Ostéosarcome utilisant le Syndrome de Li-Fraumeni cellules souches de pluripotentes induites Patient dérivé de modélisation
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la génération de pluripotentes induites des cellules souches (CISP) de Syndrome de Li-Fraumeni (LFS) patient dérivée fibroblastes, différenciation de CISP par l’intermédiaire de cellules souches mésenchymateuses (CSM) d’ostéoblastes et modélisation in vivo tumorigenèse utilisant des ostéoblastes patient dérivé de LFS.
Abstract
Syndrome de Li-Fraumeni (EPA) est une affection autosomique dominante cancer héréditaire. Les patients avec l’EFT sont prédisposés à un divers types de tumeurs, notamment ostéosarcome–un des plus souvent malignes non hématologique primaires dans l’enfance et l’adolescence. LFS offre donc un modèle idéal pour étudier cette malignité. Profitant des méthodologies de l’iPSC, ostéosarcome LFS-associés peut être modélisé avec succès en différenciant EFT patient CISP de cellules souches mésenchymateuses (CSM), puis aux ostéoblastes–les cellules d’origine des ostéosarcomes. Ces ostéoblastes LFS récapitulent des propriétés oncogènes de l’ostéosarcome, fourniture d’un système de modèle attrayant pour délimiter la pathogenèse de l’ostéosarcome. Ce manuscrit montre un protocole pour la génération de CISP de fibroblastes de patients LFS, différenciation du CISP de MSCs, différenciation des MSCs aux ostéoblastes et in vivo tumorigenèse utilisant des ostéoblastes LFS. Ce modèle de maladie iPSC peut être étendu pour identifier des biomarqueurs potentiels ou cibles thérapeutiques pour l’ostéosarcome associés à LFS.
Introduction
Entre 2006 et 2007, plusieurs conclusions de la percée des laboratoires des Drs Shinya Yamanaka et James A. Thomson conduit à l’élaboration de pluripotentes induites des cellules souches (CISP)1,2,3. En reprogrammant des cellules somatiques avec des facteurs transcriptionnels définis à forme CISP, les chercheurs ont pu générer des cellules ayant des caractéristiques clés à savoir, pluripotence et auto-renouvellement, que l’on croyait seulement existent dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). CISP pourrait provenir de n’importe quel individu ou patient et ne devait pas être provenant d’embryons, élargissant considérablement le répertoire des maladies disponibles et des horizons pour l’étude. Depuis lors, CISP patient dérivés ont été utilisés pour récapituler le phénotype de diverses maladies humaines, de la maladie d’Alzheimer4 et sclérose latérale amyotrophique5 QT long syndrome6,7, 8.
Ces avancées dans la recherche de l’iPSC ont également ouvert de nouvelles avenues pour la recherche sur le cancer. Plusieurs groupes ont récemment utilisé CISP patient au développement du cancer de modèle sous un fond génétique sensibles9,10,11, avec une application réussie démontrée à ce jour l’ostéosarcome9, la leucémie10,11,12et du cancer colorectal13. Bien que les modèles de cancer iPSC dérivés sont encore à leurs débuts, ils ont démontré grand potentiel en cancers associés à la maladie phenocopying, élucider les mécanismes pathologiques et d’identifier des composés thérapeutiques14.
Syndrome de Li-Fraumeni (EPA) est une maladie de cancer héréditaire dominante autosomale causée par de mutation germinale TP53 15. Les patients avec l’EFT sont prédisposés à un divers types de tumeurs malignes dont l’ostéosarcome, faire EFT CISP et leurs dérivées de cellules particulièrement bien adaptée à l’étude de cette tumeur maligne16. Un modèle basé sur iPSC ostéosarcome fut institué en 2015 à l’aide de LFS CISP patient dérivé9 par la suite se différenciée en cellules souches mésenchymateuses (CSM) et puis d’ostéoblastes, la provenance des cellules de l’ostéosarcome. Ces ostéoblastes LFS récapitulent les défauts associés à ostéosarcome ostéogénique différenciation et des propriétés oncogènes, démontrant le potentiel comme une plate-forme de « tumeur osseuse dans un plat » du modèle. Fait intéressant, génome transcriptome analyses révèlent des aspects d’une signature de gène d’ostéosarcome en ostéoblastes LFS et caractéristiques de ce profil d’expression génique LFS corrélées avec un pronostic sombre dans l’ostéosarcome9, indiquant la potentiel des modèles de maladies CISP LFS pour révéler les caractéristiques de pertinence clinique.
Ce manuscrit fournit une description détaillée de comment utiliser EFT dérivé de patient CISP d’ostéosarcome de modèle. Il détaille la génération de LFS CISP, différenciation du CISP pour MSCs et puis aux ostéoblastes et utilisation d’un modèle xénogreffe in vivo à l’aide des ostéoblastes LFS. Le modèle de maladie EFT comporte plusieurs avantages, notamment la capacité de générer des cellules illimités à tous les stades du développement de l’ostéosarcome pour études mécanistes, l’identification de biomarqueurs et drogues dépistage9,14, 16.
En résumé, le modèle de base iPSC ostéosarcome LFS offre un système complémentaire attrayant pour faire avancer la recherche de l’ostéosarcome. Cette plate-forme offre également une preuve de concept pour la modélisation du cancer à l’aide de CISP dérivé de patient. Cette stratégie décrite ci-dessous peut être facilement étendue à malignités modèle associées aux autres maladies génétiques avec les prédispositions du cancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour parvenir à une plus grande efficacité de différenciation de MSC, plusieurs aspects sont essentiels. L’un est la condition de culture de CISP avant d’initier la différenciation MSC. Le protocole présenté dans le manuscrit est issu des précédentes études 9,17. CISP doivent être cultivés sur MEFs pendant au moins 2 semaines. Maintenir le CISP en bonne conditions sur MEFs sont critiques pour les cellules à fixer sur la plaque de gélatine-enduit …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R. Z. est soutenue par l’Innovation UTHealth Cancer Prevention Training programme Pre-Doctoral bourse de recherche (prévention du Cancer et Research Institute of Texas accorder RP160015). J.T. est pris en charge par le programme de Lin Ke de l’Université de premier affilié hôpital de Sun Yat-sen. D.-F.L. est le savant CPRIT en cancérologie et soutenu par les NIH voie vers l’indépendance prix R00 CA181496 et CPRIT prix RR160019.
Materials
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
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