Summary

Modeling osteosarkom med Li-Fraumeni syndrom patientderiverade inducerade pluripotenta stamceller

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för generering av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från Li-Fraumeni syndrom (AKU) patientens härledda fibroblaster, differentiering av iPSCs via mesenkymala stamceller (MSC) till osteoblaster, och modellering i vivo tumourigenesis med LFS patientderiverade osteoblaster.

Abstract

Li-Fraumeni syndrom (AKU) är en autosomalt dominerande ärftlig cancer sjukdom. Patienter med AKU är predisponerade för en olika typ av tumörer, inklusive osteosarkom–en av de vanligaste primära icke-hematologiska maligniteterna i barndomen och tonåren. LFS ger därför en idealmodell för att studera detta malignitet. Dra nytta av iPSC metoder, LFS-associerade osteosarkom kan modelleras framgångsrikt genom att differentiera LFS patienten iPSCs till mesenkymala stamceller (MSC), och sedan till osteoblaster–cellerna av ursprung för osteosarkom. Dessa LFS osteoblaster recapitulate onkogena egenskaperna för osteosarkom, att tillhandahålla en attraktiv modellsystem för avgränsar patogenesen av osteosarkom. Detta manuskript demonstrerar ett protokoll för generering av iPSCs från LFS patienternas fibroblaster, differentiering av iPSCs till MSCs, differentiering av MSCs att osteoblaster och i vivo uppkomst med LFS osteoblaster. Denna iPSC sjukdom modell kan förlängas för att identifiera potentiella biomarkörer eller terapeutiska mål för LFS-associerade osteosarkom.

Introduction

Mellan 2006 och 2007 ledde flera genombrott fynd från laboratorierna i Drs. Shinya Yamanaka och James A. Thomson till utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)1,2,3. Genom en omprogrammering kroppsceller med definierade transkriptionell faktorer att formuläret iPSCs, forskare kunde generera celler med nyckelegenskaper nämligen, pluripotency och självförnyelse, som man tidigare trott att bara finnas i mänskliga embryonala stamceller (hESCs). iPSCs kan genereras från någon individ eller patienten och behövde inte härledas från embryon, kraftigt utöka repertoaren av tillgängliga sjukdomar och bakgrunder för studien. Sedan dess har patientderiverade iPSCs används för att sammanfatta fenotypen av olika mänskliga sjukdomar, från Alzheimers sjukdom4 och amyotrofisk lateralskleros5 till lång QT syndrom6,7, 8.

Dessa framsteg i iPSC forskning har också öppnat nya vägar för cancerforskning. Flera grupper har nyligen använt patienten iPSCs modell cancer utveckling under en mottagliga genetiska bakgrunden9,10,11, med framgångsrik tillämpning visat hittills i osteosarkom9, leukemi10,11,12, och kolorektal cancer13. Även om iPSC-derived cancer modeller är fortfarande i sin linda, har de visat stor potential i phenocopying sjukdom-associerade maligniteter, belysa patologiska mekanismer, och identifiera terapeutiska föreningar14.

Li-Fraumeni syndrom (AKU) är en autosomalt dominerande ärftlig cancer sjukdom orsakas av TP53 könsceller mutation15. Patienter med AKU är predisponerade för en olika typ av maligniteter inklusive osteosarkom, att göra LFS iPSCs och deras härledda celler särskilt väl lämpad för att studera detta malignitet16. En iPSC-baserade osteosarkom modell fastställdes först år 2015 med LFS patientderiverade iPSCs9 därefter differentieras efter mesenkymala stamceller (MSC) och sedan till osteoblaster, de med ursprung celler av osteosarkom. Dessa LFS osteoblaster recapitulate osteosarkom-associerade osteogent differentiering defekter och onkogena egenskaper, visar modellen potential som en ”Ben tumör i en maträtt” plattform. Intressant, genome-wide transkriptom analys avslöja aspekter av en osteosarkom gen signatur i LFS osteoblaster och som kännetecknar denna LFS gen uttryck profil är korrelerade med dålig prognos i osteosarkom9, som anger den LFS iPSCs sjukdomsmodeller potential att avslöja funktioner klinisk relevans.

Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av hur du använder LFS patientderiverade iPSCs till modell osteosarkom. Det Detaljer generering av LFS iPSCs, differentiering av iPSCs till MSCs och sedan till osteoblaster och användning av en i vivo xenograft modell med LFS osteoblaster. LFS sjukdom modellen består av flera fördelar, bland annat förmågan att generera obegränsad celler i alla skeden av osteosarkom utveckling för mekanistiska studier, biomarkör identifiering och drug screening9,14, 16.

Sammanfattningsvis erbjuder LFS iPSC-baserade osteosarkom modellen ett attraktivt kompletterande system för att främja osteosarkom forskning. Denna plattform ger också ett proof-of-concept för cancer modellering använder patientderiverade iPSCs. Denna strategi som beskrivs nedan kan lätt utvidgas till modell maligniteter är associerad med andra genetiska sjukdomar med anlag för cancer.

Protocol

The University of Texas Health Science Center på Houston (UTHealth) djur välfärd kommittén godkände detta arbete. Experimenten utförs i strikt överensstämmelse med de normer som fastställts av UTHealth Center för försöksdjursmedicin & Care (CLAMC) som är ackrediterat av American Association för Laboratory Animal Care (AAALAC International). De mänskliga försökspersonerna i denna studie omfattas Scenario en (”No mänskliga försökspersoner forskning”) som definieras av NIH SF424 dokumentationen. Det …

Representative Results

Detta protokoll presenterar de förfaranden som bland annat LFS iPSC generation MSC differentiering, osteoblast differentiering och i vivo tumourigenesis assay med LFS MSC-derived osteoblaster. Systemet för generering av LFS iPSCs från fibroblaster med hjälp av ett kommersiellt tillgängliga Sendai virus omprogrammering kit visas i figur 1A. Sendai virus-baserat leverans av Yamanaka fyra…

Discussion

För att uppnå högre MSC differentiering effektivitet, är flera aspekter kritiska. En är iPSCs kultur skick innan MSC differentiering. Protokollet presenteras i manuskriptet är baserat på tidigare studier 9,17. iPSCs behöver vara odlade på MEFs i minst 2 veckor. Att upprätthålla iPSCs i bra är villkor på MEFs kritiska för celler att fästa på gelatin-belagd plattan för MSC differentiering. En annan viktig aspekt är tätheten av iPSCs på MEFs inna…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R. Z. stöds av UTHealth Innovation för Cancer Prevention Research Utbildning Program Pre-Doctoral Fellowship (förebyggande av Cancer och Research Institute of Texas bevilja RP160015). J.T. stöds av Ke Lin programet av första anslutna sjukhus av Sun Yat-sen University. D.-F.L. är den CPRIT vetenskapsman inom cancerforskningen och stöds av NIH väg till självständighet Award R00 CA181496 och CPRIT Award RR160019.

Materials

Plastic ware
100 mm Dish Corning 430107
60 mm Dish Corning 430166
6-well Plate Falcon 353046
12-well Plate Falcon 353043
48-well Plate Falcon 353078
1 mL Pipet Tip USA Scientific 1111-2721
200 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-0706
10 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-3700
5 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1253.001
10 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1254.001
25 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1685.001
50 mL Tube, PP SARSTEDT 62.547.100
15 mL Tube, PP SARSTEDT 62.554.100
Culture materials and Reagents
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Invitrogen A16517 Commercial Sendai virus reprogramming kit
Corning hESC-Qualified Matrix Corning 354277 Basement membrane matrix
CF1 MEFs, irradiated ThermoFisher A34180
DMEM Sigma-Aldrich D5671
DMEM/F12 Corning 10-090-CV
αMEM Corning 10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotec 130-104-368 Commercial iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12 ThermoFisher 12660012
FBS Opti-Gold GenDEPOT F0900-050
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher A3181502
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-CI
L-Glutamine Solution Sigma-Aldrich G7513
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Human FGF-basic (bFGF) PEPROTECH 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PEPROTECH 100-00AB
β-Glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422
Dexamethasone Sigma-Aldrich A4902
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A5960
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) Corning 21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XF Miltenyi Biotec 130-104-688 Commercial passaging solution
Accutatse Cell Detachment Solution Corning 25-058-CI Cell detachment solution
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) Calbiochem 420220
0.25% Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049
Collagenase, Type II   ThermoFisher 17101015
Human NANOG Antibody R&D System AF1997
OCT4 Antibody (H-134) Santa Cruz sc-9081
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody R&D System FAB1435P
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen DB Biosciences 560123
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 705-545-003
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-545-144
PE Mouse Anti-Human CD105 eBioscience 12-1057-42
FITC Mouse Anti-Human CD44 DB Biosciences 555478
PE Mouse Anti-Human CD73 DB Biosciences 550257
PE Mouse Anti-Human CD166 DB Biosciences 560903
FITC Mouse Anti-Human CD24 DB Biosciences 555427
Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Goat Serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018
Chloroform ThermoFisher C298-500
2-Propanol ThermoFisher A416-4
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade ThermoFisher BP28184
DNase I, RNase-free (1 U/µL) ThermoFisher EN0521
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 1708891BUN
iQ SYBR Green Supermix BioRad 1708884
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free Corning 354262
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch DB Biosciences 309597

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  4. Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer’s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
  5. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  6. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  7. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  8. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  9. Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
  10. Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
  11. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  12. Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  13. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
  14. Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
  15. Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
  16. Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
  17. Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
  18. Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhou, R., Xu, A., Tu, J., Liu, M., Gingold, J. A., Zhao, R., Lee, D. Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57664, doi:10.3791/57664 (2018).

View Video