इस पत्र में हम एक IL4-10 रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन के उत्पादन और गुणवत्ता नियंत्रण के तरीकों के लिए विवरण प्रदान करते हैं । हम यह भी दिखाने के लिए इस प्रोटीन की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए भड़काऊ दर्द का एक माउस मॉडल में दर्द को हल करने के लिए ।
पुराने दर्द का इलाज करने के लिए मुश्किल है और लगातार दर्द को हल करने के लिए नए दृष्टिकोण तत्काल जरूरत है । विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस ंयायपालिका न्यूरो प्रतिरक्षा बातचीत को विनियमित करने के लिए उनकी क्षमता के कारण दुर्बल दर्द की स्थिति के इलाज के लिए उंमीदवारों का वादा कर रहे हैं । हालांकि, शारीरिक रूप से वे विभिंन साइटोकिंस के एक नेटवर्क में काम करते हैं, और इसलिए उनके उपचारात्मक प्रभाव इष्टतम नहीं किया जा सकता है जब स्टैंड-अलोन दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया । इस सीमा को दूर करने के लिए, हम विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस IL4 और IL10 का फ्यूजन प्रोटीन विकसित की है । यहां, हम उत्पादन और IL4 के गुणवत्ता नियंत्रण-10 रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन के लिए तरीकों का वर्णन है और हम लगातार भड़काऊ दर्द का एक माउस मॉडल में दर्द को हल करने के लिए IL4-10 संलयन प्रोटीन की प्रभावशीलता का परीक्षण ।
पुराने दर्द 21 वीं सदी के सबसे दुर्बल और इलाज चिकित्सा समस्याओं में से एक बनी हुई है, प्रभावित > वयस्क आबादी1के 20%,2। हालांकि, उपचार पुराने दर्द से राहत प्रदान करने के लिए अक्सर अप्रभावी या गंभीर साइड इफेक्ट के कारण बंद किया जाना चाहिए3. महत्वपूर्ण बात, वर्तमान में उपलब्ध दवाओं केवल रोगसूचक राहत प्रदान करते हैं, लेकिन काफी संशोधित या पुराने दर्द का इलाज नहीं है । हालांकि पुराने दर्द के लिए एक स्नायविक विकार प्रतीत होता है, सबूत पुराने दर्द विकास में प्रतिरक्षा प्रणाली की भागीदारी4पता चलता है,5। इसके अलावा, प्रतिरक्षा आधारित दृष्टिकोण दर्द का इलाज करने के लिए उभर रहे हैं । उदाहरण के लिए, विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस पुराने दर्द6,7,8के कई मॉडलों में दर्द को बाधित । हालांकि, विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस एक छोटी आधा जीवन है, उनके संभावित दर्द बाधा प्रभाव को कम करने । इसके अलावा, विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस एक दूसरे के साथ संगीत कार्यक्रम में सबसे बेहतर काम करते हैं । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम हाल ही में विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस interleukin-4 (IL4) और interleukin-10 (IL10) एक अणु में जुड़े । IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन व्यक्ति साइटोकिंस9की तुलना में जीर्ण भड़काऊ और neuropathic दर्द को बाधित करने में बेहतर प्रभावकारिता से पता चलता है । यहां हम वर्णन कैसे ऐसे फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन किया है, शुद्ध, और कैसे अपनी गुणवत्ता नियंत्रित है ।
IL4-10 संलयन प्रोटीन एक ुपे अभिव्यक्ति वेक्टर सीडीएनए-10 फ्यूजन प्रोटीन कोडिंग ले जाने के साथ HEK293-एफ कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा मानव कोशिकाओं में उत्पादित है । HEK293-F कोशिकाओं प्रोटीन के बाद अनुवाद के संशोधन के लिए अनुमति देने के लिए चुना जाता है, कुछ है कि बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्रणालियों में नहीं होती है । sialic एसिड के साथ कैपिंग glycan का अनुकूलन करने के लिए, सीडीएनए कोडिंग बीटा-galactoside-2, 3-sialyl-ट्रांस्फ़्रेज़ वेक्टर में एक दूसरे transgene के रूप में शामिल किया गया है । फ्यूजन प्रोटीन संस्कृति supernatant के संबध प्रोटीन शुद्धि का उपयोग कर शुद्ध है क्योंकि यह अंय तरीकों से शुद्धि से अधिक शक्तिशाली है जैसे आकार अपवर्जन या आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी10,11। IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन शुद्ध करने के लिए, हम में इस्तेमाल किया घर IL4 के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी बनाया. शुद्धता और शुद्ध IL4 की गैर-गतिविधि का मूल्यांकन-10 संलयन प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण के एक भाग के रूप में किया जाता है । उत्पादित बैचों की पवित्रता सोडियम Dodecyl सल्फेट Polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) और उच्च दबाव आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (HP-SEC) द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन की एक पूरी रक्त संस्कृतियों में lipopolysaccharide (एलपीएस)-प्रेरित ट्यूमर परिगलन कारक-अल्फा (TNFα) उत्पादन को बाधित करने की क्षमता को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, और यह व्यक्ति के संयोजन के लिए तुलना साइटोकिन्स.
अंत में, आदेश में IL4 की क्षमता का परीक्षण करने के लिए-10 फ्यूजन प्रोटीन पुराने दर्द को बाधित करने के लिए, हम का वर्णन कैसे फ्यूजन प्रोटीन लगातार भड़काऊ दर्द के व्यापक रूप से इस्तेमाल किया माउस मॉडल में एनाल्जेसिक के रूप में परीक्षण किया जा सकता है12,13,14 . यहां हम एक भड़काऊ दर्द मॉडल के तरीकों का वर्णन । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि अंय दर्द मॉडलों का इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, neuropathic दर्द मॉडल), अनुसंधान के सवालों के आधार पर है कि उत्तर की जरूरत है । इन मॉडलों में दर्द का आकलन करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है व्यवहार उपाय है कि पैदा हुआ और गैर पैदा दर्द उपायों की एक किस्म का उपयोग करें । यहां, हम यांत्रिक और थर्मल में व्यवहार प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन के लिए मूल्यांकन के तरीकों का वर्णन किया । अहानिकर उत्तेजनाओं के लिए यांत्रिक संवेदनशीलता वॉन Frey परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया है, whilst थर्मल संवेदनशीलता Hargreaves परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया है । महत्वपूर्ण बात, गैर पैदा hyperalgesia/allodynia गतिशील वजन असर परीक्षण का उपयोग कर मापा जाता है । इन उपायों को व्यापक रूप से दर्द के उपाय के रूप में स्वीकार किए जाते है और दर्द थ्रेसहोल्ड और संभावित जानवरों द्वारा अनुभवी दर्द पर महत्वपूर्ण जानकारी उपज15,16,17। अंय उपायों गैर पैदा दर्द का आकलन करने के लिए (जैसे, उत्तेजना स्वतंत्र), जैसे वातानुकूलित जगह वरीयता परीक्षण के रूप में,18मूल्यवान हो सकता है । दर्द को बाधित करने के लिए दवा की क्षमता का आकलन करने के लिए, हम फ्यूजन प्रोटीन के intrathecal प्रशासन प्रदर्शन किया, के रूप में प्रशासन के इस मार्ग के साथ कम प्रोटीन खुराक दर्द से संबंधित क्षेत्रों तक पहुँचने के लिए और प्रणालीगत (साइड) प्रभाव से बचने की जरूरत है19, 20.
इस पांडुलिपि के उत्पादन और एक रिकॉमबिनेंट IL4 के लक्षण वर्णन के लिए तरीके बताता है-10 संलयन प्रोटीन, और तरीके लगातार भड़काऊ दर्द के माउस मॉडल में बाधा भड़काऊ hyperalgesia में इसकी प्रभावकारिता का परीक्षण करने के ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम का हिस्सा एक Utrecht विश्वविद्यालय जीवन विज्ञान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया है
FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |