Summary

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

Published: September 18, 2018
doi:

Summary

GlmSを生成する手法について述べる-熱帯熱マラリア原虫CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用して条件付きノックダウン変異体を用いた。

Abstract

マラリア罹患率と死亡率の世界の重要な原因であります。主に熱帯および亜熱帯地域に住んでいる人に影響を与える、この病気は、原虫の感染が原因です。マラリアと闘うためにより効果的な薬の開発は、この複雑な寄生虫の生物学の私達の理解を改善することによって加速することができます。これらの寄生虫の遺伝子操作の生物学を理解する鍵は、します。しかし、歴史的にマラリアのゲノムが難しかった操作します。最近では、容易に蛋白質のタグ付け、条件付きタンパク質ノックダウンの発生と遺伝子の削除を可能にするマラリア原虫に CRISPR/Cas9 ゲノム編集を利用されています。CRISPR/Cas9 ゲノム編集はマラリア研究の分野を進めるための強力なツールであると証明しました。ここで、 glmSを生成するための CRISPR/Cas9 手法について述べる-基づくマラリアでノックダウン変異体条件付き。このメソッドは、適応性の高いタンパク質タグを含む、遺伝子操作、遺伝子のノックアウトの他のタイプです。

Introduction

マラリアは、マラリア原虫属原虫によって引き起こされる壊滅的な病気です。マラリア、ほとんど致命的な人間のマラリア原虫の 51歳未満の子供を中心に、年間約 445,000 死亡を原因します。原虫媒介蚊と脊椎動物のホストを含む複雑なライフ サイクルがあります。人間最初に感染感染した蚊は吸血します。その後、寄生虫はどこに成長、成長して約 1 週間分割肝を侵入します。このプロセスの後、寄生虫は赤い血球 (赤血球) の無性複製を受ける血流に解放されます。赤血球内寄生虫の成長はマラリア2に関連付けられている臨床症状の直接責任があります。

最近まで、トランスジェニックマラリアの生産は、何ヶ月かかったし、高い故障率があった医薬品の選択のいくつかのラウンドを含む、骨の折れるプロセスをだった。この時間のかかる手順 relieson 関心領域とそのゲノムをも修復する寄生虫の内因性の能力ランダム DNA の世代改相同修理3,4,5,6.最近では、クラスター化された定期的に空間回文繰り返し/Cas9 (CRISPR/Cas9) ゲノム編集活用されている正常にマラリア7,8。マラリア研究のこの新しい技術の導入は、これらの致命的な原虫の生物学の理解を進めるために重要されています。CRISPR/Cas9 ガイド Rna (gRNAs) 興味の遺伝子に相同性のある遺伝子の特定の目標が可能です。GRNA/Cas9 複雑な認識、gRNA、遺伝子、Cas9 は、生物9,10の修復メカニズムの開始を強制二重鎖切断を紹介します。マラリア非相同末端結合を介して DNA 切断修復する機械に欠けている、のでそれは相同組換え機構を利用し、Cas9/gRNA 誘導を修復する transfected 相同 DNA テンプレートを統合二重鎖切断11,12

ここでは、プロトコルを提案マラリアでノックダウン変異体条件の世代の CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用しています。PfHsp70x の条件付きでノックダウン蛋白質のレベルにglmSリボザイムの使用するプロトコルを示します (PF3D7_0831700)、シャペロンによってエクスポートされたマラリアのホストに赤血球13,14GlmSリボザイムはグルコサミン (これは細胞のグルコサミン-6-リン酸に変換する) 処理によるタンパク質14の削減につながる、その関連付けられている mRNA を切断するアクティブになります。このプロトコルは、不安定化ドメインまたは RNA アプタマー4,5,15などの他の条件のノックダウン ツールを活用する簡単に適合できます。我々 のプロトコルの詳細コーディング シーケンス シーケンスが並ぶヘマグルチニン (HA) タグとglmSリボザイムから成る修理プラスミドの世代のある PfHsp70x オープンリーディング フレーム (ORF) と 3′ UTR に相同性です。ドライブ式、gRNA の 2 番目のプラスミッドの世代についても述べる。これら 2 種のプラスミド、Cas9 の式を駆動する第三と一緒に、赤血球にトランスフェクションし、マラリア寄生虫のゲノムを変更するために使用します。最後に、我々 はポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を記述する-ベース タグとglmSリボザイムの統合を確認する手法です。このプロトコルは、変更または強化してマラリア原虫の生物学に新しい洞察力を生成する任意のマラリア遺伝子の完全なノックアウトの小回りです。

Protocol

マラリアの連続培養ひと赤血球の使用を必要とし、我々 は血のすべての識別子を剥奪され、匿名の市販購入したユニットを利用します。制度検討委員会とジョージア大学でバイオ セーフティ オフィス私達のプロトコルを見直し、私たちの研究室で使用されているすべてのプロトコルを承認しました。 1. gRNA シーケンスを選択します。 CHOPCHOP (http://chopchop.cb…

Representative Results

シールドの突然変異の例と同様、このメソッドで使用されるプラスミドの模式図は、図 1のとおりです。トランスフェクション後突然変異体の寄生虫を識別する方法の例として図 2に HAglmSコンストラクトの統合をチェックするため Pcr の結果が表示されます。クローン板の代表的な画像は、寄生虫の存在下で培地の色…

Discussion

マラリアに CRISPR/Cas9 の実装が両方の効率を高め、寄生虫のゲノム、遺伝子操作の以前の方法と比較してを変更するために必要な時間の量を減少します。この包括的なプロトコルでは、マラリアに CRISPR/Cas9 を使用して条件付き変異体を生成するために必要な手順について説明します。ここにメソッドは、具体的には HAglmS変異体の世代向け、この戦略多様なニーズ、遺伝子?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PUF1 Cas9 と pL6 プラスミドを共有、技術支援のためジョージアの大学 (UGA) 生体顕微鏡コア Muthugapatti Kandasamy とホセ フアン ・ ロペス ・ ルビオ監督に感謝します。この作品は v. m. v. m.、および米国国立衛生ダイム財団 (バジル ・ オコナー スターター学者研究賞) の 3 月から助成金に UGA スタートアップ資金を付与円弧財団賞 D.W.C. と H.M.K.、によって支えられた (R00AI099156 とR01AI130139) 参加して (T32AI060546) H.M.K. に

Materials

Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 1652660
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 165-2086 We buy the ones that are individually wrapped
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889-250g
DSM1 Gift from Akhil Vaidya lab Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
TPP Tissue Culture 6 Well Plates MIDSCI TP92006
TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) MIDSCI TP93100
TPP Tissue Culture 96 Well Plates MIDSCI TP92096
TPP Tissue Culture 24 Well Plates MIDSCI TP92024
NEBuffer 2 New England Biolabs #B7002S
NEBuffer 2.1 New England Biolabs #B7202S
BtgZI New England Biolabs #R0703L
SacII New England Biolabs #R0157L
HindIII-HF New England Biolabs #R3104S
Afe1 New England Biolabs #R0652S
Nhe1-HF New England Biolabs #R3131L
T4 DNA Polymerase New England Biolabs #M0203S
500 mL Steritop bottle top filter unit Millipore SCGPU10RE You can use any size that fits your needs
EGTA Sigma E4378-100G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500g
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902-500g
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100g
K2HPO4 Fisher P288-500
HEPES Sigma-Aldrich H4034-500g
pMK-U6 Generated by the Muralidharan Lab n/a
pHA-glmS Generated by the Muralidharan Lab n/a
pUF1-Cas9 Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab Ghorbal et al. Nature Biotech 2014
Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280-100G
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9636-25g
Gentamicin Reagent Gibco 15710-064
Thymidine Sigma-Aldrich T1895-1G
PL6-eGFP BSD Generated by the Muralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNA Generated by the Muralidharan Lab
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.250
Albumax I Life Technologies N/A You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best
Human Red Blood Cells Interstate Blood Bank, Inc Email or call them directly for ordering We typically use O+ blood
3D7 parasite line Available upon request N/A
Lysogeny Broth (LB) Fisher BP1426-2 You can make your own, it is not necessary to use exactly this
Ampicilin Fisher BP1760-25 We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C
Ampicilin Clonetech R050A
Anti-EF1alpha Dr. Daniel Goldberg's Lab Washington University in St. Louis You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory
Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal Made by Roche, sold by Sigma 11867423001 You can use your preferred anti-HA antibody
0.6 mL tubes Fisher AB0350
Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) Fisher 22-122-911 You can also use giemsa stain
Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. Fisher 12-544-3

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Kudyba, H. M., Cobb, D. W., Florentin, A., Krakowiak, M., Muralidharan, V. CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum. J. Vis. Exp. (139), e57747, doi:10.3791/57747 (2018).

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