Her presenterer vi en protokoll for generering av indusert pluripotent stamceller (iPSCs) fra Li-Fraumeni syndrom (AKU) pasienten avledede fibroblaster, differensiering av iPSCs via stamceller (MSCs) osteoblasts og modellering i vivo tumorigenesis bruker AKU pasient-avledede osteoblasts.
Li-Fraumeni syndrom (AKU) er en autosomal dominant arvelig kreft lidelse. Pasienter med AKU er disponert for ulike typen svulster, herunder osteosarcoma – en av de mest primære ikke-hematologic malignitet i barndom og oppvekst. AKU gir derfor en ideell modell for å studere denne kreft. Utnytter iPSC metoder, AKU-assosiert osteosarcoma kan modelleres vellykket ved å skille AKU pasienten iPSCs til stamceller (MSCs), og deretter til osteoblasts – cellene i opprinnelse for osteosarcomas. Disse AKU osteoblasts recapitulate kreftfremkallende egenskaper osteosarcoma, gir en attraktiv modellsystem for skildre patogenesen av osteosarcoma. Dette manuskriptet viser en protokoll for generering av iPSCs fra AKU pasienten fibroblaster, differensiering av iPSCs til MSCs, differensiering av MSCs osteoblasts, og i vivo tumorigenesis bruker AKU osteoblasts. Denne iPSC sykdom modell kan utvides for å identifisere potensielle biomarkers eller terapeutisk mål for AKU-assosiert osteosarcoma.
Mellom 2006 og 2007 førte flere gjennombrudd funn fra laboratoriene Dr. Shinya Yamanaka og James A. Thomson til utvikling av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs)1,2,3. Omprogrammere somatiske celler med definerte transcriptional faktorer til skjemaet iPSCs, forskerne kunne generere celler med viktige egenskaper nemlig, pluripotency og selvtillit fornyelse, som var tidligere antatt å bare finnes i menneskelige embryonale stamceller (hESCs). iPSCs kan genereres fra individ eller pasienten og måtte ikke være avledet fra embryo, vesentlig utvide repertoaret tilgjengelig sykdommer og bakgrunner for studier. Siden da har pasient-avledede iPSCs blitt brukt til recapitulate fenotypen av ulike menneskelige sykdommer, Alzheimers sykdom4 og amyotrofisk lateral sklerose5 lang QT syndrom6,7, 8.
Disse fremskrittene i iPSC forskning har også åpnet nye muligheter for kreftforskning. Flere grupper har nylig brukt pasienten iPSCs modell kreft utvikling under en utsatt genetisk bakgrunn9,10,11med vellykket program vist hittil i osteosarcoma9, leukemi10,11,12og endetarmskreft13. Selv om iPSC-avledet kreft modeller er fortsatt i sin barndom, har de vist stort potensial i phenocopying sykdomsassosierte malignitet, Klargjørende patologisk mekanismer, og identifisere terapeutiske forbindelser14.
Li-Fraumeni syndrom (AKU) er en autosomal dominant arvelig kreft lidelse forårsaket av TP53 germline mutasjon15. Pasienter med AKU er disponert for ulike typen malignitet inkludert osteosarcoma, gjør AKU iPSCs og deres avledet celler spesielt godt egnet til å studere denne malignitet16. En iPSC-baserte osteosarcoma modell først ble etablert i 2015 bruker AKU pasient-avledede iPSCs9 senere differensiert til stamceller (MSCs) og deretter til osteoblasts, de stammer cellene av osteosarcoma. Disse AKU osteoblasts recapitulate osteosarcoma-assosiert osteogenic differensiering defekter og kreftfremkallende egenskaper, demonstrere modellen potensielle som “bein svulst i en rett” plattform. Interessant, genomet hele transcriptome analyser åpenbare aspekter av en osteosarcoma genet signatur i AKU osteoblasts og som kjennetegner denne AKU gene expression profilen er korrelert med dårlig prognose i osteosarcoma9, som angir den potensialet i AKU iPSCs sykdom modeller å avsløre funksjoner kliniske relevans.
Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av hvordan du bruker AKU pasient-avledede iPSCs til modell osteosarcoma. Det detaljer generering av AKU iPSCs, differensiering av iPSCs MSCs og deretter til osteoblasts, og bruk av en i vivo xenograft modellen med AKU osteoblasts. AKU sykdom modellen består av flere fordeler, blant annet muligheten til å generere ubegrenset celler i alle stadier av osteosarcoma utvikling for mekanistisk studier, biomarkør identifikasjon og narkotikarelaterte screening9,14, 16.
Oppsummert tilbyr AKU iPSC-baserte osteosarcoma modellen en attraktiv komplementære system for fremme osteosarcoma forskning. Denne plattformen gir også en proof-of-concept for kreft modellering bruker pasient-avledede iPSCs. Denne strategien beskrevet nedenfor kan lett utvides til modell malignitet forbundet med andre genetiske lidelser med kreft predisposisjoner.
For å oppnå høyere MSC differensiering effektivitet, er flere aspekter avgjørende. En er kultur tilstand iPSCs før du starter MSC differensiering. Protokollen presentert i manuskriptet er basert på tidligere studier 9,17. iPSCs må være kultivert på MEFs i minst 2 uker. Opprettholde iPSCs i god er forholdene på MEFs avgjørende for cellene til fest på den gelatin-belagt platen for MSC differensiering. En annen viktig aspekt er tettheten av iPSCs på MEF…
The authors have nothing to disclose.
R. Z. støttes av UTHealth innovasjon for kreft forebygging forskning Training Program Pre-Doctoral fellesskap (kreftforebygging og Research Institute of Texas gi RP160015). JT støttes av Ke Lin programmet for første tilknyttet sykehus for Sun Yat-sen-universitetet. D.-F.L. er CPRIT forskeren i kreftforskning og støttes av NIH vei til uavhengighet Award R00 CA181496 og CPRIT prisen RR160019.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |