هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس) من متلازمة لي-Fraumeni (الدراسة الاستقصائية) الليفية المشتقة المريض، التفريق بين إيبسكس عبر الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) إلى خلايا الاوستيوبلاستس، والنمذجة في فيفو توموريجينيسيس باستخدام خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من المريض في الدراسة الاستقصائية.
متلازمة لي-Fraumeni (الدراسة الاستقصائية) اضطراب جسمي سرطان وراثية مهيمنة. المرضى الذين يعانون من الدراسة الاستقصائية مهيئون لنوع مختلف من الأورام، بما في ذلك أوستيوساركوما-واحدة من الأورام الخبيثة غير الدموية الأولية الأكثر شيوعاً في مرحلة الطفولة والمراهقة. ولذلك، تقدم الدراسة الاستقصائية نموذجا مثاليا لدراسة هذا الورم الخبيث. الاستفادة من المنهجيات اللجنة التوجيهية، يمكن أن تكون على غرار osteosarcoma المرتبطة بالدراسة الاستقصائية بنجاح بالتفريق بين الدراسة الاستقصائية إيبسكس المريض للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs)، ومن ثم إلى خلايا الاوستيوبلاستس-خلايا المنشأ ل osteosarcomas. هذه الدراسة الاستقصائية خلايا الاوستيوبلاستس الخص النمطان خصائص osteosarcoma، توفير نظام نموذج جذاب لتحديد الآلية المرضية أوستيوساركوما. يوضح هذه المخطوطة على بروتوكول لتوليد إيبسكس من الدراسة الاستقصائية المريض الليفية، التفريق بين إيبسكس إلى MSCs، التفريق بين MSCs إلى خلايا الاوستيوبلاستس، و في فيفو tumorigenesis باستخدام خلايا الاوستيوبلاستس الدراسة الاستقصائية. ويمكن تمديد هذا النموذج المرض اللجنة التوجيهية لتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ل osteosarcoma المرتبطة بالدراسة الاستقصائية.
بين عامي 2006 و 2007، أدت نتائج اختراق عدة من مختبرات الدكتور شينيا ياماناكا وألف جيمس تومسون إلى تطوير المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس)1،،من23. بإعادة برمجة خلايا جسدية مع تعريف العوامل النسخي للنموذج إيبسكس، الباحثين وكانت قادرة على توليد خلايا ذات الخصائص الرئيسية هي، بلوريبوتينسي، والتجديد الذاتي، الذي كان يعتقد في السابق فقط موجودة في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس). إيبسكس يمكن أن تتولد من أي فرد أو المريض، ولم يكن يمكن أن تستمد من الأجنة، إلى حد كبير توسيع مرجع الأمراض المتاحة والخلفيات للدراسة. ومنذ ذلك الحين، استخدمت إيبسكس المستمدة من المريض أن الخص النمط الظاهري لمختلف الأمراض البشرية، من مرض الزهايمر4 والتصلب العضلي الجانبي5 إلى طويلة كيو تي متلازمة6،7، 8.
أوجه التقدم هذه في اللجنة التوجيهية للبحث أيضا قد فتحت آفاقاً جديدة لبحوث السرطان. عدة مجموعات مؤخرا استخدمت إيبسكس المريض لنموذج التنمية سرطان تحت خلفية وراثية عرضه9،،من1011، مع التطبيق الناجح أثبتت حتى الآن في أوستيوساركوما9، سرطان الدم10،11،12، و13من سرطان القولون والمستقيم. على الرغم من أن نماذج السرطان المستمدة من اللجنة التوجيهية لا تزال في بداياتها، قد أظهروا إمكانات كبيرة في فينوكوبيينج المرتبطة بأمراض الأورام الخبيثة، توضيح الآليات المرضية، وتحديد المركبات العلاجية14.
متلازمة لي-Fraumeni (الدراسة الاستقصائية) اضطراب جسمية سرطان وراثي السائد الناجم عن الطفرة germline TP53 15. المرضى الذين يعانون من الدراسة الاستقصائية مهيئون لنوع مختلف من الأورام الخبيثة، بما في ذلك أوستيوساركوما، مما يجعل إيبسكس الدراسة الاستقصائية والخلايا المشتقة الخاصة لا سيما مناسبة تماما لدراسة هذا الورم الخبيث16. نموذج osteosarcoma المستندة إلى اللجنة التوجيهية أنشئت أول مرة في عام 2015 في وقت لاحق باستخدام الدراسة الاستقصائية إيبسكس المستمدة من المريض9 متباينة في الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وثم إلى خلايا الاوستيوبلاستس، التي تنشأ الخلايا من أوستيوساركوما. تلخيص هذه الدراسة الاستقصائية خلايا الاوستيوبلاستس العيوب المرتبطة osteosarcoma osteogenic التمايز وخصائص النمطان، مما يدل على نموذج المحتملة كمنصة “ورم العظام في طبق”. التحليلات على نطاق الجينوم الترنسكربيتوم تكشف عن جوانب توقيع osteosarcoma الجينات في خلايا الاوستيوبلاستس الدراسة الاستقصائية من المثير للاهتمام، وأن ملامح هذه الشخصية التعبير الجيني في الدراسة الاستقصائية ترتبط بسوء التشخيص في osteosarcoma9، مشيراً إلى إمكانات الدراسة الاستقصائية إيبسكس المرض نماذج لتكشف عن ملامح أهميتها السريرية.
هذه المخطوطة يوفر وصفاً مفصلاً لكيفية استخدام الدراسة الاستقصائية إيبسكس المستمدة من المريض إلى نموذج أوستيوساركوما. أنها تفاصيل توليد إيبسكس الدراسة الاستقصائية، التفريق بين إيبسكس إلى MSCs ومن ثم إلى خلايا الاوستيوبلاستس، واستخدامها في فيفو إكسينوجرافت نموذج لاستخدام خلايا الاوستيوبلاستس الدراسة الاستقصائية. نموذج المرض الدراسة الاستقصائية وتضم العديد من المزايا، وأبرزها القدرة على توليد خلايا غير محدود في جميع مراحل التنمية osteosarcoma الدراسات الميكانيكية وتحديد العلامات البيولوجية، والمخدرات فرز149،، 16.
وباختصار، يوفر الطراز osteosarcoma المستندة إلى اللجنة التوجيهية الدراسة الاستقصائية نظام تكميلي جذابة للنهوض بالبحوث أوستيوساركوما. كما ينص هذا النظام الأساسي من بين مفهوم إثبات السرطان النمذجة باستخدام إيبسكس المستمدة من المريض. ويمكن تمديد هذه الاستراتيجية الوارد وصفها أدناه سهولة إلى نموذج الأورام الخبيثة المرتبطة مع غيرها من الاضطرابات الوراثية مع الميول السرطان.
لتحقيق مستوى أعلى من الكفاءة التمايز ماجستير، عدة جوانب الحاسمة. واحد هو شرط الثقافة إيبسكس قبل بدء المفاضلة لجنة السلامة البحرية. البروتوكول الواردة في المخطوطة يستند إلى دراسات سابقة 9،17. إيبسكس بحاجة إلى أن يكون مثقف في ميفس لمدة أسبوعين على الأقل. الحفا…
The authors have nothing to disclose.
ر. ز. معتمد من قبل “أوثيالث الابتكار” “السرطان منع التدريب برنامج بريدوكتورال زمالة بحثية” (الوقاية من السرطان ومعهد أبحاث من تكساس منح RP160015). ج. ت. معتمد من قبل البرنامج لين كه الجامعة الأولى التابعة للمستشفى من صن يأت-صن. دال-الباحث كبريت في “أبحاث السرطان” ودعم من المعاهد الوطنية للصحة في الطريق إلى الاستقلال جائزة R00 CA181496 وكبريت جائزة RR160019.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |