Burada, bir protokol indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretimi için Li-Fraumeni sendromu (LFS) hasta türetilmiş fibroblastlar, iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) yoluyla farklılaşma üzerinden dokusunu ve modelleme içinde vivo mevcut LFS hasta kaynaklı dokusunu kullanarak tumorigenesis.
Li-Fraumeni sendromu (LFS) bir otozomal dominant kalitsal kanser hastalıktır. LFS hastalarda tümör, osteosarkom–en sık birincil olmayan hematolojik maligniteler çocukluk ve ergenlik de dahil olmak üzere çeşitli tür yatkındır. Bu nedenle, LFS bu malignite eğitim için ideal bir model sağlar. IPSC yöntemlerden yararlanarak osteosarkom LFS ilişkili başarılı bir şekilde örnek alınarak LFS hasta iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) ve ardından dokusunu–menşei osteosarkom hücreleri ayırt tarafından. Bu LFS dokusunu osteosarkom, osteosarkom patogenezinde operasyona için bir çekici model sistemi sağlayan oncogenic özelliklerini özetlemek. Bu el yazması bir protokol LFS hasta fibroblastlar, farklılaşma MSCs, MSCs farklılaşma dokusunu ve LFS dokusunu kullanarak vivo içinde tumorigenesis için iPSCs dan iPSCs üretimi için gösterir. Bu IPSC hastalık modeli potansiyel biyolojik veya LFS ilişkili osteosarkom için tedavi hedefleri tanımlamak için genişletilebilir.
2006 ve 2007 arasında laboratuvarları Drs. Shinya Yamanaka ve James A. Thomson birkaç atılım bulgular indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs)1,2,3gelişmesine yol açtı. Somatik hücre formu iPSCs için tanımlanmış transkripsiyon faktörleri ile yeniden programlama tarafından araştırmacılar yani anahtar özelliklere sahip hücreleri elde edebilecektir, Nanog ve daha önce sadece için düşünüldü kendini yenileme, insan embriyonik kök hücre var (hESCs). iPSCs herhangi bir birey ya da hasta oluşturulabilir ve embriyo, büyük ölçüde elde edilebilir hastalıklar ve arka planlar çalışma için repertuar genişleyen türetilen gerek yoktu. O zamandan beri iPSCs hasta kaynaklı çeşitli insan hastalıkları, Alzheimer hastalığı4 ve amyotrofik lateral skleroz5 uzun QT sendromu6,7, fenotip özetlemek için kullanılmıştır 8.
Bu gelişmeler IPSC araştırma Ayrıca kanser araştırmaları için yeni yollar açtı. Çeşitli gruplar son zamanlarda bugüne osteosarkom9gösterdiği başarılı uygulama modeli kanser geliştirme altında bir duyarlı genetik arka plan9,10,11, hasta iPSCs kullanmış, Lösemi10,11,12ve kolorektal kanser13. IPSC kaynaklı kanser modelleri hala onların bebeklik olmakla birlikte, patolojik mekanizmalar elucidating ve terapötik bileşiklerin14tanımlayan phenocopying maligniteler, hastalık ilişkili büyük potansiyel göstermiştir.
Li-Fraumeni sendromu (LFS) TP53 germline mutasyon15tarafından neden olduğu bir otozomal dominant kalitsal kanser hastalıktır. LFS hastalarda osteosarkom, dahil olmak üzere maligniteler çeşitli bir tür LFS iPSCs ve türetilmiş hücrelerine özellikle iyi bu malignite16eğitimi için uygun hale yatkındır. LFS hasta kaynaklı iPSCs9 daha sonra kullanarak Ayrıştırılan mezenkimal kök hücre (MSCs) ve sonra kaynaklanan dokusunu için hücreleri bir IPSC tabanlı osteosarkom modeli ilk 2015 yılında kuruldu osteosarkom. Bu LFS dokusunu Osteojenik farklılaşma osteosarkom ilişkili kusurlar ve oncogenic özellikleri, bir “bir tabak içinde kemik tümörü” platform olarak potansiyel modeli gösteren özetlemek. İlginçtir, genom-wide transcriptome analizleri bir osteosarkom gen İmzada LFS dokusunu yönlerini açığa vurmak ve bu şekil-in bu LFS gen ifade profil osteosarkom9, kötü prognoz ile ilişkili gösteren LFS iPSCs hastalık modelleri potansiyelini klinik özellikleri ortaya çıkarmak için.
Bu el yazması LFS hasta kaynaklı iPSCs modeli osteosarkom için kullanmak hakkında ayrıntılı bir açıklama sağlar. LFS iPSCs, iPSCs MSCs ve dokusunu için sonra farklılaşma ve LFS dokusunu kullanarak bir in vivo xenograft modeli kullanımı nesil ayrıntıları. LFS hastalık modeli birçok avantajı, özellikle mekanik çalışmaları, biyomarker teşhis ve ilaç9,14eleme için her aşamasında osteosarkom gelişme sınırsız hücreler oluşturma yeteneği oluşur, 16.
Özetle, LFS osteosarkom IPSC tabanlı modeli osteosarkom araştırma ilerlemek için çekici bir tamamlayıcı sistem sunar. Bu platform da bir kanıtı-of-concept hasta kaynaklı iPSCs kullanarak kanser modelleme için sağlar. Aşağıda açıklanan bu strateji modeli maligniteler kanser eğilimlerin ile diğer genetik bozuklukları ile ilişkili için kolayca genişletilebilir.
Daha yüksek MSC farklılaşma verim elde etmek için çeşitli yönleri önemlidir. Bir kültür iPSCs MSC ayırt etme işlemini başlatmadan önce bir durumdur. El yazması sunulan Protokolü önceki çalışmalar 9,17at dayanır. iPSCs en az 2 hafta MEFs üzerinde kültürlü olmanız gerekiyor. İPSCs iyi bakımı MEFs koşullara hücreler MSC farklılaşma için jelatin kaplı tabakta iliştirmek için kritik öneme sahiptir. Bir başka önemli yönü farkl?…
The authors have nothing to disclose.
R. Z. UTHealth yenilik tarafından kanser önleme araştırma eğitim programı Pre-Doctoral bursu için (kanser önleme ve RP160015 vermek Texas Araştırma Enstitüsü) desteklenir. J.T. ilk bağlı hastane, Sun Yat-sen üniversite Ke Lin Program tarafından desteklenir. Ö-Tayback kanser araştırma’CPRIT uzman ve NIH için yol bağımsızlık Ödülü R00 CA181496 ve CPRIT Ödülü RR160019 tarafından desteklenir.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |