Här presenterar vi ett protokoll för generering av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från Li-Fraumeni syndrom (AKU) patientens härledda fibroblaster, differentiering av iPSCs via mesenkymala stamceller (MSC) till osteoblaster, och modellering i vivo tumourigenesis med LFS patientderiverade osteoblaster.
Li-Fraumeni syndrom (AKU) är en autosomalt dominerande ärftlig cancer sjukdom. Patienter med AKU är predisponerade för en olika typ av tumörer, inklusive osteosarkom–en av de vanligaste primära icke-hematologiska maligniteterna i barndomen och tonåren. LFS ger därför en idealmodell för att studera detta malignitet. Dra nytta av iPSC metoder, LFS-associerade osteosarkom kan modelleras framgångsrikt genom att differentiera LFS patienten iPSCs till mesenkymala stamceller (MSC), och sedan till osteoblaster–cellerna av ursprung för osteosarkom. Dessa LFS osteoblaster recapitulate onkogena egenskaperna för osteosarkom, att tillhandahålla en attraktiv modellsystem för avgränsar patogenesen av osteosarkom. Detta manuskript demonstrerar ett protokoll för generering av iPSCs från LFS patienternas fibroblaster, differentiering av iPSCs till MSCs, differentiering av MSCs att osteoblaster och i vivo uppkomst med LFS osteoblaster. Denna iPSC sjukdom modell kan förlängas för att identifiera potentiella biomarkörer eller terapeutiska mål för LFS-associerade osteosarkom.
Mellan 2006 och 2007 ledde flera genombrott fynd från laboratorierna i Drs. Shinya Yamanaka och James A. Thomson till utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)1,2,3. Genom en omprogrammering kroppsceller med definierade transkriptionell faktorer att formuläret iPSCs, forskare kunde generera celler med nyckelegenskaper nämligen, pluripotency och självförnyelse, som man tidigare trott att bara finnas i mänskliga embryonala stamceller (hESCs). iPSCs kan genereras från någon individ eller patienten och behövde inte härledas från embryon, kraftigt utöka repertoaren av tillgängliga sjukdomar och bakgrunder för studien. Sedan dess har patientderiverade iPSCs används för att sammanfatta fenotypen av olika mänskliga sjukdomar, från Alzheimers sjukdom4 och amyotrofisk lateralskleros5 till lång QT syndrom6,7, 8.
Dessa framsteg i iPSC forskning har också öppnat nya vägar för cancerforskning. Flera grupper har nyligen använt patienten iPSCs modell cancer utveckling under en mottagliga genetiska bakgrunden9,10,11, med framgångsrik tillämpning visat hittills i osteosarkom9, leukemi10,11,12, och kolorektal cancer13. Även om iPSC-derived cancer modeller är fortfarande i sin linda, har de visat stor potential i phenocopying sjukdom-associerade maligniteter, belysa patologiska mekanismer, och identifiera terapeutiska föreningar14.
Li-Fraumeni syndrom (AKU) är en autosomalt dominerande ärftlig cancer sjukdom orsakas av TP53 könsceller mutation15. Patienter med AKU är predisponerade för en olika typ av maligniteter inklusive osteosarkom, att göra LFS iPSCs och deras härledda celler särskilt väl lämpad för att studera detta malignitet16. En iPSC-baserade osteosarkom modell fastställdes först år 2015 med LFS patientderiverade iPSCs9 därefter differentieras efter mesenkymala stamceller (MSC) och sedan till osteoblaster, de med ursprung celler av osteosarkom. Dessa LFS osteoblaster recapitulate osteosarkom-associerade osteogent differentiering defekter och onkogena egenskaper, visar modellen potential som en ”Ben tumör i en maträtt” plattform. Intressant, genome-wide transkriptom analys avslöja aspekter av en osteosarkom gen signatur i LFS osteoblaster och som kännetecknar denna LFS gen uttryck profil är korrelerade med dålig prognos i osteosarkom9, som anger den LFS iPSCs sjukdomsmodeller potential att avslöja funktioner klinisk relevans.
Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av hur du använder LFS patientderiverade iPSCs till modell osteosarkom. Det Detaljer generering av LFS iPSCs, differentiering av iPSCs till MSCs och sedan till osteoblaster och användning av en i vivo xenograft modell med LFS osteoblaster. LFS sjukdom modellen består av flera fördelar, bland annat förmågan att generera obegränsad celler i alla skeden av osteosarkom utveckling för mekanistiska studier, biomarkör identifiering och drug screening9,14, 16.
Sammanfattningsvis erbjuder LFS iPSC-baserade osteosarkom modellen ett attraktivt kompletterande system för att främja osteosarkom forskning. Denna plattform ger också ett proof-of-concept för cancer modellering använder patientderiverade iPSCs. Denna strategi som beskrivs nedan kan lätt utvidgas till modell maligniteter är associerad med andra genetiska sjukdomar med anlag för cancer.
För att uppnå högre MSC differentiering effektivitet, är flera aspekter kritiska. En är iPSCs kultur skick innan MSC differentiering. Protokollet presenteras i manuskriptet är baserat på tidigare studier 9,17. iPSCs behöver vara odlade på MEFs i minst 2 veckor. Att upprätthålla iPSCs i bra är villkor på MEFs kritiska för celler att fästa på gelatin-belagd plattan för MSC differentiering. En annan viktig aspekt är tätheten av iPSCs på MEFs inna…
The authors have nothing to disclose.
R. Z. stöds av UTHealth Innovation för Cancer Prevention Research Utbildning Program Pre-Doctoral Fellowship (förebyggande av Cancer och Research Institute of Texas bevilja RP160015). J.T. stöds av Ke Lin programet av första anslutna sjukhus av Sun Yat-sen University. D.-F.L. är den CPRIT vetenskapsman inom cancerforskningen och stöds av NIH väg till självständighet Award R00 CA181496 och CPRIT Award RR160019.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |