Summary

Modellierung von Osteosarkom mit Li-Fraumeni-Syndrom, die Patienten abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von Li-Fraumeni Syndrom (LFS) Patienten abgeleiteten Fibroblasten, Differenzierung der iPSCs über mesenchymalen Stammzellen (MSCs), Osteoblasten und Modellierung in vivo Tumorgenese mit LFS Patienten abgeleitet Osteoblasten.

Abstract

Li-Fraumeni Syndrom (LFS) ist eine autosomal dominant erblichen Krebs-Erkrankung. Patienten mit LFS sind anfällig für eine verschiedene Art der Tumoren, darunter Osteosarkom–eines der am häufigsten primären nicht-hämatologischen malignen Erkrankungen im Kindes- und Jugendalter. LFS bietet daher eine ideale Vorlage um diese Bösartigkeit zu studieren. Unter Ausnutzung der iPSC Methoden, LFS-assoziierten Osteosarkom erfolgreich durch Differenzierung LFS Patienten iPSCs mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und dann Osteoblasten–die Zellen der Ursprung für Osteosarkome modelliert werden kann. Diese LFS Osteoblasten rekapitulieren Onkogene Eigenschaften des Osteosarkom, bietet ein attraktives Modellsystem für die Abgrenzung der Pathogenese der Osteosarkom. Diese Handschrift zeigt ein Protokoll für die Erzeugung von iPSCs von LFS Patienten Fibroblasten, Differenzierung der iPSCs zu MSCs, Differenzierung von MSCs Osteoblasten und in Vivo Tumorgenese mit LFS Osteoblasten. Diese iPSC Krankheitsmodell kann erweitert werden, um potenzielle Biomarker oder therapeutische Ziele für die LFS-assoziierten Osteosarkom zu identifizieren.

Introduction

Zwischen 2006 und 2007 führte mehrere bahnbrechende Erkenntnisse aus den Labors von Dr. Shinya Yamanaka und James A. Thomson zur Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)1,2,3. Durch Reprogrammierung von somatischen Zellen mit definierten transcriptional Faktoren zu Form iPSCs, konnten Forscher Zellen mit wichtigen Eigenschaften nämlich generieren, Pluripotenz und Selbsterneuerung, die zuvor nur galt bestehen in humanen embryonalen Stammzellen (hESC). iPSCs konnte von jedem Individuum oder Patienten generiert werden und mussten nicht aus Embryonen, erheblich erweitern das Repertoire der verfügbaren Krankheiten und Hintergründe für die Studie abgeleitet werden. Seitdem wurden Patienten abgeleitet iPSCs zur rekapitulieren des Phänotyps der verschiedenen menschlichen Krankheiten, Alzheimer-Krankheit4 und Amyotrophe Lateralsklerose5 bis lange QT-Syndrom6,7, 8.

Diese Fortschritte in der iPSC-Forschung haben auch neue Wege für die Krebsforschung eröffnet. Mehrere Gruppen haben kürzlich Patient iPSCs zu Krebs Modellentwicklung unter einem anfälligen genetischen Hintergrund9,10,11, mit erfolgreichen Anwendung zeigte bisher in Osteosarkom9verwendet, Leukämie10,11,12, und Darmkrebs13. Obwohl Krebs iPSC-abgeleitete Modelle noch in den Kinderschuhen sind, zeigten sie großes Potenzial in Phenocopying krankheitsassoziierten Malignome, verdeutlichend pathologische Mechanismen und therapeutische Verbindungen14zu identifizieren.

Li-Fraumeni Syndrom (LFS) ist eine autosomal dominant erblichen Krebs-Erkrankung, verursacht durch TP53 Germline Mutation15. Patienten mit LFS sind anfällig für eine verschiedene Art der Malignome einschließlich Osteosarkom, machen LFS iPSCs und ihre abgeleiteten Zellen besonders gut geeignet für das Studium dieser Bösartigkeit16. Eine iPSC-basierte Osteosarkom-Modell wurde gegründet im Jahr 2015 mit LFS Patienten abgeleitet iPSCs9 anschließend an mesenchymalen Stammzellen (MSCs) differenziert und dann zu Osteoblasten, die aus Zellen des Osteosarkom. Diese LFS Osteoblasten rekapitulieren Osteosarkom-assoziierten osteogene Differenzierung Mängel und Onkogenen Eigenschaften demonstriert Modells Potenzial als “Knochentumor in einer Schale” Plattform. Interessanterweise genomweite Transkriptom-Analysen zeigen Aspekte ein Osteosarkom-gen-Signatur in der LFS Osteoblasten und die Features von diesem AKE Genexpressionsprofil korrelieren mit einer schlechten Prognose in Osteosarkom9, unter Angabe der Potenzial der LFS iPSCs Krankheitsmodelle, Funktionen von klinischer Relevanz zu offenbaren.

Diese Handschrift enthält eine detaillierte Beschreibung der LFS Patienten abgeleitet iPSCs, Modell Osteosarkom Verwendung. Es wird ausführlich auf die Generation der LFS iPSCs, Differenzierung der iPSCs MSCs und dann zu Osteoblasten und Nutzung eines in Vivo Xenograft-Modells mit LFS Osteoblasten. Das LFS Krankheitsmodell umfasst mehrere Vorteile, vor allem die Möglichkeit, unbegrenzte Zellen in allen Entwicklungsstadien für mechanistische Studien, Biomarker identifizieren und Drogen-screening-9,14Osteosarkom zu generieren, 16.

