (ng/mL) |
| Pico-STD 1 | 8 (ADN standard tube 100 µg/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| Pico-STD 2 | 10 (à partir de Pico-Std 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| STD - Pico 3 | 5 (à partir de Pico-Std 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| STD-Pico 4 | 2 (à partir de Pico-Std 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| STD-Pico 5 | 10 (Std-Pico 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| Vide | - | 100 | 100 | 200 | Vide |
Le tableau 2. Protocole pour la préparation de normes pour la génération de la courbe d’étalonnage pour la Quantification de l’ADN
Figure 1 . Workflow de séquençage : (A) un aperçu des principales étapes analytiques pour la préparation de la bibliothèque et le séquençage sur un séquenceur de benchtop. (B) des éléments importants pour la préparation de bibliothèque d’ADN comme (gauche à droite) index Egouttoir pour arrangement des indices au cours de l’indexation et support magnétique avec plaque à 96 puits profond pour billes magnétiques basé nettoyage des bibliothèques d’ADN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Index Ensemble A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | Échantillon 1 | Échantillon 2 | Exemple 3 | Exemple 4 | Échantillon 5 | Exemple 6 | Exemple 7 | Exemple 8 | Exemple 9 | Échantillon 10 | Exemple 11 | Exemple 12 |
| B | S503 | Exemple 13 | Exemple 14 | Exemple 15 | Exemple 16 | Exemple 17 | Exemple 18 | Exemple 19 | Échantillon 20 | Exemple 21 | Exemple 22 | Exemple 23 | Exemple 24 |
| C | S505 | Échantillon 25 | Échantillon 26 | Exemple 27 | Exemple 28 | Exemple 29 | Échantillon 30 | Échantillon 31 | Exemple 32 | Échantillon 33 | Exemple 34 | Échantillon 35 | Échantillon 36 |
| D | S506 | Échantillon de 37 | Échantillon 38 | Exemple 39 | Échantillon 40 | Exemple 41 | Exemple 42 | Exemple 43 | Échantillon 44 | Exemple 45 | Échantillon 46 | Échantillon 47 | Échantillon 48 |
| E | S507 | Échantillon 49 | Échantillon 50 | Échantillon 51 | Exemple 52 | Échantillon 53 | Échantillon de 54 | Échantillon de 55 | Échantillon 56 | Exemple, 57 | Échantillon 58 | Échantillon de 59 | Exemple 60 |
| F | S508 | Échantillon de 61 | Échantillon de 62 | Échantillon 63 | Échantillon 64 | Échantillon 65 | Échantillon 66 | Échantillon 67 | Échantillon 68 | Échantillon 69 | Échantillon 70 | Échantillon 71 | Échantillon 72 |
| G | S510 | Échantillon de 73 | Échantillon 74 | Échantillon de 75 | Échantillon 76 | Échantillon 77 | Échantillon 78 | Échantillon 79 | Échantillon 80 | Échantillon 81 | Échantillon 82 | Échantillon 83 | Échantillon de 84 |
| H | S511 | Échantillon 85 | Échantillon de 86 | Échantillon 87 | Échantillon 88 | Échantillon 89 | Échantillon 90 | 91 de l’échantillon | Échantillon 92 | Échantillon de 93 | Échantillon 94 | Échantillon 95 | Échantillon de 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| L’index Set B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | Échantillon 1 | Échantillon 2 | Exemple 3 | Exemple 4 | Échantillon 5 | Exemple 6 | Exemple 7 | Exemple 8 | Exemple 9 | Échantillon 10 | Exemple 11 | Exemple 12 |
| B | S503 | Exemple 13 | Exemple 14 | Exemple 15 | Exemple 16 | Exemple 17 | Exemple 18 | Exemple 19 | Échantillon 20 | Exemple 21 | Exemple 22 | Exemple 23 | Exemple 24 |
| C | S505 | Échantillon 25 | Échantillon 26 | Exemple 27 | Exemple 28 | Exemple 29 | Échantillon 30 | Échantillon 31 | Exemple 32 | Échantillon 33 | Exemple 34 | Échantillon 35 | Échantillon 36 |
| D | S506 | Échantillon de 37 | Échantillon 38 | Exemple 39 | Échantillon 40 | Exemple 41 | Exemple 42 | Exemple 43 | Échantillon 44 | Exemple 45 | Échantillon 46 | Échantillon 47 | Échantillon 48 |
| E | S507 | Échantillon 49 | Échantillon 50 | Échantillon 51 | Exemple 52 | Échantillon 53 | Échantillon de 54 | Échantillon de 55 | Échantillon 56 | Exemple, 57 | Échantillon 58 | Échantillon de 59 | Exemple 60 |
| F | S508 | Échantillon de 61 | Échantillon de 62 | Échantillon 63 | Échantillon 64 | Échantillon 65 | Échantillon 66 | Échantillon 67 | Échantillon 68 | Échantillon 69 | Échantillon 70 | Échantillon 71 | Échantillon 72 |
| G | S510 | Échantillon de 73 | Échantillon 74 | Échantillon de 75 | Échantillon 76 | Échantillon 77 | Échantillon 78 | Échantillon 79 | Échantillon 80 | Échantillon 81 | Échantillon 82 | Échantillon 83 | Échantillon de 84 |
| H | S511 | Échantillon 85 | Échantillon de 86 | Échantillon 87 | Échantillon 88 | Échantillon 89 | Échantillon 90 | 91 de l’échantillon | Échantillon 92 | Échantillon de 93 | Échantillon 94 | Échantillon 95 | Échantillon de 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Index des Set C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | Échantillon 1 | Échantillon 2 | Exemple 3 | Exemple 4 | Échantillon 5 | Exemple 6 | Exemple 7 | Exemple 8 | Exemple 9 | Échantillon 10 | Exemple 11 | Exemple 12 |
| B | S515 | Exemple 13 | Exemple 14 | Exemple 15 | Exemple 16 | Exemple 17 | Exemple 18 | Exemple 19 | Échantillon 20 | Exemple 21 | Exemple 22 | Exemple 23 | Exemple 24 |
| C | S516 | Échantillon 25 | Échantillon 26 | Exemple 27 | Exemple 28 | Exemple 29 | Échantillon 30 | Échantillon 31 | Exemple 32 | Échantillon 33 | Exemple 34 | Échantillon 35 | Échantillon 36 |
| D | S517 | Échantillon de 37 | Échantillon 38 | Exemple 39 | Échantillon 40 | Exemple 41 | Exemple 42 | Exemple 43 | Échantillon 44 | Exemple 45 | Échantillon 46 | Échantillon 47 | Échantillon 48 |
| E | S518 | Échantillon 49 | Échantillon 50 | Échantillon 51 | Exemple 52 | Échantillon 53 | Échantillon de 54 | Échantillon de 55 | Échantillon 56 | Exemple, 57 | Échantillon 58 | Échantillon de 59 | Exemple 60 |
| F | S520 | Échantillon de 61 | Échantillon de 62 | Échantillon 63 | Échantillon 64 | Échantillon 65 | Échantillon 66 | Échantillon 67 | Échantillon 68 | Échantillon 69 | Échantillon 70 | Échantillon 71 | Échantillon 72 |
| G | S521 | Échantillon de 73 | Échantillon 74 | Échantillon de 75 | Échantillon 76 | Échantillon 77 | Échantillon 78 | Échantillon 79 | Échantillon 80 | Échantillon 81 | Échantillon 82 | Échantillon 83 | Échantillon de 84 |
| H | S522 | Échantillon 85 | Échantillon de 86 | Échantillon 87 | Échantillon 88 | Échantillon 89 | Échantillon 90 | 91 de l’échantillon | Échantillon 92 | Échantillon de 93 | Échantillon 94 | Échantillon 95 | Échantillon de 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Index jeu D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | Échantillon 1 | Échantillon 2 | Exemple 3 | Exemple 4 | Échantillon 5 | Exemple 6 | Exemple 7 | Exemple 8 | Exemple 9 | Échantillon 10 | Exemple 11 | Exemple 12 |
| B | S515 | Exemple 13 | Exemple 14 | Exemple 15 | Exemple 16 | Exemple 17 | Exemple 18 | Exemple 19 | Échantillon 20 | Exemple 21 | Exemple 22 | Exemple 23 | Exemple 24 |
| C | S516 | Échantillon 25 | Échantillon 26 | Exemple 27 | Exemple 28 | Exemple 29 | Échantillon 30 | Échantillon 31 | Exemple 32 | Échantillon 33 | Exemple 34 | Échantillon 35 | Échantillon 36 |
| D | S517 | Échantillon de 37 | Échantillon 38 | Exemple 39 | Échantillon 40 | Exemple 41 | Exemple 42 | Exemple 43 | Échantillon 44 | Exemple 45 | Échantillon 46 | Échantillon 47 | Échantillon 48 |
| E | S518 | Échantillon 49 | Échantillon 50 | Échantillon 51 | Exemple 52 | Échantillon 53 | Échantillon de 54 | Échantillon de 55 | Échantillon 56 | Exemple, 57 | Échantillon 58 | Échantillon de 59 | Exemple 60 |
| F | S520 | Échantillon de 61 | Échantillon de 62 | Échantillon 63 | Échantillon 64 | Échantillon 65 | Échantillon 66 | Échantillon 67 | Échantillon 68 | Échantillon 69 | Échantillon 70 | Échantillon 71 | Échantillon 72 |
| G | S521 | Échantillon de 73 | Échantillon 74 | Échantillon de 75 | Échantillon 76 | Échantillon 77 | Échantillon 78 | Échantillon 79 | Échantillon 80 | Échantillon 81 | Échantillon 82 | Échantillon 83 | Échantillon de 84 |
| H | S522 | Échantillon 85 | Échantillon de 86 | Échantillon 87 | Échantillon 88 | Échantillon 89 | Échantillon 90 | 91 de l’échantillon | Échantillon 92 | Échantillon de 93 | Échantillon 94 | Échantillon 95 | Échantillon de 96 |
Tableau 3. Modèle de disposition d’Index différents
Figure 2 : Un graphique standard généré avec les valeurs de Ct des normes. Utilisez les valeurs d’ordonnée à l’origine et la pente de la courbe standard pour déterminer la concentration moyenne de bibliothèque de valeur Ct des bibliothèques d’échantillons en double. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Métrique | Valeurs standard | Valeurs obtenues (moyenne) |
| Rendement | 32,5 - 50Go pour Mid-sortie | 42 Go Mid-sortie |
| 100-130 Go pour haut rendement | 120 Go pour haut rendement | |
| Pourcentage Q30 | ≥ 75 % | 80 % |
| Densité de cluster | 170-230 K/mm2, optimum à 200 K/mm2 | 210 K/mm2. |
| Clusters en passant des filtres | > 70 % | 89.09 % |
| Intensité par Cycle | Au-dessus de 1000 pour chaque tuile en cellule | Au-dessus de 1500 pour chaque tuile en cellule |
| Taux d’erreur | Inférieure à 1,5 | 1.4 |
Tableau 4. Métriques pour un séquençage standard rodage Benchtop séquenceur
Figure 3 : Logiciel d’analyse de données de séquençage. (A) créer un workflow souhaité y compris règlage de la séquence, la cartographie de référence et de la qualité basé sur détection variante. Exécuter le flux de travail en sélectionnant les exemples de fichiers FASTQ (individu ou plusieurs échantillons en lot). (B) la liste des variantes structurelles montrant la position de référence, couverture, changement de nucléotides et acides aminés changement obtenu par analyse des séquences de l’échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| 1. Coupez les séquences | Paramètre utilisé |
| Couper les Bases | Paramètres par défaut |
| Filtrer sur la longueur avec un nombre maximal de nucléotides dans lectures | 1000 |
| Filtrer sur la longueur avec un nombre minimal de nucléotides dans lectures | 50 |
| 2. cartographie des lectures de référence | |
| Référence sélectionnée | CBS138 |
| Masquage de référence avec mode de masquage | Aucun masquage |
| Options de mappage | Paramètres par défaut |
| 3. local réalignement | |
| Paramètres d’alignement | Paramètres par défaut |
| 4. qualité basée détection variante | |
| Rayon de voisinage | 5 |
| Comte de gap et décalage minimal | 2 |
| Qualité minimale de voisinage | 15 |
| Minimales de qualité centrale | 20 |
| Filtres de lecture | Paramètres par défaut |
| Couverture minimale | 4 |
| Fréquence de variante minimale (%) | 75 |
| Filtres variant | Paramètres par défaut |
| Maximale attendue des allèles (ploïdie) | 2 |
| Code génétique | Norme |
Tableau 5. Les paramètres du flux de travail sur le logiciel
| Position de nucléotides variante structurale | Gène | Médicament (s) | Trouvé dans Nombre de Isolats |
Isolats résistants aux | Isolats sensibles | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, RVC, ITR | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, RVC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, RVC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, RVC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, RVC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, RVC, ITR | 5 | CMRL-6 CMRL-12 | CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, RVC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, RVC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, RVC, ITR | 4 | CMRL-7 | CMRL-1, CMRL-2 CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, RVC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
Tableau 6. Rapport de position variant structurelle dans les gènes liés à la résistance aux médicaments antifongiques dans le nombre d’isolats de c. glabrata
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Discussion
Cette étude a déterminé faisabilité, délais approximative et la précision de détection WGS-guidée de la pharmacorésistance dans c. glabrata. Le délai (TAT) pour la préparation de la bibliothèque et le séquençage a été de quatre jours et la déclaration des jours d’une à deux résultats analysés. Cela se compare au moins un montant similaire TAT pour des analyses de sensibilité des plaques de culture et Sanger sequencing avec un nombre significativement plus élevé d’échantillons. Environ 30 à 90 c. glabrata génomes peuvent être séquencés basée sur le séquençage de la capacité de débit-cellules, avec couverture de séquençage de 80-100 %. Étant donné que le séquençage a été effectué sur une installation de laboratoire interne WGS, les coûts/ressources nécessaires dans cette étude était équivalent aux coûts actuels de Sanger séquençage et basée sur l’analyse des essais avec un coût estimatif de AUD 80-100 par échantillon. La sensibilité de tous les isolats ont été déterminées par une trousse commerciale qui ont été lues visuellement à l’aide d’un miroir de la lecture. La croissance de la culture a été révélée par le changement dans l’indicateur de croissance colorimétrique du bleu au rose. MIC a été lu comme le premier bleu bien après une série de rose (croissance) des puits soit la plus faible concentration de l’agent antifongique qui inhibe la croissance sensiblement. Pour les groupes de travail, des banques d’ADN génomiques ont été préparés à l’aide de la trousse de préparation de bibliothèque. L’isolat bibliothèques ont été quantifiés par qPCR. Les bibliothèques quantifiés ont été regroupées ensemble pour le séquençage final course effectué dans le séquenceur de benchtop.
Dans notre analyse, la présence de SNP dans les gènes conférant une résistance aux isolats de corrélation avec l’élevé in vitro MIC contre la drogue. Les mutationsS629P en FKS1 et S663P en FKS2 identifiés ont été clairement associées à la résistance aux échinocandines. Les deux mutations sont bien connues pour conférer résistance phénotypique29,30. Simultanée séquençage de génome a également révélé des mutations dans les gènes liés à 5-flucytosine (gène FCY2) et de la résistance de l’azole (CgPDR1, CgCDR1 et CgFLR1) qui sont associés à la résistance grâce à l’activation / surexpression comme l’efflux pompes26,27,28. Cependant, les effets des mutations dans les gènes liés à l’azole et 5-flucytosine résistance31 doit être confirmée par supplémentaires fonctionnel analyse afin d’évaluer le niveau d’expression de gène. Fait intéressant, grand nombre de SNP se retrouvent également dans la paroi cellulaire adhésines dans tous les isolats32,33. Mutations du gène EPA6, qui code pour la formation de biofilm, adhérence ont été relativement fréquemment33. En outre, les isolats CMRL-3, 4-CMRL et CMRL-8 que n’a pas fourni de mutations dans les gènes de résistance aux azolés n’avaient aucuns SNP documentée dans EPA1 et EPA624,34. Toutefois, dans l’ensemble, aucun lien spécifique entre les SNP dans les adhésines et drogues PRI n’introuvable en raison du faible nombre d’isolats de test inclus.
La mise en œuvre des groupes de travail en mycologie clinique nécessite la mise en œuvre du système de gestion qualité robuste. Haute qualité génomiques ADN et contrôle de la qualité points de contrôle qui accompagnent chaque étape de l’expérience est essentielle pour un bon résultat de groupes de travail. La pureté de l’ADN de c. glabrata échantillon soumis pour préparation de bibliothèque peut être validée à l’aide de la méthode absorbance UV (absorbance à 260/280 nm et 260/230 nm25. Dans notre expérience, pour c. glabrata ADN le 260/280 devrait se situer dans la plage recommandée de 1,8-2 et 260/230 entre 2-2.2. Si les extraits d’ADN ne respectent pas ces exigences de qualité, une purification supplémentaire par précipitation à l’éthanol peut être effectuée. Tagmentation est une étape essentielle de l’ajout des séquences de code à barres unique appelés amorces index ainsi que permettre la différenciation des échantillons multiples pendant le séquencement (multiplexage). Ainsi, dans le processus d’indexation, redoublez de prudence il faut éviter la contamination croisée entre les échantillons et les tubes de l’index afin de gérer l’unicité des indices. Normalisation dans le séquençage s’assure que toutes les différences qui en découlent dans les bibliothèques d’échantillons ADN qui pourraient introduire un biais dans les données de séquençage est éliminé. Une normalisation étape utilisant qu'un perle basé de nettoyage habituellement permet l’élimination d’excès bibliothèque fragments d’ADN et les variations en taille bibliothèque survenant au cours de la préparation de la bibliothèque. L’incubation de 30 min est donc essentielle pour la densité de cluster optimale. Densité de cluster qui est la densité des grappes clonales de bibliothèques d’échantillons générés par amplification massive au cours de la qualité des données influences séquençage comme Q30 scores et sortie de données total. Tandis qu’underclustering pourrait donner la qualité élevée des données, il se traduira également par données inférieures tandis qu’overclustering résultats Q30 bas de sortie. Les bibliothèques d’ADN doivent être exempts de résidus de billes magnétiques pendant le nettoyage de la PCR et la normalisation comme qui peuvent interférer avec la qualité des données de séquençage. QPCR doit être effectuée sur au moins quelques bibliothèques d’échantillon représentatif dont une souche de référence comme témoin positif (la souche ATCC de c. glabrata dans ce cas) d’un ensemble particulier d’indices. Les valeurs moyennes de la Ct devraient être entre 15-18 cycles. N’importe quel échantillon au sein de cette gamme est jugée acceptable pour la course de séquençage. Toutefois, si les valeurs de Ct sont hors de cette plage le qPCR doit être répété. Échantillons peuvent parfois échouer qPCR soit en raison de la faible qualité d’entrée ADN ou erreur lors de la préparation de la bibliothèque. Basé sur les calculs de contrôle positif, la concentration minimale des bibliothèques qui produira des données bonne séquence devrait être établie. À l’aide de la concentration moyenne des bibliothèques provenant de qPCR, le volume de bibliothèque final à ajouter pour l’ordonnancement peut être calculé. Ceci devrait produire la concentration recommandée bibliothèque final entre 1,4-13:08. Pour les bibliothèques c. glabrata , la gamme Ct établie à l’aide de la souche ATCC c. glabrata était entre 16-18 cycles avec une plage de concentrations de bibliothèque moyenne de 300 à 500 pM. Le volume correspondant de bibliothèques regroupées d’ADN dénaturés a été portée de 60-65 µL pour une gamme de densité de cluster entre 200-250 K/mm2.
Les fichiers de données de séquence doivent être démultiplexage avant une analyse plus approfondie. Ceci peut être réalisé par un tri dans leurs bibliothèques respectives en utilisant leurs codes à barres après que séquençage a eu lieu. Une étape facultative de la garniture de la qualité des fichiers FASTQ peut être effectuée préalablement à l’analyse de données. Les lectures de séquence des isolats de groupes de travail ont été analysées à l’aide d’un flux de travail personnalisé créé dans un progiciel standard. Cela a permis de tailler des lectures de faible qualité et mappe ensuite à la référence du génome de Candida . Le génome de référence, CBS138, a été téléchargé de Candida Genome Database (CGD) et lié au flux de travail avant l’analyse. La présence d’ADN se répète dans le génome de Candida (par exemple, les gènes de l’adhésine ont répétitions d’ADN) peut compliquer l’alignement de séquences courtes à lire et l’appel du SNP. Ceci peut être amélioré par le remaniement des locaux supplémentaire de séquences mappés. La sortie du flux de travail est une liste de variantes structurelles qui fourni des gènes annotés avec non-synonyme et synonyme de SNP positions et de couverture. Cela a été utilisé pour identifier le SNP dans les gènes d’intérêt et de préparer le rapport final de l’analyse d’isolats (tableau 6).
Certaines limites de notre étude et notre approche doivent être reconnues. Notre rapport est issu d’un petit nombre d’isolats et il n’y a aucune base de données standard résistome fongiques pour la mycologie clinique. Bien que le séquençage de l’ADN Sanger est actuellement plus accessible aux laboratoires cliniques, il a limité la capacité de détecter simultanément plusieurs mutations du gène qui confèrent la résistance aux médicaments chez Candida spp (> 20 FKS mutations pour échinocandine résistance seule). Avec le regroupement des services de pathologie et de coûts décroissants de séquençage, l’aspect pratique de l’utilisation de groupes de travail sur Sanger sequencing, est susceptible d’augmenter. Toutefois, une considération importante est l’installation initiale de laboratoire et coût de la mise en place de groupes de travail instrument ainsi que pour l’utilisateur final formation du personnel de laboratoire. Les coûts à long terme comprendrait essentiellement, se procurer des trousses de réactifs de séquençage et accessoires. Coût supplémentaire et un TAT supérieur doivent s’attendre si l’instrument de groupes de travail n’est pas interne. En outre, la présence de séquences répétées de l’ADN dans le génome peut compliquer l’alignement de séquences courtes à lire et l’appel du SNP. La disponibilité de qualité référence génomes séquencés en utilisant long-lecture technologies contribuera à maintenir la qualité de l’identification du SNP.
À l’avenir, WGS est censée apporter des améliorations dans la thérapie clinique de temps considérée accéléré dans les paramètres de diagnostics qui est facilement accessible et interprétées par les cliniciens20,22. Ceci peut être réalisé avec développement d’organisée et à jour WGS médicament antifongique résistance aux bases de données du roman et des mutations confirmatives de déduire la résistance aux antifongique. Comme plusieurs génomes de levures cliniquement pertinentes de la sensibilité aux médicaments phénotypique connu deviennent disponibles pour l’analyse, nouveaux marqueurs et des mécanismes de résistance aux médicaments antifongiques sont susceptibles d’être découvert. Ces développements vont réduire considérablement les risques d’échecs du traitement en raison de la pharmacorésistance multi et toxicité des médicaments. En conclusion, le séquençage de prochaine génération avec les protocoles de gestion de qualité appropriée permet la détection du génome-large de mutations conférant la résistance à Candida glabrata , qui peut augmenter les tests phénotypiques dans les laboratoires de mycologie. Les renseignements fournis par séquençage du génome rapide de cliniquement pertinente Candida spp peuvent fondamentalement modifier notre compréhension des mécanismes de résistance aux différentes classes d’agents antifongiques et améliorer la gestion des patients avec envahissantes maladies cryptogamiques.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun intérêts financiers concurrents et aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Centre d’infectiologie et de microbiologie, de la santé publique. Les auteurs n’ont pas reçu tout autre financement pour cette étude. Les auteurs remercient les Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann et Ranjeeta Menon de leurs conseils d’experts et d’assistance avec l’expérience de séquençage du génome entier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
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