Her præsenterer vi en protokol for generation af induceret pluripotente stamceller (iPSCs) fra Li-Fraumeni syndrom (LFS) patient afledte fibroblaster, differentiering af iPSCs via mesenchymale stamceller (msc) til osteoblaster og modellering in vivo tumordannelse med LFS patient-afledte osteoblaster.
Li-Fraumeni syndrom (LFS) er en autosomal dominerende arvelig kræft sygdom. Patienter med LFS er disponerede for en forskellige type af tumorer, herunder osteosarkom – en af de hyppigste primære ikke-hæmatologiske maligniteter i barndommen og ungdomsårene. Derfor giver LFS en ideel model for at studere denne malignitet. At drage fordel af iPSC metoder, LFS-associerede osteosarkom kan modelleres med held ved at differentiere LFS patient iPSCs til mesenchymale stamceller (msc), og derefter til osteoblaster–celler af oprindelsen for osteosarkomer. Disse LFS osteoblaster sammenfatte muterede egenskaber af osteosarkom, giver en attraktiv modelsystem for skildrer patogenesen af osteosarkom. Dette manuskript viser en protokol for generation af iPSCs fra LFS patient fibroblaster, differentiering af iPSCs at MSC’er, differentiering af MSC’er til osteoblaster og i vivo tumordannelse med LFS osteoblaster. Denne iPSC sygdom model kan udvides til at identificere potentielle biomarkører eller terapeutiske mål for LFS-associerede osteosarkom.
Mellem 2006 og 2007 førte flere gennembrud fund fra laboratorier Drs. Shinya Yamanaka og James A. Thomson til udviklingen af induceret pluripotente stamceller (iPSCs)1,2,3. Af omprogrammering somatiske celler med definerede transcriptional faktorer til form iPSCs, forskere var i stand til at generere celler med nøglen egenskaber nemlig, pluripotency og selvfornyelse, som man tidligere troede kun findes i humane embryonale stamceller (hESCs). iPSCs kan oprettes fra enhver enkeltperson eller patienten og behøvede ikke at være afledt af embryoner, voldsomt ekspanderende repertoire af tilgængelige sygdomme og baggrunde til undersøgelsen. Siden da, har patienten-afledte iPSCs blevet brugt til at sammenfatte Fænotypen af forskellige sygdomme hos mennesker, fra Alzheimers sygdom4 og Amyotrofisk lateral sklerose5 til langt QT syndrom6,7, 8.
Disse fremskridt inden for iPSC forskning har også åbnet nye muligheder for kræftforskningen. Flere grupper har for nylig brugt patient iPSCs model kræft udvikling under en modtagelige genetiske baggrund9,10,11, med vellykket anvendelse demonstreret til dato i osteosarcoma9, leukæmi10,11,12, og kolorektal cancer13. Selv om iPSC-afledte kræftmodeller er stadig i sin vorden, har de vist stort potentiale i phenocopying sygdom-associerede maligniteter, belyse patologiske mekanismer, og at identificere terapeutiske forbindelser14.
Li-Fraumeni syndrom (LFS) er en autosomal dominerende arvelig kræft sygdom forårsaget af TP53 kønscelleoverførsel mutation15. Patienter med LFS er disponerede for en forskellige type af maligne sygdomme herunder osteosarkom, at gøre LFS iPSCs og deres afledte celler særlig velegnet til at studere denne malignitet16. En iPSC-baserede osteosarkom model blev først etableret i 2015 ved hjælp af LFS patient-afledte iPSCs9 efterfølgende opdeles i mesenchymale stamceller (msc) og derefter til osteoblaster, den oprindelse celler af osteosarkom. Disse LFS osteoblaster sammenfatte osteosarkom-associerede osteogenic differentiering defekter og muterede egenskaber, demonstrerer model potentiale som en “knogletumor i et fad” platform. Interessant, genome-wide transkriptom analyse afsløre aspekter af en osteosarkom gen signatur i LFS osteoblaster, og at funktionerne i denne LFS gen expression profil er korreleret med dårlig prognose i osteosarcoma9, der angiver den potentialet i LFS iPSCs sygdomsmodeller til at afsløre funktioner af klinisk relevans.
Håndskriftet indeholder en detaljeret beskrivelse af hvordan man bruger LFS patient-afledte iPSCs til model osteosarkom. Det beskriver generation af LFS iPSCs, differentiering af iPSCs at MSC’er og derefter til osteoblaster, og brugen af en i vivo xenograft model ved hjælp af LFS osteoblaster. LFS sygdom model består af flere fordele, især evnen til at generere ubegrænset celler i alle faser af osteosarkom udvikling for Mekanistiske undersøgelser, biomarkør identifikation og stof screening9,14, 16.
I Resumé tilbyder LFS iPSC-baserede osteosarkom model en attraktiv komplementære system for at fremme osteosarkom forskning. Denne platform giver også en proof of concept for kræft modellering ved hjælp af patient-afledte iPSCs. Denne strategi er beskrevet nedenfor kan udvides let til model maligne sygdomme forbundet med andre genetiske sygdomme med kræft prædisposition.
For at opnå højere MSC differentiering effektivitet, er flere aspekter kritisk. En er betingelsen kultur af iPSCs før indlede MSC differentiering. Protokollen præsenteret i håndskriftet er baseret på tidligere undersøgelser 9,17. iPSCs skal være kulturperler på MEFs i mindst 2 uger. Opretholde iPSCs i gode er betingelser på MEFs afgørende for celler til at fastgøre på gelatine-belagt pladen for MSC differentiering. Et andet vigtigt aspekt er massefyl…
The authors have nothing to disclose.
R. Z. er støttet af UTHealth Innovation for kræft forebyggelse Research Training Program Pre-Doctoral Fellowship (forebyggelse af kræft og Research Institute of Texas give RP160015). J.T. understøttes af Ke Lin Program for det første tilknyttede Hospital af Sun Yat-sen Universitet. D.-F.L. CPRIT scholar i kræftforskning og understøttes af NIH vej til uafhængighed Award R00 CA181496 og CPRIT Award RR160019.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |