Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von Li-Fraumeni Syndrom (LFS) Patienten abgeleiteten Fibroblasten, Differenzierung der iPSCs über mesenchymalen Stammzellen (MSCs), Osteoblasten und Modellierung in vivo Tumorgenese mit LFS Patienten abgeleitet Osteoblasten.
Li-Fraumeni Syndrom (LFS) ist eine autosomal dominant erblichen Krebs-Erkrankung. Patienten mit LFS sind anfällig für eine verschiedene Art der Tumoren, darunter Osteosarkom–eines der am häufigsten primären nicht-hämatologischen malignen Erkrankungen im Kindes- und Jugendalter. LFS bietet daher eine ideale Vorlage um diese Bösartigkeit zu studieren. Unter Ausnutzung der iPSC Methoden, LFS-assoziierten Osteosarkom erfolgreich durch Differenzierung LFS Patienten iPSCs mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und dann Osteoblasten–die Zellen der Ursprung für Osteosarkome modelliert werden kann. Diese LFS Osteoblasten rekapitulieren Onkogene Eigenschaften des Osteosarkom, bietet ein attraktives Modellsystem für die Abgrenzung der Pathogenese der Osteosarkom. Diese Handschrift zeigt ein Protokoll für die Erzeugung von iPSCs von LFS Patienten Fibroblasten, Differenzierung der iPSCs zu MSCs, Differenzierung von MSCs Osteoblasten und in Vivo Tumorgenese mit LFS Osteoblasten. Diese iPSC Krankheitsmodell kann erweitert werden, um potenzielle Biomarker oder therapeutische Ziele für die LFS-assoziierten Osteosarkom zu identifizieren.
Zwischen 2006 und 2007 führte mehrere bahnbrechende Erkenntnisse aus den Labors von Dr. Shinya Yamanaka und James A. Thomson zur Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)1,2,3. Durch Reprogrammierung von somatischen Zellen mit definierten transcriptional Faktoren zu Form iPSCs, konnten Forscher Zellen mit wichtigen Eigenschaften nämlich generieren, Pluripotenz und Selbsterneuerung, die zuvor nur galt bestehen in humanen embryonalen Stammzellen (hESC). iPSCs konnte von jedem Individuum oder Patienten generiert werden und mussten nicht aus Embryonen, erheblich erweitern das Repertoire der verfügbaren Krankheiten und Hintergründe für die Studie abgeleitet werden. Seitdem wurden Patienten abgeleitet iPSCs zur rekapitulieren des Phänotyps der verschiedenen menschlichen Krankheiten, Alzheimer-Krankheit4 und Amyotrophe Lateralsklerose5 bis lange QT-Syndrom6,7, 8.
Diese Fortschritte in der iPSC-Forschung haben auch neue Wege für die Krebsforschung eröffnet. Mehrere Gruppen haben kürzlich Patient iPSCs zu Krebs Modellentwicklung unter einem anfälligen genetischen Hintergrund9,10,11, mit erfolgreichen Anwendung zeigte bisher in Osteosarkom9verwendet, Leukämie10,11,12, und Darmkrebs13. Obwohl Krebs iPSC-abgeleitete Modelle noch in den Kinderschuhen sind, zeigten sie großes Potenzial in Phenocopying krankheitsassoziierten Malignome, verdeutlichend pathologische Mechanismen und therapeutische Verbindungen14zu identifizieren.
Li-Fraumeni Syndrom (LFS) ist eine autosomal dominant erblichen Krebs-Erkrankung, verursacht durch TP53 Germline Mutation15. Patienten mit LFS sind anfällig für eine verschiedene Art der Malignome einschließlich Osteosarkom, machen LFS iPSCs und ihre abgeleiteten Zellen besonders gut geeignet für das Studium dieser Bösartigkeit16. Eine iPSC-basierte Osteosarkom-Modell wurde gegründet im Jahr 2015 mit LFS Patienten abgeleitet iPSCs9 anschließend an mesenchymalen Stammzellen (MSCs) differenziert und dann zu Osteoblasten, die aus Zellen des Osteosarkom. Diese LFS Osteoblasten rekapitulieren Osteosarkom-assoziierten osteogene Differenzierung Mängel und Onkogenen Eigenschaften demonstriert Modells Potenzial als “Knochentumor in einer Schale” Plattform. Interessanterweise genomweite Transkriptom-Analysen zeigen Aspekte ein Osteosarkom-gen-Signatur in der LFS Osteoblasten und die Features von diesem AKE Genexpressionsprofil korrelieren mit einer schlechten Prognose in Osteosarkom9, unter Angabe der Potenzial der LFS iPSCs Krankheitsmodelle, Funktionen von klinischer Relevanz zu offenbaren.
Diese Handschrift enthält eine detaillierte Beschreibung der LFS Patienten abgeleitet iPSCs, Modell Osteosarkom Verwendung. Es wird ausführlich auf die Generation der LFS iPSCs, Differenzierung der iPSCs MSCs und dann zu Osteoblasten und Nutzung eines in Vivo Xenograft-Modells mit LFS Osteoblasten. Das LFS Krankheitsmodell umfasst mehrere Vorteile, vor allem die Möglichkeit, unbegrenzte Zellen in allen Entwicklungsstadien für mechanistische Studien, Biomarker identifizieren und Drogen-screening-9,14Osteosarkom zu generieren, 16.
Zusammenfassend bietet das LFS iPSC-basierte Osteosarkom Modell ein attraktives komplementäre System für Osteosarkom Forschung voranbringen. Diese Plattform bietet auch ein Proof-of-Concept für die Krebs-Modellierung mit iPSCs Patienten abgeleitet. Diese Strategie beschrieben leicht erweiterbar auf Modell Malignome mit anderen genetischen Erkrankungen mit Krebs Prädispositionen verbunden.
Um höhere Effizienz der MSC-Differenzierung zu erreichen, sind mehrere Aspekte entscheidend. Einer ist der Kultur-Zustand des iPSCs vor Einleitung eines MSC Differenzierung. Das Protokoll präsentiert im Manuskript basiert auf früheren Studien 9,17. iPSCs müssen für mindestens 2 Wochen auf MEFs kultiviert werden. IPSCs in guter Erhaltung sind Bedingungen auf MEFs für Zellen, auf die Gelatine beschichtete Platte für MSC Differenzierung Anhängen von entschei…
The authors have nothing to disclose.
R. Z. wird durch UTHealth Innovation für Krebs Prävention Ausbildung Programm Pre-Doctoral Forschungsstipendium (Krebs-Prävention und Forschung Institute of Texas RP160015 gewähren) unterstützt. J.t. stützt sich auf die Ke Lin Programm der ersten Affiliated Hospital von Sun Yat-Sen-Universität. D.-f.l. ist der CPRIT Gelehrte in der Krebsforschung und vom NIH Weg zu Unabhängigkeit Award R00 CA181496 und CPRIT-Award-RR160019 unterstützt.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |