Summary
Burada, bir protokol indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretimi için Li-Fraumeni sendromu (LFS) hasta türetilmiş fibroblastlar, iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) yoluyla farklılaşma üzerinden dokusunu ve modelleme içinde vivo mevcut LFS hasta kaynaklı dokusunu kullanarak tumorigenesis.
Abstract
Li-Fraumeni sendromu (LFS) bir otozomal dominant kalitsal kanser hastalıktır. LFS hastalarda tümör, osteosarkom--en sık birincil olmayan hematolojik maligniteler çocukluk ve ergenlik de dahil olmak üzere çeşitli tür yatkındır. Bu nedenle, LFS bu malignite eğitim için ideal bir model sağlar. IPSC yöntemlerden yararlanarak osteosarkom LFS ilişkili başarılı bir şekilde örnek alınarak LFS hasta iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) ve ardından dokusunu--menşei osteosarkom hücreleri ayırt tarafından. Bu LFS dokusunu osteosarkom, osteosarkom patogenezinde operasyona için bir çekici model sistemi sağlayan oncogenic özelliklerini özetlemek. Bu el yazması bir protokol LFS hasta fibroblastlar, farklılaşma MSCs, MSCs farklılaşma dokusunu ve LFS dokusunu kullanarak vivo içinde tumorigenesis için iPSCs dan iPSCs üretimi için gösterir. Bu IPSC hastalık modeli potansiyel biyolojik veya LFS ilişkili osteosarkom için tedavi hedefleri tanımlamak için genişletilebilir.
Introduction
2006 ve 2007 arasında laboratuvarları Drs. Shinya Yamanaka ve James A. Thomson birkaç atılım bulgular indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs)1,2,3gelişmesine yol açtı. Somatik hücre formu iPSCs için tanımlanmış transkripsiyon faktörleri ile yeniden programlama tarafından araştırmacılar yani anahtar özelliklere sahip hücreleri elde edebilecektir, Nanog ve daha önce sadece için düşünüldü kendini yenileme, insan embriyonik kök hücre var (hESCs). iPSCs herhangi bir birey ya da hasta oluşturulabilir ve embriyo, büyük ölçüde elde edilebilir hastalıklar ve arka planlar çalışma için repertuar genişleyen türetilen gerek yoktu. O zamandan beri iPSCs hasta kaynaklı çeşitli insan hastalıkları, Alzheimer hastalığı4 ve amyotrofik lateral skleroz5 uzun QT sendromu6,7, fenotip özetlemek için kullanılmıştır 8.
Bu gelişmeler IPSC araştırma Ayrıca kanser araştırmaları için yeni yollar açtı. Çeşitli gruplar son zamanlarda bugüne osteosarkom9gösterdiği başarılı uygulama modeli kanser geliştirme altında bir duyarlı genetik arka plan9,10,11, hasta iPSCs kullanmış, Lösemi10,11,12ve kolorektal kanser13. IPSC kaynaklı kanser modelleri hala onların bebeklik olmakla birlikte, patolojik mekanizmalar elucidating ve terapötik bileşiklerin14tanımlayan phenocopying maligniteler, hastalık ilişkili büyük potansiyel göstermiştir.
Li-Fraumeni sendromu (LFS) TP53 germline mutasyon15tarafından neden olduğu bir otozomal dominant kalitsal kanser hastalıktır. LFS hastalarda osteosarkom, dahil olmak üzere maligniteler çeşitli bir tür LFS iPSCs ve türetilmiş hücrelerine özellikle iyi bu malignite16eğitimi için uygun hale yatkındır. LFS hasta kaynaklı iPSCs9 daha sonra kullanarak Ayrıştırılan mezenkimal kök hücre (MSCs) ve sonra kaynaklanan dokusunu için hücreleri bir IPSC tabanlı osteosarkom modeli ilk 2015 yılında kuruldu osteosarkom. Bu LFS dokusunu Osteojenik farklılaşma osteosarkom ilişkili kusurlar ve oncogenic özellikleri, bir "bir tabak içinde kemik tümörü" platform olarak potansiyel modeli gösteren özetlemek. İlginçtir, genom-wide transcriptome analizleri bir osteosarkom gen İmzada LFS dokusunu yönlerini açığa vurmak ve bu şekil-in bu LFS gen ifade profil osteosarkom9, kötü prognoz ile ilişkili gösteren LFS iPSCs hastalık modelleri potansiyelini klinik özellikleri ortaya çıkarmak için.
Bu el yazması LFS hasta kaynaklı iPSCs modeli osteosarkom için kullanmak hakkında ayrıntılı bir açıklama sağlar. LFS iPSCs, iPSCs MSCs ve dokusunu için sonra farklılaşma ve LFS dokusunu kullanarak bir in vivo xenograft modeli kullanımı nesil ayrıntıları. LFS hastalık modeli birçok avantajı, özellikle mekanik çalışmaları, biyomarker teşhis ve ilaç9,14eleme için her aşamasında osteosarkom gelişme sınırsız hücreler oluşturma yeteneği oluşur, 16.
Özetle, LFS osteosarkom IPSC tabanlı modeli osteosarkom araştırma ilerlemek için çekici bir tamamlayıcı sistem sunar. Bu platform da bir kanıtı-of-concept hasta kaynaklı iPSCs kullanarak kanser modelleme için sağlar. Aşağıda açıklanan bu strateji modeli maligniteler kanser eğilimlerin ile diğer genetik bozuklukları ile ilişkili için kolayca genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu eser Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Houston (UTHealth) hayvan refahı Komitesi tarafından kabul edildi. Deneyler ile laboratuvar hayvan Tıp & bakım (hangi Amerikan Derneği tarafından akredite olmuştur laboratuvar (AAALAC International) için hayvan bakım CLAMC) için UTHealth Merkezi tarafından belirlenmiş standartlara sıkı uygun olarak gerçekleştirilir. Bu çalışmanın insan denekler bir ("Hayır insan konularda araştırma") senaryosunda NIH SF424 belgeleri tarafından tanımlandığı gibi düşmek. Bu nedenle, UTHealth insan Araştırma Etik Komitesi tarafından herhangi bir onay gerektirmez.
1. nesil LFS iPSCs (Şekil 1A)
- -2 günde 2 x 104 LFS hasta fibroblastlar 6-şey plaka bir kuyunun içine plaka ve fibroblast Orta (Tablo 1) içeren hücreleri oksijen %5 37 ° C'de kültür CO2 kuluçka makinesi. Fibroblastlar iletim (0 gün) günde % 50-60 izdiham ulaşmak emin olun.
- Sendai virüs iletim gün 0 gerçekleştirin. Bunu yapmak için önceden ısıtılmış fibroblast orta ile harcanan orta yerine. Virüs yeniden programlama kiti ( Tablo malzemelerigörmek) buz üzerinde ticari Sendai çözülme. LFS fibroblastlar üretici yönergelerine göre karışık Sendai virüs ile enfekte.
- Bakım transduced hücre fibroblast Orta (gün 1-6):
- Günde 1, 24 h iletimi sonra kalan Sendai virüs içeren fibroblast orta kaldırın ve 2 mL taze fibroblast orta ile değiştirin. Oksijen %5 37 ° C'de transduced fibroblastlar kültür CO2 kuluçka makinesi.
- Fibroblast orta ile Orta 2-6 günden beri her gün değiştirin.
- Bakım transduced hücre besleyici kültür koşulu (7-28 gün):
- Radyasyonlu CF1 fare embriyonik fibroblast (MEF) kültür yemekleri gün 6 hazırlamak. Bu kat yapmak kaplama sonra % 0,1 jelatin altı 100 mm doku kültürü yemekleri her plaka, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 5 mL %0,1 jelatin ekleyerek Aspire edin.
- MEFs sıvı azot kapsayıcıdan kaldır. Üreticinin yönergelerini izleyerek ticari olarak mevcut çözülme sistemi kullanarak MEFs çözülme. Hücreleri jelatin kaplı plakalar üzerinde bir tohumlama yoğunluğu 6.7 x 100 mm doku kültürü çanak başına 105 hücre çevresinde, MEF/MSC kültür orta (Tablo 1) plaka.
- MEF plakaları (7 gün) transduced hücreleri aşılamak: 1 mL % 0.25 kullanarak transduced hücre Trypsinize tripsin-EDTA 100 mm çanak için oda sıcaklığında 2-4 dakika başına. Tripsin fibroblast orta 9 mL ile etkisiz hale getirin. Konik tüpler hücrelere transfer ve santrifüj hücreleri vasıl 230 x g 4 dk. 37 ° C'de gün 6 tarihinde hazırlanan altı MEF yemekleri transduced fibroblastlar plaka ve onları fibroblast orta çanağı başına 8 ml kültür.
Not: MEFs confluency % 20 transduced hücre MEF plakalar üzerinde tohum önce civarındadır. - Günde 8, fibroblast orta atmak ve hESC Orta (Tablo 1) ile değiştirin.
- Gün 9-28 IP'leri klonlar (Şekil 1C) ortaya çıkması için bekleyin. İzlenme hESC orta her gün değiştirin ve IPS klonlar mikroskop altında ortaya çıkması izlemek. İPSCs klonlar çıplak gözle uyması gereken büyük gözlemek ve IPS klonlar besleyici-Alerjik kültür durumda genişletmeye devam edin.
- Ortaya IP'leri genişlemesi klonlar besleyici-Alerjik kültür durumda (gün 29-79 ~ 99):
- Matris kaplı plaka hazırlamak için çözümün membran matris kaplama (Tablo 1) iyi başına 120 µL 48-şey plakalı kat. Membran matris kaplama çözüm de kapsar ve kültür çanak yüzeyi kat emin olun. Kaplama çözüm kullanımdan hemen önce oda sıcaklığında 1 h. aspiratı için bırakın ve hESC Orta 2 µM ROCK inhibitörü Thiazovivin iyi başına 250 µL ekleyin.
- Gün 28 izlenme hESC orta Aspire edin ve IPS klonlar 1 x DPBS ile yıkayın. 1 mL pipet ucu ve tedavi 48-şey plaka (adım 1.4.1) bir kuyuya transferi ile görünür IP'leri klonlar almak. 48-şey plaka kuyu başına tohum bir koloni.
- Plaka vasıl 230 x g hücre eki kolaylaştırmak 4 dakika santrifüj kapasitesi. Kültür IP'leri klonlar oksijen %5 37 ° C'de CO2 kuluçka makinesi.
- Ertesi gün (gün 29), harcanan hESC orta kaldırın ve ticari olarak mevcut IPSC orta 250 µL her kuyuya ekleyin.
- IPS klonlar oksijen %5 37 ° C'de korumak CO2 kuluçka ve değişim IPSC orta her geçen gün.
- IPS klonlar % 85 izdiham ulaştığınızda, bir 1:10 at alt kültür hücreleri kültür alanına göre oranı. 60 µL hücreleri ayırmak ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya ticari passaging çözüm ekleyin.
- Bir membran matris kaplı 12-şey plaka hESC Orta 2 µM ROCK inhibitörü Thiazovivin ile 1 ml üzerinde müstakil iPSCs yarısı tohum. Kültür IP'leri klonlar bir 12-şey plaka ile piyasada bulunan IPSC orta iyi ve alt kültür iPSCs başına 1 mL 1:10, geçit 10 ulaşana kadar oranı.
Not: iPSCs 5-7 günde bir 1:10 kültürlü alt vardır oranı. IPS klonlar geçit 10 ulaşmak 10 haftaya kadar sürer. IPSC karakterizasyonu hücre morfolojisi, alkalen fosfataz (AP) aktivite ve pluripotency faktörler ve hESC işaretleri, ifadesi de dahil olmak üzere (genellikle yaklaşık 10'dan sonra gösterdi iPSCs Sendai virüs kaldırılması onayladıktan sonra incelenebilir pasajlar) (Şekil 1B-E). Antikor ve astar bilgi IPSC karakterizasyonu için Tablo 2 ve 4' de dahil edilir.
2. farklılaşma LFS iPSCs için mezenkimal kök hücre (MSCs) (Şekil 2A)
- Kültür IPSC klonlar MEF tabaklarda en az 2 hafta (gün ~ -14-0): daha önce açıklandığı gibi MEF yemekleri (100 mm doku kültürü yemekleri) hazırlamak (1.3.1 - 1.3.2). İPSCs hESC ortamda korumak ve orta her gün değiştirin. Ne zaman iPSCs ulaşmak % 90 izdiham, alt kültür iPSCs 1:10 seyreltme.
- İPSCs (0 gün) MEFs kaldırılması:
- İPSCs MEFs üzerinde 2 hafta sonra sürdürmek, kültür iPSCs 100 mm doku kültürü yemekleri kadar hücreleri % 80-90 izdiham ulaşmak. İzlenme hESC orta kaldırmak ve iPSCs 1 x DPBS 5 mL ile yıkayın. 1 mL hücreleri ayırmak ve 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya hücre dekolmanı çözeltisi ekleyin.
- MEF/MSC kültür ortamının 9 mL hücre dekolmanı çözüm etkinliği etkisiz hale getirmek ve herhangi bir kaplama olmadan yeni bir 100 mm doku kültürü tabak müstakil hücreleri aktarmak için plaka ekleyin.
- Hücreleri plakasına eklemek MEFs izin vermek 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Dikkatle bekâr iPSCs ve 4 dk için 230 x g 4 ° c de santrifüj içeren süpernatant toplamak.
Not: Dikkatsizce plaka alt reçeteye göre sarf MEFs dekolmanı yol açar.
- MSCs (gün 0 - 28) doğru iPSCs farklılaşma:
- 6-şey plaka üç wells ile 1 mL %0.1 jelatin iyi, oda sıcaklığında 30 dakika başına kat.
- Toplanan iPSCs süpernatant 2.2.4 kaldırın.
- (Gün 0) başına 2 mL ile MSC farklılaşma Orta (Tablo 1) ve tohum hücrelerinin üç kaplamalı Wells 6 ml iPSCs resuspend.
- MSC farklılaşma orta iki günde bekâr ve/veya ölü hücreleri (gün 1 - 28) kaldırmak için değiştirin.
- Olgunlaşma IPSC kaynaklı MSCs (gün 28-45):
- Harcanan MSC farklılaşma orta kaldırmak ve 1 mL 1 x DPBS hücrelerle yıkayın.
- MSCs %0.25 0.5 mL ile trypsinize tripsin-EDTA iyi 3 dakika oda sıcaklığında başına.
- Tripsin tarafından 1.5 mL MEF/MSC kültür ortamının nötralize ve MSCs Üç kuyusundan bir 15 mL konik tüp içine toplamak. 230 x g 4 ° c de santrifüj 4 dk için.
- Süpernatant kaldırmak ve MSCs MEF/MSC kültür orta ve plaka üzerinde bir 60 mm % 0,1 jelatin kaplı levha (28 gün) 3 ml resuspend.
- MSCs MEF/MSC kültür ortamda kültür ve orta iki günde değiştirin. Ne zaman hücreleri ulaşmak % 100 izdiham, alt kültür MSCs kullanarak %0.25 1:3 oranında tripsin-EDTA.
Not: MSCs fibroblast benzeri morfoloji (Şekil 2B) görüntüler. MSCs bir yüksek yoğunluklu büyüdüğünde, uzamış MSCs bir girdap benzeri desen (Şekil 2B) oluşabilir. - MSC yüzey işaretleyicileri CD44, CD73, CD105 ve CD166 inceleyerek IPSC kaynaklı MSCs değerlendirmek için immünfloresan boyama gerçekleştirmek (Şekil 2C).
Not: Antikor seyreltme Tablo 2' de gösterilmiştir. Canlı hücrelerin immünfloresan boyama üretici yönergelerine göre gerçekleştirilir. - Onay alındıktan sonra 100 mm doku kültürü yemekleri 1:3 oranında MSCs genişletin. Şişeleri (100 mm doku kültürü çanak başına 3 şişe) aşağı dondurma dondurucu orta % 10 DMSO ve % 90'ı içeren kullanarak FBS.
Not: MSC nüfus zenginleştirmek için MSCs CD105 kullanarak sıralayabilirsiniz+, CD24-ölçüt akış sitometresi9,17. Ayrıştırılan IPSC kaynaklı MSCs PDGF AB-tabanlı yöntemi yaygın olarak kullanarak 2-3 ay kültür MSC kimlik9kaybı olmadan sürdürülebilir. MSCs MSC özellikleri onayladıktan sonra erken bir geçit numarasından dondur.
3. farklılaşma LFS MSCs dokusunu (Şekil 3A) için
- Osteojenik farklılaşma (gün -1) için MSCs hazırlanması
- Hücre Osteojenik farklılaşma Protokolü tamamlamak için yeterli bir miktar emin olmak için 100 mm doku kültürü yemekleri için % 95 izdiham kültürlü MSCs başlar. Harcanan kültür orta kaldırmak ve MSCs 1 x DPBS 5 mL ile yıkayın.
- MSCs % 0.25 tripsin-EDTA başına 100 mm çanak 3 dakika oda sıcaklığında 1 mL ile trypsinize. Hücreleri değil üzerinde trypsinized emin olmak için hücre dekolmanı % 50'si mikroskop altında görülmektedir trypsinization durdurur.
- Tripsin tarafından 9 mL MEF/MSC kültür ortamının nötralize ve MSCs 3 kuyulardan bir 15 mL konik tüp içine toplamak. 230 x g 4 ° c de santrifüj 4 dk için.
- Süpernatant Aspire edin, MSCs 5 mL MSC orta resuspend ve bir hemasitometre tarafından hücreleri saydırmak.
- Plaka uygun sayıda MSCs kültür plaka üzerinde.
Not: Hücre sayıları 12-şey plaka, 6 iyi-plaka ve 100 mm doku kültürü yemekleri detayını Tablo 3' te özetlenmiştir.
- İndüksiyon Osteojenik farklılaşma osteoblast farklılaşma Orta (ODM) (Tablo 1) (gün 0 - 24):
- MEF/MSC kültür orta Aspire edin ve ODM uygun hacmi ile değiştirin (1 mL, 2 mL ve 8 mL 12-şey plaka her şey, her şey 6-şey plaka ve 100 mm doku kültürü için çanak, sırasıyla) MSCs dokusunu (0 gün) ayırt etmek için.
- Harcanan ODM Aspire edin ve Osteojenik farklılaşma işlemi sırasında her iki günde ODM uygun hacmi ile değiştirin.
- Alkalen fosfataz (AP) gerçekleştirmek ve alkalen fosfataz kemik ilişkili preosteoblasts tarafından üretilen ve mineral ifade tarafından üretilen algılamak için boyama Alizarin Red S (ARS) dokusunu, sırasıyla, günde 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 ve 24 ( Olgun Şekil 3B).
Not: AP boyama ve ARS boyama üretici protokol sonrası ticari olarak mevcut kit kullanılarak gerçekleştirilir. - Preosteoblast ve olgun osteoblast işaretleri (ALPL ve COL1A1 preosteoblasts için; ifade düzeyde incelemek PTH1R ve BGLAP için olgun dokusunu) qRT-PCR (Şekil 3 c) tarafından.
Not: Gün 9'dan sonra Osteojenik farklılaşma beklenen olumlu AP boyama ve olumlu ARS boyama Osteojenik farklılaşma 21 gün sonra beklenebilir. MEF/MSC kültür ortamında büyüyen MSCs AP boyama ve ARS boyama negatif bir kontrol servis edilebilir.
4. LFS MSC kaynaklı dokusunu (Şekil 4A) in vivo Tumorigenesis çalışmaya Xenograft modeli
- LFS MSCs farklılaşma dokusunu için:
- Tohum 3-4.5 x 100 mm doku kültürü tabak içinde 105 MSCs. Beş yemekleri bir Subkutan Enjeksiyon için hazırlamak.
- Kültür MSCs ODM 3.2 gün 14 kadar açıklandığı gibi dokusunu için MSCs ayırt etmek içinde.
- Subkutan Enjeksiyon için farklılaştırılmış dokusunu hazırlanması:
- Osteoblast dekolmanı çözüm (Tablo 1) hazırlamak için 1 g tip II collagenase αMEM orta collagenase II çözüm (1 mg/mL) yapmak için 1000 ml geçiyoruz. -20 ° C'de collagenase II çözüm tutmak Mix % 0.25 tripsin-EDTA ve collagenase II çözüm 1:1 oranında dokusunu yapmak müfrezesi eriyik için.
- Harcanan ODM kaldırmak ve farklılaştırılmış dokusunu 1 x DPBS 5 mL ile 100 mm çanak yıkayın.
- Osteoblast dekolmanı çözüm 100 mm çanak başına 1,5 mL ekleyin ve yemekleri 30 dk. incelemek için 37 ° C'de kuluçkaya ve osteoblast dekolmanı mikroskobu tarafından olun.
- Dokusunu dekolmanı çözüm ODM tarafından etkisiz hale getirmek ve 50 mL konik tüp içinde müstakil dokusunu toplamak. 5 min için 230 x g 4 ° c de santrifüj.
- Süpernatant kaldırmak ve ODM orta 25 mL hücrelerde resuspend. Hücreleri toplanan hücre kaldırmak için bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak.
- 1 x 107 dokusunu Subkutan Enjeksiyon ve santrifüj hücreleri 230 x g 4 ° c de başına 4 min için hazırlayın.
- 1 x 107 dokusunu 50 µL buz gibi 1 resuspend x DPBS. Mix dokusunu fenol kırmızısı ücretsiz membran Matrix (süspansiyon ve membran matris bir 1:1 oranında karışık dokusunu) 50 µL ile Ayrıştırılan ve enjeksiyon önce buzda dokusunu korumak.
-
LFS MSC kaynaklı dokusunu in vivo xenograft tümör modeli:
- 8-hafta-yaşlı kadın immün NU/NU fareler inhale %5 (v/v) isoflurane 1 L/min (CLAMC tarafından sağlanan) oksijen sağlayan bir odasında anestezi. Hayvan yaslanmış olduktan sonra anestezik iletim sistemi %2 (v/v) inhale isoflurane 200 mL/dak (CLAMC tarafından sağlanan) oksijen sağlayan burun konisi geçin. Anestezi derinliği fareler yapmak için kornea ve pedal refleksleri yeterince anestezi ve rahatsızlık işlem sırasında acı değil kontrol ederek izlemek.
- Klorheksidin ve % 70 isopropanol alternatif temizleme bezi ile enjekte edilir bölgeyi dezenfekte. 26 G iğne membran matris karışık LFS dokusunu Subkutan Enjeksiyon 8 haftalık immün NU/NU fare (Şekil 4A) arka ayakları bir tarafı içine gerçekleştirmek için kullanın.
- Fareler subkutan Nodüler yoğunlukları büyümesi için enjeksiyon sitelerdeki haftalık palpasyonla gerçekleştirerek izlemek. Tümör oluşumu yaklaşık 6-10 hafta sonra enjeksiyon (Şekil 4B) görülebilir.
- Servikal çıkığı tarafından takip karbon dioksit boğulma yöntemi tarafından fareler ötenazi. Gelişmiş tümör incelemek. Tümör sınıf ve farklılaşma Dizin, preosteoblasts ve olgun dokusunu tarafından çeşitli boyama yöntemleri (Örneğin Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama, boyama Picro Sirius kırmızı ve von Kossa sırasıyla boyama) belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı LFS IPSC üretimi, MSC farklılaşma, osteoblast farklılaşma ve in vivo tumorigenesis tahlil LFS MSC kaynaklı dokusunu kullanarak da dahil olmak üzere yordamları sunar.
LFS iPSCs piyasada bulunan Sendai virüs seti yeniden programlama kullanarak fibroblastlar gelen nesil için şeması Şekil 1Aile gösterilir. Sendai virüs alan teslim Yamanaka dört faktörlerin bir sigara entegre programlama yöntemidir. Bu nedenle, istikrarlı LFS IPSC klonlar Sendai virüs genomu ve eksojen OCT4, SOX2, KLF4 ve RT-PCR tarafından belirli primerler (Şekil 1B) kullanılarak incelenebilir c-MYC transgenes kaybı olmalıdır. Üreticinin yönergelerini ettiği gibi Sendai virüssüz iPSCs nesil kültür ve geçiş durumuna göre değişir. Bu iletişim kuralı açıklanan kültür koşullarda, Sendai virüs genellikle iPSCs içinde kaldırılması 10 pasajlar (Şekil 1B) sonra tespit edilebilir. Kurulan LFS IPSC klonlar tipik hESC morfoloji sergi ve olumlu AP etkinliğini (Şekil 1 c) gösteren. LFS iPSCs son derece hızlı pluripotency faktör mRNA'ların (MİCRORNAS, OCT4, SOX2, DPPA4ve REX1), hESC H1 satır karşılaştırılabilir ve çok ebeveyn fibroblastlar (Şekil 1 d) daha yüksek. Pluripotent faktörler (MİCRORNAS, OCT4) ve hESC işaretleri (SSEA4 ve TRA-1-81) ifadesi de immünfloresan (Şekil 1E) boyama tarafından incelenebilir.
iPSCs MEFs üzerinde MSC farklılaşma (Şekil 2A) başlatmadan önce en az 14 gün boyunca korunur. Her ne kadar pek çok hücre ölümü oluyor MSC farklılaşma sırasında kitleler farklılaştırılmış hücrelerin hücre kültür plaka üzerinde görülebilir ve gün 28, fibroblast benzeri MSCs hücre kitleler kenarında görülebilir. (Şekil 2B). Alt kültür MEF/MSC kültür orta hücreleri Ayrıştırılan sonra farklılaştırılmış MSCs hızlı bir şekilde çoğalırlar ve fibroblast benzeri morfoloji gün 35 civarında göstermek ve sonra yavaş yavaş uzun bir şekil temsil ve gün 40 (Şekil 2B bir girdap gibi desen oluşturmak ). Farklılaştırılmış LFS MSCs MSC işaretleri, CD44, CD73, CD105 ve CD166 (Şekil 2C) boyama ayirt tarafından gibi hızlı.
Şekil 3A osteoblastik farklılaşma özetliyor. MSCs Osteojenik farklılaşma sinyallere tabi olan zaman, farklılaştırılmış hücrelerin gün 9 (Şekil 3B) pozitif alkalen fosfataz faaliyet göstermeye başlar. ARS boyama olgun dokusunu tarafından üretilen mineral ifade algılamak için kullanılabilir. Parlak kırmızı renkli kahverengi renk boyama yerine boyama (Şekil 3B) 21 gün sonra gözlenen ARS boyama, olumlu sonuç gösterir. Farklılaştırıcı dokusunu artan ifadesi sırasında Osteojenik farklılaşma düzeyi preosteoblast genler (ALPL ve COL1A1) ve olgun osteoblast genler (BGLAP ve PTH1R) göster.
Vivo xenograft modeli subkutan LFS MSC kaynaklı dokusunu (Şekil 4A) NU/NU farelerde enjekte edilerek kurulabilir. Tümör 6-10 hafta sonra Subkutan Enjeksiyon (Şekil 4B) görülebilir. LFS osteoblast kaynaklı tümörler olgunlaşmamış osteoblast özellikleri, pozitif AP etkinlik (AP boyama), (picrosirius kırmızı boyama) pozitif kollajen matris ifade negatif Qafqaz (von Kossa) (Şekil 4 c) boyama gösterdi. .
Resim 1 : LFS hasta fibroblastlar nesilden IPSC. (A)IPSC üretimi Şematik diyagramı. ()B) RT-PCR algılanması Sendai virüs genomu ve transgenes (KOS (KLF4, OCT4, ve SOX2), KLF4, ve c-MYC) 10 pasajlar (solda) ve fibroblast sonrası enfeksiyon sonra programlanmış IPSC klon içinde gün 11 (sağda, pozitif kontrol). LFS IPSC Sendai virüs ücretsiz sonra 10 pasajlar klonudur. GAPDH iç denetim olarak gösterilir. (C) hücre morfolojisi LFS iPSCs ve AP boyama. Ölçek çubuğu, 50 µm (D) qRT-PCR MİCRORNAS, SOX2, OCT4, DPPA4ve LFS iPSCs ifadede REX1 mRNA. hESC H1 satır ve ebeveyn LFS fibroblastlar pozitif ve negatif kontrol sırasıyla kullanılır. MRNA ifade GAPDH ifade için normalleştirilmiş. Göreli mRNA ifade hESC H1 satır 1 ayarlanır. HESC pluripotent transkripsiyon faktörleri (MİCRORNAS ve OCT4) ve LFS iPSCs (SSEA4 ve TRA-1-81) hESC yüzey işaretlerinin (E) Immunostaining. Ölçek çubuğu, 50 µm. Bu çalışmada kullanılan antikor seyreltme Tablo 2' de gösterilmiştir. Astar dizileri Tablo 4' te gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : LFS iPSCs için MSCs farklılaşma. (A)PDGF AB indüklenen MSC farklılaşma Şematik diyagramı. (B) hücre farklılaşma gün 28, gün 36 ve gün 40 + LFS IPSC kaynaklı MSCs morfolojisi. Ölçek çubuğu, 100 µm. (C) ayirt boyama gösterir farklılaştırılmış LFS MSCs CD44 sergi+, CD73+, CD105+, CD166+ve CD24- imza. Ölçek çubuğu, 30 µm. Bu çalışmada kullanılan antikor seyreltme Tablo 2' de gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : LFS MSCs dokusunu için farklılaşma. Osteojenik farklılaşma(a)Şematik diyagramı. (B) AP ve ARS boyama (3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 ve 24 gün) farklı zaman noktalarda gerçekleştirilir. LFS MSC kaynaklı dokusunu osteoblastik farklılaşma olumlu AP gün 9 ve olumlu ARS gün 21, boyama boyama yol bekleniyor. (C) qRT PCR analiz öncesi osteoblast (ALPL ve COL1A1) ve olgun osteoblast (PTH1R ile BGLAP) gen artan ifadesi sırasında Osteojenik farklılaşma göstermektedir. MRNA ifade GAPDH ifade için normalleştirilmiş. Hücre farklılaşması gün 0, göreli olarak ifade düzeyleri olduğunu. Astar dizileri Tablo 4' te gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Vivo LFS MSC kaynaklı dokusunu tumorigenesis. (A)tümör xenograft, LFS dokusunu Şematik diyagramı. (B) NU/NU fareler ayı LFS osteoblast kaynaklı tümörler Subkutan Enjeksiyon 10 hafta sonra. (C) LFS osteoblast kaynaklı tümörler H tarafından incelenmiş ve E, AP, picrosirius kırmızı ve von morfoloji için boyama Kossa kemik-AP, kollajen ve maden yatakları, sırasıyla ilişkili. LFS kaynaklı tümörler olumlu AP etkinlik, pozitif kollajen ve negatif mineral Qafqaz gösteren olgunlaşmamış osteoblast özelliklerini temsil eder. Ölçek çubuğu, 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Fibroblast Orta (500 mL) | |
DMEM | 440 mL |
Isı inaktive FBS | 50 mL |
Antibiotics(pen/strep) (100 x) | 5 mL |
Gerekli olmayan Amino asit (100 x) | 5 mL |
2-Mercaptoethanol | 3.5 ΜL |
MEF/MSC kültür orta (500 mL) | |
DMEM | 440 mL |
Isı inaktive FBS | 50 mL |
Antibiotics(pen/strep) (100 x) | 5 mL |
L-glutamin (100 x) | 5 mL |
hESC Orta (500 mL) | |
DMEM/F-12 | 384.5 mL |
Nakavt Serum değiştirme | 100 mL (Toplam: %20) |
Gerekli olmayan Amino asit (100 x) | 5 mL |
Antibiyotikler (kalem/Strep) (100 x) | 5 mL |
L-glutamin (100 x) | 5 mL |
bFGF (10 µg/mL) | 500 ΜL |
2-Mercaptoethanol | 3.5 ΜL |
MSC farklılaşma Orta (500 mL) | |
Nakavt DMEM/F-12 veya DMEM/F-12 | 445 mL |
Nakavt Serum değiştirme | 50 mL |
bFGF (10 µg/mL) | 500 µL (10 ng/mL) |
PDGF AB (25 µg/mL) | 200 µL (10 ng/mL) |
Gerekli olmayan Amino asit (100 x) | 5 mL |
2-Mercaptoethanol | 3.5 ΜL |
Osteoblast farklılaşma Orta (ODM) (500 mL) | |
αMEM | 395 mL |
Isı inaktive FBS | 50 mL |
10 mM β-gliserofosfat | 50 mL (1.08 g 50 mL αMEM) |
0,1 µM deksametazon (ışığa duyarlı) | 5 mM deksametazon 10 µL |
200 µM askorbik asit (ışığa duyarlı) | 1 mM askorbik asit 100 µL |
Antibiyotikler (kalem/Strep) (100 x) | 5 mL |
Matrigel kaplama çözüm (50 mL) | |
Membran matris | 2 mL |
DMEM/F-12 (önceden soğuk 4 ° C) | 48 mL |
Osteoblast dekolmanı çözüm (50 mL) | |
% 0.25 tripsin-EDTA | 25 mL |
Collagenase II çözüm (1 mg/mL) | 25 mL |
Not: kullanmadan önce osteoblast dekolmanı çözüm taze sağ hazırlayın. Collagenase II çözüm-20 ° C'de 6 aya kadar saklanır. |
Tablo 1: Besteleri fibroblast orta, MEF/MSC kültür orta, hESC orta, MSC farklılaşma orta, ODM ve osteoblast dekolmanı çözüm.
Antikor adı | Seyreltme |
MİCRORNAS | 1:500 |
OCT4 | 1:300 |
SSEA-4 PE-Birleşik | 1:600 |
TRI-1-81 | 1:600 |
Eşek Anti-keçi IgG | 1:500 |
Keçi Anti-tavşan IgG | 1:500 |
CD105 | 1:500 |
CD44 | 1:500 |
CD73 | 1:500 |
CD166 | 1:500 |
CD24 | 1:500 |
Tablo 2: Antikor seyreltme.
Kültür plaka | Tohumlama yoğunluğu | Tahlil |
12-şey plaka | iyi başına 0.67x104 hücre | Alkalen fosfataz (AP boyama) boyama |
(ARS boyama) boyama alizarin kırmızı S | ||
6-şey plaka | iyi başına 2 x 104 hücre | RT-PCR algılama |
Preosteoblast işaretleri: ALPL, COL1A1 | ||
Olgun osteoblast işaretleri: PTH1R, BGLAP | ||
100 mm çanak | 3 - plaka başına 4.5x105 hücre | Vivo tumorigenesis |
Tablo 3: MSCs yoğunluğu osteoblastik farklılaşma için tohum.
Sendai virüs astar | |
Hedef | Astar setleri |
SeV | İleri: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
Ters: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
KOS (KLF4/OCT4/SOX2) | İleri: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
Ters: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
KLF4 | İleri: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
Ters: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
c-MYC | İleri: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
Ters: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
RT-PCR astar | |
Hedef | Astar setleri |
MİCRORNAS | İleri: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
Ters: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
SOX2 | İleri: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
Ters: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
OCT4 | İleri: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
Ters: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
DPPA4 | İleri: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
Ters: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
REX1 | İleri: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
Ters: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
ALPL | İleri: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
Ters: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
COL1A1 | İleri: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
Ters: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
PTH1R | İleri: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
Ters: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
BGLAP | İleri: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Ters: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Tablo 4: Astar bilgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha yüksek MSC farklılaşma verim elde etmek için çeşitli yönleri önemlidir. Bir kültür iPSCs MSC ayırt etme işlemini başlatmadan önce bir durumdur. El yazması sunulan Protokolü önceki çalışmalar 9,17at dayanır. iPSCs en az 2 hafta MEFs üzerinde kültürlü olmanız gerekiyor. İPSCs iyi bakımı MEFs koşullara hücreler MSC farklılaşma için jelatin kaplı tabakta iliştirmek için kritik öneme sahiptir. Bir başka önemli yönü farklılaşma önce MEFs üzerinde iPSCs yoğunluğudur. 80 - % 90'ı confluency iPSCs, MSC farklılaşma başlatmak için tercih edilir. İPSCs büyüme hücre survival ayırt etme işlemi sırasında zarar. Son kritik nokta MSC farklılaşma başlatırken tohumlama yoğunluğudur. Bizim ellerde yüksek hücre yoğunluğu IPSC eki jelatin kaplı levha teşvik etmektedir. Bir 100 mm çanak iPSCs 6-şey plaka üç kuyu numaralı seribaşı. Doğrudan resuspending ve MSC farklılaşma orta iPSCs kaplama MSC farklılaşma inisiyasyon iPSCs, bu nedenle zaman zaman tohum sonra şiddetli hücre ölümü sonucu üzerinde büyük gerilmeler üretir. İPSCs yüksek yoğunluklu MSC farklılaşma başarı oranını artırır.
MSC farklılaşma osteoblastik Farklılaşma süreci daha basittir. Tekrarlanabilir farklılaşma sonuçlar elde etmek için Başlatan MSC numaraları tutarlı olduğundan emin olun. Sonuçlar aynı hücre satırından osteoblastik farklılaşma toplu iş toplu farklı olabilir, bu nedenle, aynı anda farklı satırları için farklılaşması kurma zaman gruplar arasında daha fazla karşılaştırmalı sonuçlar verecektir. MSC numaraları artması olumlu AP ve ARS daha önceki bir zaman noktasına boyama tarafından belirtilen Farklılaşma süreci kısaltmak. Ayrıca, ODM orta değişikliği nazik bir şekilde ele alınır ve güçlü vakum emme sistemi nedeniyle toplanan dokusunu potansiyel dekolmanı kültür işlemi sırasında geç ayırt etme aşamasında (gün 18 - 24) tavsiye edilmez olun.
Vivo xenograft deneme için kullanılan farklı dokusunu dokusunu gün 14 farklılaşma zamanda noktada vardır. Dokusunu gün 14 daha sonra toplamak ve collagens ve dokusunu tarafından üretilen diğer kemik matris malzeme büyük birikimleri nedeniyle ayırmak zordur. Osteoblast ayrılma zorluk önlemek için 2 - LFS MSCs seribaşı osteoblastik farklılaşma osteoblast farklılaşma kolaylaştırmak için başlatma adımda 3 kat daha yüksek yoğunluk. LFS MSC kaynaklı dokusunu ayrışmış ve in vivo tumorigenesis için 6-10 farklılaşma zaman noktası tahlil gün 6 - 7 farklılaşma süresi noktası gün toplanan. LFS xenograft tümör modeli osteosarkom LFS ilişkili eğitim için alternatif bir platform sağlayan vivo tumorigenic yeteneği, LFS MSC kaynaklı dokusunu özetlemek gösterir.
Özetle, LFS osteosarkom IPSC tabanlı modeli osteosarkom araştırma için değerli bir başvuru sağlar. Osteosarkom yanı sıra, LFS hastaların çeşitli türleri yumuşak doku sarkomu gibi kanserler, meme kanseri ve beyin tümörü acı. Bu nedenle, LFS IPSC tabanlı hastalık modelleri uzun olabilir diğer LFS modellemek için maligniteler ile ilgili. LFS iPSCs hasta kaynaklı birleştirme ve mutant p53 mühendislik (mutp53) hESCs18, LFS hastalık modeli de var ilişkili mutp53 maligniteler patogenezinde operasyona ve oncogenic hedefleme roman tedavi stratejileri geliştirmek büyük bir değer p5316.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
R. Z. UTHealth yenilik tarafından kanser önleme araştırma eğitim programı Pre-Doctoral bursu için (kanser önleme ve RP160015 vermek Texas Araştırma Enstitüsü) desteklenir. J.T. ilk bağlı hastane, Sun Yat-sen üniversite Ke Lin Program tarafından desteklenir. Ö-Tayback kanser araştırma'CPRIT uzman ve NIH için yol bağımsızlık Ödülü R00 CA181496 ve CPRIT Ödülü RR160019 tarafından desteklenir.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
- Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
- Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
- Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
- Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
- Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
- Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).