Zusammenfassend bietet das LFS iPSC-basierte Osteosarkom Modell ein attraktives komplementäre System für Osteosarkom Forschung voranbringen. Diese Plattform bietet auch ein Proof-of-Concept für die Krebs-Modellierung mit iPSCs Patienten abgeleitet. Diese Strategie beschrieben leicht erweiterbar auf Modell Malignome mit anderen genetischen Erkrankungen mit Krebs Prädispositionen verbunden.

Protocol

Diese Arbeit wurde von der University of Texas Health Science Center in Houston (UTHealth) Animal Welfare Committee genehmigt. Die Experimente werden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit den Normen festgelegten UTHealth Zentrum für Labormedizin Tier & Care (CLAMC), der American Association für Laboratory Animal Care (AAALAC International) anerkannt ist. Die Versuchspersonen in dieser Studie fallen unter Szenario ein (“No menschlichen Themen Research”), entsprechend den Festlegungen der NIH-SF424 Dokumentation…

Representative Results

Dieses Protokoll stellt die Verfahren einschließlich der LFS iPSC-Generation, MSC Differenzierung Osteoblasten Differenzierung und in Vivo Tumorgenese Assay mit LFS MSC abgeleitet Osteoblasten. Schema für die Generation der LFS iPSCs von Fibroblasten durch die Verwendung eines handelsüblichen Sendai Virus Umprogrammierung Kit ist in Figur 1Agezeigt. Sendai-Virus-basierte Lieferung der Ya…

Discussion

Um höhere Effizienz der MSC-Differenzierung zu erreichen, sind mehrere Aspekte entscheidend. Einer ist der Kultur-Zustand des iPSCs vor Einleitung eines MSC Differenzierung. Das Protokoll präsentiert im Manuskript basiert auf früheren Studien 9,17. iPSCs müssen für mindestens 2 Wochen auf MEFs kultiviert werden. IPSCs in guter Erhaltung sind Bedingungen auf MEFs für Zellen, auf die Gelatine beschichtete Platte für MSC Differenzierung Anhängen von entschei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R. Z. wird durch UTHealth Innovation für Krebs Prävention Ausbildung Programm Pre-Doctoral Forschungsstipendium (Krebs-Prävention und Forschung Institute of Texas RP160015 gewähren) unterstützt. J.t. stützt sich auf die Ke Lin Programm der ersten Affiliated Hospital von Sun Yat-Sen-Universität. D.-f.l. ist der CPRIT Gelehrte in der Krebsforschung und vom NIH Weg zu Unabhängigkeit Award R00 CA181496 und CPRIT-Award-RR160019 unterstützt.

Materials

Plastic ware
100 mm Dish Corning 430107
60 mm Dish Corning 430166
6-well Plate Falcon 353046
12-well Plate Falcon 353043
48-well Plate Falcon 353078
1 mL Pipet Tip USA Scientific 1111-2721
200 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-0706
10 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-3700
5 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1253.001
10 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1254.001
25 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1685.001
50 mL Tube, PP SARSTEDT 62.547.100
15 mL Tube, PP SARSTEDT 62.554.100
Culture materials and Reagents
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Invitrogen A16517 Commercial Sendai virus reprogramming kit
Corning hESC-Qualified Matrix Corning 354277 Basement membrane matrix
CF1 MEFs, irradiated ThermoFisher A34180
DMEM Sigma-Aldrich D5671
DMEM/F12 Corning 10-090-CV
αMEM Corning 10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotec 130-104-368 Commercial iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12 ThermoFisher 12660012
FBS Opti-Gold GenDEPOT F0900-050
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher A3181502
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-CI
L-Glutamine Solution Sigma-Aldrich G7513
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Human FGF-basic (bFGF) PEPROTECH 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PEPROTECH 100-00AB
β-Glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422
Dexamethasone Sigma-Aldrich A4902
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A5960
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) Corning 21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XF Miltenyi Biotec 130-104-688 Commercial passaging solution
Accutatse Cell Detachment Solution Corning 25-058-CI Cell detachment solution
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) Calbiochem 420220
0.25% Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049
Collagenase, Type II   ThermoFisher 17101015
Human NANOG Antibody R&D System AF1997
OCT4 Antibody (H-134) Santa Cruz sc-9081
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody R&D System FAB1435P
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen DB Biosciences 560123
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 705-545-003
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-545-144
PE Mouse Anti-Human CD105 eBioscience 12-1057-42
FITC Mouse Anti-Human CD44 DB Biosciences 555478
PE Mouse Anti-Human CD73 DB Biosciences 550257
PE Mouse Anti-Human CD166 DB Biosciences 560903
FITC Mouse Anti-Human CD24 DB Biosciences 555427
Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Goat Serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018
Chloroform ThermoFisher C298-500
2-Propanol ThermoFisher A416-4
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade ThermoFisher BP28184
DNase I, RNase-free (1 U/µL) ThermoFisher EN0521
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 1708891BUN
iQ SYBR Green Supermix BioRad 1708884
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free Corning 354262
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch DB Biosciences 309597

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  4. Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer’s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
  5. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  6. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  7. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  8. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  9. Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
  10. Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
  11. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  12. Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  13. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
  14. Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
  15. Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
  16. Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
  17. Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
  18. Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhou, R., Xu, A., Tu, J., Liu, M., Gingold, J. A., Zhao, R., Lee, D. Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57664, doi:10.3791/57664 (2018).

View Video