Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in Plasmodium Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden.
Abstract
Malaria ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität weltweit. Diese Krankheit, die vor allem in tropischen und subtropischen Regionen lebenden Menschen beeinflusst, verursacht durch Infektion mit Plasmodium -Parasiten. Die Entwicklung wirksamer Medikamente zur Bekämpfung der Malaria kann durch ein besseres Verständnis der Biologie dieser komplexen Parasiten beschleunigt werden. Genetische Manipulation dieser Parasiten ist der Schlüssel zum Verständnis ihrer Biologie; Allerdings ist historisch das Genom von p. Falciparum schwierig zu handhaben gewesen. Vor kurzem wurde CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung im Malaria-Parasiten, zulassend einfacher Protein tagging, Erzeugung von bedingten Protein Niederschlägen und Löschung von Genen genutzt. CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung erweist sich ein mächtiges Werkzeug für die Förderung der Malaria-Forschung. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9 Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in p. Falciparum. Diese Methode ist sehr anpassungsfähig an andere Arten von genetischen Manipulationen, einschließlich Protein-tagging und gen Knockouts.
Introduction
Malaria ist eine verheerende Krankheit verursacht durch Protozoen Parasiten der Gattung Plasmodium. P. Falciparum, der meisten tödlichen menschlichen Malaria-Parasiten verursacht rund 445.000 Todesfälle pro Jahr, meist bei Kindern unter dem Alter von fünf1. Plasmodium -Parasiten haben einen komplizierten Lebenszyklus mit einem Moskito Vektor und ein Wirbeltier Host. Menschen infizieren sich zunächst eine infizierte Mücke eine Blutmahlzeit nimmt. Dann der Parasit dringt in die Leber, wo es wächst, entwickelt sich und teilt für etwa eine Woche. Nach diesem Vorgang sind die Parasiten in den Blutkreislauf freigesetzt, wo sie asexuelle Reproduktion in roten Blutkörperchen (Erythrozyten) unterzogen werden. Wachstum des Parasiten innerhalb der Erythrozyten sind direkt verantwortlich für die klinischen Symptome im Zusammenhang mit Malaria-2.
Bis vor kurzem war die Herstellung von transgenen p. Falciparum ein langwieriger Prozess, an denen mehrere Runden der Droge-Auswahl, das dauerte viele Monate und hatte eine hohe Ausfallrate. Diese zeitraubende Prozedur Relieson bricht die Generierung von zufälligen DNA in der Region von Interesse und die endogene Fähigkeit des Parasiten zu Flicken sein Genom aber Homologen Reparatur3,4,5,6 . Vor kurzem hat die gruppierten regelmäßig dazwischen palindromische Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) Genom-Bearbeitung erfolgreich in p. Falciparum7,8verwendet worden. Die Einführung dieser neuen Technologie in der Malaria-Forschung hat für die Förderung von Verständnis für die Biologie dieser tödlichen Parasiten Plasmodium kritisiert. CRISPR/Cas9 ermöglicht eine spezifische Ausrichtung der Gene durch Guide RNAs (gRNAs), die Homolog zu gen von Interesse sind. Die gRNA/Cas9-Komplex erkennt das Gen durch die gRNA und Cas9 führt dann eine Doppel-Strang Pause zwingen die Einleitung von Reparaturmechanismen in den Organismus9,10. Da p. Falciparum Maschinen zur Reparatur von DNA-Brüchen durch nicht-homologe Ende Beitritt fehlt, es homologe Rekombination Mechanismen nutzt und integriert transfizierten homologe DNA-Templates um die Cas9/gRNA-induzierte reparieren Doppel-Strang Pause11,12.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Generation der bedingten Knockdown Mutanten in p. Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden. Das Protokoll veranschaulicht Verwendung der quantifizierten Ribozym, bedingt Knockdown proteingehalte der PfHsp70x (PF3D7_0831700), ein Chaperon exportiert durch p. Falciparum in Host RBCs13,14. Die quantifizierten Ribozym wird durch Behandlung mit Glucosamin (die zu Glucosamin-6-Phosphat in den Zellen umgewandelt wird) um seine zugehörige mRNA, führt zu einem Rückgang der Protein-14Spalten aktiviert. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere bedingte Knockdown Tools, z. B. Destabilisierung Domänen oder RNA aptameren4,5,15nutzen zu können. Unsere Protokolldetails sind die Generation der ein Reparatur-Plasmid, bestehend aus einem Hämagglutinin (HA) Tag und quantifizierten Ribozym Codierung Sequenz flankiert von Sequenzen, die Homolog zu PfHsp70x offenen Leserahmen (ORF) und 3'-UTR. Wir beschreiben auch die Generation der zweite Plasmid zu Laufwerk Ausdruck der gRNA. Diese zwei Plasmide, zusammen mit einem Dritten, der Ausdruck der Cas9, treibt in Erythrozyten transfiziert und verwendet, um das Genom von p. Falciparum Parasiten ändern. Schließlich beschreiben wir eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Technik, um die Integration der Tags und quantifizierten Ribozym überprüfen. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig für die Änderung oder die komplette ko von keine p. Falciparum Gene, Verbesserung unserer Fähigkeit, neue Einblicke in die Biologie des Malaria-Parasiten zu generieren.
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Protocol
Kontinuierliche Kultur von p. Falciparum erfordert den Einsatz von menschlichen Erythrozyten, und wir nahmen im Handel erworbene Einheiten des Blutes, die alle Bezeichner beraubt und anonymisiert wurden. Institutional Review Board und das Büro des Biosafety an der University of Georgia unsere Protokolle überprüft und genehmigt alle Protokolle, die in unserem Labor verwendet.
1. Wähle ein gRNA Sequenz
- Zur CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) und wählen Sie "Fasta Ziel". Fügen Sie unter "Ziel"die 200 Basenpaare von 3' Ende der offenen Leserahmen (ORF) eines Gens und 200 Basenpaaren von Anfang an das Gen 3'-UTR. Wählen Sie unter "In", "P. Falciparum" (3-7 v3. 0), und wählen Sie "CRISPR/Cas9" unter "Using". Klicken Sie auf "Ziel-Sites zu finden".
- Wählen Sie eine Sequenz gRNA aus den Optionen vorgestellt, eine Bevorzugung der effizienteste gRNA, die am nächsten an den Ort der Veränderung und das hat die wenigsten aus Ziel-Sites.
Hinweis: Mögliche gRNA Sequenzen werden identifiziert, weil sie unmittelbar vor der ein Protospacer angrenzenden Motiv (PAM) sind, die für die Rekrutierung von Cas9 DNA erforderlich ist. Die Sequenz, die in pMK-U6, der Vektor geklont wird, die gRNA Ausdruck antreibt ist die 20 Basen unmittelbar vor der PAM. Speziell für S. Pyogenes Cas9 PAM ist die Nukleotidsequenz NGG und sollte nicht in der Reihenfolge, die in pMK-U6 geklont wird aufgenommen.
Hinweis: CHOPCHOP zählt visuell gRNA Sequenzen, die besten Optionen in grün, die weniger idealen Möglichkeiten in Bernstein und die schlimmsten Optionen in rot angezeigt. CHOPCHOP gibt jede gRNA Sequenz ein Effizienz-Partitur, die berechnet wird mit den aktuellen Parametern in der Literatur gefunden und sie Vorhersagen aus Ziel-Sites, die von der gRNA erkannt werden könnte. Zwei oder drei gRNA Sequenzen müssen möglicherweise versucht, die gRNA am besten geeignet, um ein bestimmtes Gen zu finden. - Erwerben Sie die gRNA Sequenz und seine Rückseite-Ergänzung als Polyacrylamid Gelelektrophorese gereinigt Oligos. Die gRNA Sequenz verwendet, um Ziel PfHSP70x finden Sie in Abbildung 1 b.
Hinweis: Diese Oligo sollte 15 Basenpaaren, die Homolog zu dem Plasmid gRNA exprimierenden umfassen, die für die Sequenz und Ligatur-unabhängige Klonen (SLIC) in die pMK-U6 Vektor16notwendig sind.
2. Klonen gRNA Sequenz in pMK-U6
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Die pMK-U6 mit BtgZI zu verdauen.
- Digest 10 μg der pMK-U6 mit 5 μL BtgZI Enzyms (5.000 Einheiten/mL) für 3 h bei 60 ° C. Folgen des Enzym-Herstellers Protokoll für Reaktionsbedingungen.
- Fügen Sie nach der Inkubationszeit 3 h eine zusätzliche 3 μL des BtgZI mit der Reaktion auf vollständige Verdauung des Plasmids zu gewährleisten. Für weitere 3 h, noch nach den Anweisungen des Herstellers für die Sicherstellung der korrekten Reaktionsbedingungen zu verdauen.
- Verdaute pMK-U6 aus der Reaktion zu reinigen, verwenden Sie eine spaltenbasierten PCR Bereinigung Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Trennen Sie die verdaute DNA mit Hilfe einer 0,7 % Agarose-Gels und Extrahieren der 4.200-Basenpaar-Band.
-
Tempern der Oligos mit gRNA Sequenz.
- Bereiten Sie die Seite gereinigt Oligos zu einer Konzentration von 100 μM mit Nuklease-freies Wasser.
- Kombinieren Sie 10 μL jeder Oligo mit 2.2 μl 10 X Puffer 2 (siehe Tabelle der Materialien). Sicherstellen Sie, dass das gesamte Reaktionsvolumen 22,2 μL.
- Führen Sie das Programm in einem Thermocycler glühen gRNA: Schritt 1: 95 ° C, 10 min; Schritt 2: 95 ° C, 1 s, mit einem Rückgang der Temperatur von 0,6 ° C/Zyklus; Schritt 3: gehen Sie zu Schritt 2, 16 Mal; Schritt 4: 85 ° C, 1 min; Schritt 5: 85 ° C, 1 s, mit einem Rückgang der Temperatur von 0,6 ° C/Zyklus; Schritt 6: gehen Sie zu Schritt 5, 16 Mal; Schritt 7: 75 ° C, 1 min; Schritt 8: 75 ° C, 1 s, mit einem Rückgang der Temperatur von 0,6 ° C/Zyklus; Schritt 9: gehen Sie zu Schritt 8, 16 Mal. Schritte 10 bis 21: Wiederholen Sie den Vorgang in 4 – 9 Schritte verwendet, bis die Temperatur 25 ° C; Schritt 22:25 ° C, 1 min.
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Die BtgZI verdaut und Gel-gereinigte pMK-U6-Plasmid stecken Sie geglühten gRNA Oligos.
- Kombinieren Sie 100 ng der verdauten pMK-U6 mit 1 μl 10-fach Puffer 2.1 und 3 μL der geglühten gRNA Oligos. Erhöhen Sie die Lautstärke auf 9,5 μL mit Nuklease-freies Wasser.
- Fügen Sie 0,5 μL der T4-Polymerase und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 2,5 min.
- Verschieben Sie die Reaktion auf Eis und 10 min inkubieren.
- Sofort verwandeln Sie 5 μl der Reaktion in kompetente E. Coli gemäß den Anweisungen des Lieferanten Bakterien. Die Bakterien auf Agarplatten Lysogeny Brühe (LB) enthaltend 100 μg/mL Ampicillin-Platte.
- Lassen Sie die transformierten Bakterien wachsen bei 37 ° C über Nacht, dann wählen Kolonien und DNA mit einem im Handel erhältlichen Plasmid Miniprep Kit extrahieren.
3. Gestaltung von Homologie Regionen der Reparatur Vorlage
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Design Schild Mutationen innerhalb der Homologie Reparatur Vorlage zu verhindern erneutes Schneiden der DNA, die in das Genom integriert wird.
Hinweis: Eine Schild Mutation besteht in der Regel der Einführung einer Stille Mutation um PAM zu ändern, so dass Cas9 keine Pause in der Reparatur Vorlage veranlassen wird. Die PAM erforderlich für die Cas9, die in diesem Protokoll verwendeten die Nukleotidsequenz "NGG" ist, wobei "N" jedem Nukleotid ist. Wenn möglich, ändern Sie eine der Nukleotide G ein A, C oder T.- Wenn die PAM schweigend mutiert werden kann nicht, stellen Sie mindestens 2 Stille Mutationen in den 6 Basenpaaren direkt angrenzend an die PAM-7,-8 vor.
Hinweis: Diese Mutationen verhindert Anerkennung der Reparatur Vorlage durch die gRNA und nachschneiden der reparierten Locus durch die Cas9/gRNA Komplex verhindern. Die Schild-Mutationen können in der Homologie-Region eingeführt werden, durch die Verstärkung der DNS mit Primern, die die Mutation enthalten.
- Wenn die PAM schweigend mutiert werden kann nicht, stellen Sie mindestens 2 Stille Mutationen in den 6 Basenpaaren direkt angrenzend an die PAM-7,-8 vor.
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Die ORF Homologie Region für die Reparatur Vorlage zu verstärken.
- Mittels PCR, verstärken Sie 800 Basenpaare von 3' Ende das Zielgen ORF. Entwerfen Sie die Primer, die verwendet werden, um das Stopp-Codon aus diesem Amplikons auszuschließen.
- Entwerfen Sie die Primer für die Einfügung dieses Amplikons in die pHA -quantifizierten , die mit SacII und AfeI durch eine DNA-Ligatur Reaktion oder SLIC16verdaut wurde.
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Die 3'-UTR Homologie Region für die Reparatur Vorlage zu verstärken.
- Mittels PCR, verstärken Sie die 800 Basenpaare unmittelbar nach das Stopp-Codon des Zielgens. Design-Primer für die Einfügung dieses Amplikons in die pHA -quantifizierten , die mit HindIII und NheI durch eine DNA-Ligatur Reaktion oder SLIC16verdaut wurde.
Hinweis: Die hohen Inhalt von p. Falciparum Genom kann Verstärkung von Regionen wie wo erschweren. Ein alternativer Ansatz zur mittels PCR ist die Homologie Regionen synthetisieren.
- Mittels PCR, verstärken Sie die 800 Basenpaare unmittelbar nach das Stopp-Codon des Zielgens. Design-Primer für die Einfügung dieses Amplikons in die pHA -quantifizierten , die mit HindIII und NheI durch eine DNA-Ligatur Reaktion oder SLIC16verdaut wurde.
(4) Klonen Homologie Regionen in der Reparatur-Plasmid
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Die ORF-Homologie-Region in der pHA -quantifizierteneinfügen.
- Die pHA -quantifizierten mit SacII und AfeI, nach Anweisungen des Herstellers Enzym zu verdauen. Legen Sie das ORF Homologie Region PCR-Produkt in das verdaute Plasmid mit SLIC16.
- Verwandeln Sie sich in kompetente E. Coli , wie in den Schritten 2.3.4 und 2.3.5 durchgeführt.
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Legen Sie die 3'-UTR Homologie Region in ein pHA-quantifizierten Plasmid, das bereits die ORF-Homologie-Region enthält (siehe Punkt 4.1).
- Das Plasmid mit HindIII und NheI gemäß Anweisungen des Herstellers Enzym zu verdauen. Das verdaute Plasmid mit SLIC16stecken Sie 3'-UTR Homologie Region Amplikons.
- Verwandeln Sie sich in kompetente E. Coli und extrahieren Sie das Plasmid DNA (Schritte 2.3.4 und 2.3.5).
(5) Fällung der DNA zur Transfektion
- Fügen Sie 40 μg der pMK-U6, pUF1-Cas9 und pHA -quantifizierten DNA (für eine Gesamtmenge von 120 µg DNA) zu einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
- Fügen Sie 1/10 das Volumen der DNA von 3 M Natriumacetat in Wasser (pH 5,2) am Rohr und mischen Sie es gut mit einem Wirbel (z. B. wenn die Lautstärke im Schritt 5.1 100 μL war 10 μL von Natriumacetat hinzufügen).
- Das Rohr 2,5-Mal das Volumen von 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie es nun mit einem Wirbel für mindestens 30 s (z. B. wenn das Volumen in 5.1 100 μL war hinzufügen 250 μL von 100 % Ethanol).
- Legen Sie das Rohr, auf Eis oder bei-20 ° C für 30 min.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 18.300 X g für 30 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie vorsichtig den überstand aus der Tube. Stören Sie das Pellet nicht.
- Das Rohr 3-mal das Volumen von 70 % Ethanol hinzu und mischen Sie es kurz mit einem Wirbel (zB., wenn das Volumen in 5.1 100 μL war hinzufügen 300 μL 70 % Ethanol).
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 18.300 X g für 30 min bei 4 ° C.
Hinweis: Dieser Schritt sollte unter sterilen Bedingungen in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden. - Entfernen Sie vorsichtig den überstand aus der Tube. Stören Sie das Pellet nicht. Die Röhre offen lassen und das Pellet 15 min an der Luft trocknen lassen.
- Speichern Sie die ausgefällte DNA bei-20 ° C, bis es zur Transfektion benötigt wird.
6. Isolierung menschlichen Erythrozyten aus dem Vollblut in Vorbereitung zur Transfektion
- Aliquoten frisches Blut in sterilen 50 mL konische Röhrchen (ca. 25 mL pro Röhre).
- Zentrifugieren Sie Schläuche am 1.088 X g für 12 min mit Zentrifuge Bremsen auf 4 gesetzt.
- Aspirieren Sie überstand und buffy Mantel ab. Das RBC-Pellet mit einem gleichen Volumen von unvollständigen RPMI aufzuwirbeln.
Hinweis: Unvollständige RPMI ist bereit, durch die Ergänzung von RPMI 1640 mit 10.32 μM Thymidin 110,2 μM Hypoxanthin, 1 mM Natrium Pyruvat, Natriumbicarbonat 30 mM, 5 mM HEPES, 11,1 mM Glukose und 0,02 % (V/V) Gentamicin. - Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.3 zweimal. Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Erythrozyten in ein gleiches Volumen der unvollständigen RPMI und speichern die Rohre bei 4 ° C.
7. transfecting Erythrozyten mit den Plasmiden CRISPR/Cas9 (für aseptisch erfolgen)
Hinweis: P. Falciparum Kulturen werden gepflegt, wie in anderen Berichten-17beschrieben. Pflegen Sie die Kulturen bei 37 ° C unter 3 % O2, 3 % CO2und 94 % N2 , sofern nicht anders angegeben. Wenn Blut in diesem Protokoll verwendet wird, bezieht es sich auf den reinen roten Blutkörperchen in Schritt 6 erstellt. Das Blut verwendet sollte nicht älter als 6 Wochen sein, wie es in der Regel eine Abnahme der Parasit Verbreitung in älteren Blut. Die folgenden Schritte beschreiben bereits be-Erythrozyten mit DNA und den transfizierten Zellen eine Parasit Kultur hinzufügen. Andere etablierte Transfektion Protokolle sind kompatibel mit diesen Konstrukten18,19transfecting.
- Bereiten Sie einen 1 Puffer, X cytomix in Wasser (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7.6). Sterilisieren Sie Filter-den Puffer mit einen 0,22-μm-Filter.
- Fügen Sie 380 μl 1 X Cytomix an die DNA im Schritt 5 und Vortex aufzulösen ausgefällt. Ermöglichen die DNS aufzulösen in 1 X Cytomix für 10 Minuten, Vortexen alle 3 min für 10 s.
- In einem sterilen 15 mL konische Röhrchen verbinden 300 μL der Erythrozyten (50 % Hämatokrit, aus Schritt 6) in der unvollständigen RPMI mit 4 mL 1 X Cytomix.
- Zentrifugieren Sie die Erythrozyten aus Schritt 7.3 870 X g für 3 min, und entfernen Sie dann den überstand von RBC-Pellet.
- Die RBC Pellet mit der DNA/Cytomix Mischung aus Schritt 6.2 und Übermittlung an eine 0,2 cm Elektroporation Küvette aufzuwirbeln.
- Electroporate der Erythrozyten mit den folgenden Bedingungen: 0,32 kV, 925 μF Kapazität auf "High Cap" und Widerstand eingestellt auf "Unendlich" gesetzt.
- Übertragen Sie nach Elektroporation den Inhalt aus der Küvette auf eine 15 mL konisch mit 5 mL der komplette RPMI (cRPMI). Zentrifugieren Sie das Rohr auf 870 X g für 3 min bei 20 ° C, und dann abgießen Sie den überstand.
Hinweis: cRPMI ist durch die gleiche Methode wie unvollständige RPMI mit dem Zusatz von 0,25 % (w/V) lipidreichen Rinderserumalbumin vorbereitet. - Das Pellet in 4 mL des cRPMI und Übergabe an einen Brunnen in einer Gewebekultur 6-Well-Platte aufzuwirbeln. 400 μl einer hoch-Schizont Kultur hinzufügen (7 – 10 % Schizont Parasitemia ist ideal), transfizierten Erythrozyten.
Hinweis: Parasitemia ist definiert als der Prozentsatz der Parasiten infizierten Erythrozyten. - Am nächsten Tag Waschen der Kultur mit 4 mL des cRPMI. Die Kultur bei 870 X g für 3 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt. Die Kultur in 4 mL cRPMI aufzuwirbeln.
- 48 h nach Abschluss von Schritt 7.6, waschen Sie die Kultur mit 4 mL des cRPMI. Dann erneut die Kultur in cRPMI, enthält 1 μM DSM1 für das Plasmid Cas9 auswählen.
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Fahren Sie fort, die Kulturen waschen jeden Tag mit cRPMI, bis die Parasiten nicht mehr durch Blutausstrich sichtbar werden. Nach diesem Zeitpunkt ersetzen das Kulturmedium mit frischen cRPMI plus 1 μM DSM1 alle 48 h.
- Eine Blut verschmiert, pipette 150 μL der Kultur in einem 0,6 mL Zentrifugenröhrchen zu machen. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 1.700 X g für 30 s.
- Aus der Überstand abgesaugt. Verwenden Sie eine Pipette gebeizte Zellen auf einem Objektträger übertragen. Mit einem zweiten Objektträger in einem 45°-Winkel zur ersten Folie gehalten, das Tröpfchen Blut verschmiert. Färben Sie die Folie mit einem handelsüblichen Färbung Kit laut Protokoll des Herstellers.
- Zeigen Sie die Parasiten mit Hilfe einer 100 X Öl Immersion Ziel an.
- Ab 5 Tage Post-Transfektion (Schritt 7,6), entfernen Sie 2 mL der Kultur mit Erythrozyten in das Kulturmedium Nukleinsäuretablette. Zurück 2 mL frisches Medium hinzufügen (cRPMI plus 1 μM DSM1) und Blut am 2 % Hämatokrit. Fügen Sie frisches Blut auf diese Weise einmal wöchentlich bis Parasiten wieder auftauchen, wie durch dünnen Blutausstrich (Schritt 7.11) bestimmt.
Hinweis: Wenn Integration erfolgreich ist, erscheinen wieder Parasiten in der Regel in der Kultur von einem Monat nach Transfektion. - Einmal Parasiten tauchen wieder, DSM1 Medikament Druck zu entfernen. Alternativ entfernen Sie Medikament Druck nach Parasiten, geklont wurden.
8. Integration der Reparatur Vorlage Parasiten gesucht
- Wenn Parasiten wieder von dünnen Blutausstrich sichtbar sind, isolieren Sie, DNA aus der Kultur mit einem geeigneten Kit.
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Verwenden Sie PCR zur Verstärkung der modifizierten Region des Genoms zu ermitteln, ob die gezielte Locus erfolgreich geändert wurde und wenn die unveränderte Wildtyp Locus (indikativ für Wildtyp Parasiten) nachweisbar ist.
- Um Parasiten zu erkennen, die die Reparatur Vorlage integriert haben, verwenden Sie eine forward Primer, die zu Beginn des ORF, außerhalb des geklonten Homologie sitzt. Verwenden Sie eine rückwärts-Primer, die in der 3' UTR sitzt.
Hinweis: Da diese Verstärkung der Sequenzen von der HA-Tags und quantifizierten Ribozym beinhaltet, Amplifikate von integrierten Parasiten länger als in der gleichen Region in Wildtyp Parasiten verstärkt werden.
- Um Parasiten zu erkennen, die die Reparatur Vorlage integriert haben, verwenden Sie eine forward Primer, die zu Beginn des ORF, außerhalb des geklonten Homologie sitzt. Verwenden Sie eine rückwärts-Primer, die in der 3' UTR sitzt.
9. das Klonen Parasiten durch die Begrenzung Verdünnung
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Führen Sie serielle Verdünnungen der Parasit Kultur aus Schritt 7.13, eine Endkonzentration von 0,5 Parasiten/200 μL zu erreichen. Fügen Sie 200 μL der verdünnte Kultur in die Vertiefungen einer 96-Well-Zellkultur-Platte.
Hinweis: Da Parasitemia als der Anteil der infizierten Erythrozyten definiert ist und der Hämatokrit ist auch eine bestimmte Anzahl (2 %), wird die Anzahl der Parasiten pro Volumeneinheit leicht abgeleitet.- Bereiten Sie 1 mL der Kultur in cRPMI bei 5 % Parasitemia und 2 % Hämatokrit (auf diesen Parasitemia und Hämatokrit Ebenen die Kultur enthält 1 x 107 Parasiten/mL).
- Verdünnen Sie diese Kultur 1: 100 mit cRPMI. Verdünnen Sie wieder 1: 100 mit cRPMI.
- Verdünnen Sie 1: 400. Führen Sie diese Verdünnung durch Zugabe von 62,5 μl Kultur bis 25 mL cRPMI und 1 mL Blut. Diese Verdünnung ergibt die gewünschte Konzentration von 0,5 Parasiten/200 μL.
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Behalten Sie die Klonen Platte bis Parasiten in den Vertiefungen nachweisbar sind.
- Ersetzen Sie alle 48 h, das Medium in der 96-Well-Platte mit frischen Medium.
- Einmal in der Woche ab 5 Tage nach Beginn der Klonen Platte (Schritt 9.1), entfernen Sie 100 μL aus jedem Brunnen und fügen Sie zurück 100 μL frisches Medium + Blut (2 % Hämatokrit hinzu).
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Jeder Brunnen mit Parasiten zu identifizieren.
- Ort der 96-Well-Platte in einem 45°-Winkel für ca. 20 min, so dass das Blut in einem Winkel innerhalb der Platte zu begleichen.
- Ort der 96-Well-Platte auf einem Leuchttisch. Beachten Sie, dass die Brunnen mit Parasiten Medien, die gelbe Farbe enthalten, im Vergleich zu den rosa Medien von Parasiten befreien Brunnen durch Versauerung des Mediums durch den Parasiten ist.
- Bewegen Sie den Inhalt der Parasit-haltigen Brunnen mit einer serologischen Pipette an einer 24-Well-Zellkultur-Platte zum Ausbau der Parasitemia zu ermöglichen.
- Mit PCR-Analyse, wie in Schritt 8 beschrieben, überprüfen Sie diese klonalen Parasit-Linien für die korrekte Einbindung.
10. Zuschlag des Proteins durch Behandlung von Parasiten mit Glucosamin und Bestätigung per Western-Blot Analyse
- Bereiten Sie eine 0,5 M GlcN (Glucosamin) Stammlösung, die bei-20 ° c gelagert werden können
- Die quantifizierten Parasit Kulturen GlcN hinzu und es ermöglichen Sie ihnen, in Gegenwart von GlcN wachsen.
Hinweis: Die Endkonzentration und das Timing der GlcN Behandlung richtet sich auf das Experiment und Parasiten. GlcN kann Parasiten Wachstum auswirken, sodass eine Reihe von GlcN Konzentrationen zu bestimmen, ihre Sensibilität für die Verbindung die elterlichen Parasiten-Belastung ausgesetzt werden dürfen. Oft ist eine Konzentration von 2.0-7,5 mM GlcN verwendeten13,14,20. - Proteinproben vom GlcN behandelt Parasiten13zu isolieren.
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Verwenden Sie Proteinproben für western-Blot Analyse, um Kürzungen in der Protein-13zu erkennen.
- Verwenden Sie einen Anti-HA-Antikörper nach den Anweisungen des Herstellers, um HA-quantifizierten-tagged Proteins erkennen. Vergleichen Sie die HA-Band, ein Laden-Steuerelement, z. B. PfEF1α.
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Representative Results
Eine schematische Darstellung der Plasmide verwendet diese Methode als auch ein Beispiel für ein Schild-Mutation sind in Abbildung 1dargestellt. Als ein Beispiel dafür, wie mutierte Parasiten nach Transfektion identifizieren sind Ergebnisse von PCRs zur Integration desquantifizierten Konstrukts HA - Überprüfung in Abbildung 2dargestellt. Ein repräsentatives Bild einer Klonen Platte ist in Abbildung 3 dargestellt, um die Farbänderung des Mediums in Anwesenheit von Parasiten zu demonstrieren. Ergebnisse aus einem Immunfluoreszenz-Assay und westlichen befleckenden Experimente sind in Abbildung 4 dargestellt, um die Funktionalität der HA-Tag und quantifiziertenzu demonstrieren-basierten Reduzierung von Proteinen in der Parasiten. Abbildung 5 zeigt die Unfähigkeit der kurzen Homologie Arme auf PCR-Produkte zu modifizieren die Parasiten Genome und tragfähige Mutanten zu erhalten.
Abbildung 1: Übersicht über unsere drei-Plasmid Ansatz CRISPR/Cas9 und Beispiele für eine gRNA Oligo und Schild Mutation. (A) Schaltpläne der leeren pHA-quantifizierten und pMK-U6 mit Restriktionsenzym Websites zum Klonen verwendet angezeigt. Auch sind pHA-quantifizierten und pMK-U6 nach der Homologie Arme und gRNA Sequenzen haben, bzw. geklont worden. Schließlich ist pUF1-Cas9 gezeigt. yDHOD = Hefe dihydrofolat-Reduktase, dem Widerstand Markierer DSM1. (B) die vorderen Oligo verwendet für das Klonen der PfHsp70x gRNA Sequenz in pMK-U6 mit der gRNA Sequenz in Großbuchstaben und die pMK-U6 Homologie Arme notwendig für das Klonen in Kleinbuchstaben (oben) zeigt. Die genomische Ziel PfHsp70x gRNA erscheint als der nachgeschalteten PAM in rot (Mitte). Die Schild-Mutation im PfHsp70x-gRNA PAM ist rot (unten) dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische CRISPR/Cas9 Genom Modifikation mit pHA-quantifizierten und eine Strategie für die Integration Bestätigung. (A) Cas9, führte zu einer genomischen Locus durch eine gRNA induziert eine Doppelstrang-Pause in der DNA. Der Parasit repariert den Schaden durch doppelte Crossover homologe Reparatur, pHA-quantifizierten Plasmid als Vorlage verwenden und die Einführung der HA-quantifizierten-Sequenz in das Genom. (B) ein PCR-test um die korrekte Einbindung der HA-quantifizierten Sequenz zu identifizieren. Mit Primer P1 und P2 sind die 3' ORF von Wildtyp PfHsp70x und PfHsp70x -quantifizierten Mutanten verstärkte13. Der Amplifikate aus PfHsp70x-quantifizierten ist länger als Wildtyp durch Einfügung der HA-quantifizierten Sequenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Identifikation von Brunnen mit Parasiten in einer 96-Well-Platte Klonen. (A) 96-Well-Platte befindet sich in einem 45 °-Winkel für ca. 20 min um das Blut zu ermöglichen, sich in einem Winkel in der Platte. (B) enthält der Brunnen auf der linken Seite eine Parasit-Kultur, angezeigt durch die gelbe Farbe des Mediums im Vergleich zu den rosa Medium der Parasit-frei auch auf der rechten Seite. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: ein Immunfluoreszenz-Assay zeigt die korrekte HA-Kennzeichnung von PfHsp70x und Western blotting Verkleinerung der PfHsp70x Protein Niveaus während der Behandlung mit Glucosamin. (A) PfHsp70x -quantifizierten Parasiten wurden fixiert und gefärbt mit DAPI (Kern Marker) und Antikörper gegen HA und MAHRP1 (Membran verbundenen Histidin Rich Protein 1, ein Marker für Protein-Export an den Host RBC)13. (B) PfHsp70x -quantifizierten Parasiten mit 7,5 mM Glucosamin behandelt wurden, und ganze-Parasit Lysates dienten für die Western Blot-Analyse13. Die Membran wurde mit Antikörpern für HA und PfEF1α sondiert, wie eine Beladung Steuern13. Wie erwartet, führte Glucosamin Behandlung zu einer Verringerung des Proteins. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: mit kurzen Homologie Sequenzen zur Reparatur. (A) schematische Darstellung zeigt ko von GFP in B7 Parasiten21. B7 Parasiten sind eine Ableitung von 3-7 in der Plasmepsin II mit GFP markiert wurde. PCR-Produkte mit 50, 75 oder 100 Basenpaare der GFP Homologie Regionen flankieren eine Blasticidin S-Widerstand-Kassette (mit der Aufschrift "Marker"), zusammen mit pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, ein Plasmid mit dem Ausdruck Cas9 und ein GLP-gRNA wurden in B7 Parasiten transfiziert. Jede Transfektion wurde zweimal durchgeführt. DSM1 Medikament Druck war angewandte 2 Tage Post-Transfektion. (B) siehe hier sind PCR-Tests auf DNA isoliert von transfizierten Parasiten 5 Tage Post-Transfektion und 2 Monate nach Transfektion. Primer verwendet, um die Integration der BSD Widerstand Kassette testen erbringt ein 584-Basenpaar-Produkt für B7 elterliche Parasiten und ein 2020-Basenpaar Produkt für Parasiten, die den Marker integriert haben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Umsetzung der CRISPR/Cas9 in p. Falciparum hat sowohl erhöht die Effizienz und verringert den Zeitaufwand für die Änderung der Parasit Genom, im Vergleich zu bisherigen Methoden der genetischen Manipulation. Dieses umfassende Protokoll beschreibt die Schritte, die notwendig für die Erzeugung von bedingten Mutanten mit CRISPR/Cas9 in p. Falciparum. Während die Methode hier speziell für die Generation von HA -quantifizierten Mutanten ausgerichtet ist, kann diese Strategie für eine Vielzahl von Anforderungen, einschließlich der Kennzeichnung von Genen, gen-Knockouts und die Einführung von Punktmutationen angepasst werden.
Ein kritische früher Schritt in diesem Protokoll ist die Auswahl aus mehreren gRNA. Bei der Auswahl einer gRNA gibt es mehrere Punkte zu beachten wie wo sitzt die gRNA, wie effizient es ist, und unabhängig davon, ob es das Potenzial für Ziel-Auswirkungen hat. Die gRNA Sequenz sollte so nah wie möglich an den Ort der Veränderung, im Idealfall innerhalb von 200 Basenpaaren. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die Parasiten, die mit der Reparatur-Vorlage, um ihr Genom zu beheben, ohne das Tag zu integrieren. Das Tool hier verwendet, um die gRNA zu finden war eine kostenlose, Online-Dienst namens CHOPCHOP22. Ein weiteres online-Tool, Eukaryotic pathogens CRISPR RNA/DNA-Design-Tool (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/) zu führen, können auch gebrauchte23. EuPaGDT bietet zusätzliche Charakterisierung von gRNA Sequenzen, einschließlich der Vorhersage von Ziel-Hits und potenzielle Probleme, die Transkription der gRNA verhindern können. EuPaGDT hat auch Tools für die Stapelverarbeitung von gRNAs auf mehrere Gene oder ganzer Genome abzielen. Die ausgewählten gRNA sollte man am nächsten auf der Website der Änderung mit der höchsten Effizienz und minimale Ziel Hits sitzt. Eine wichtige Einschränkung der CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung, die entstehen können ist die Unfähigkeit, eine geeignete gRNA auf das Gen des Interesses zu entwerfen. In solchen Fällen ein Trial-and-Error-Vorgehen erforderlich sein, mehrere Sub-optimale gRNA Sequenzen verwenden, bis die beste Lösung gefunden wird, und erfolgreiche gen Bearbeitung stattgefunden hat.
Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Erzeugung von p. Falciparum durch Mutation entstehende Variationen mit CRISPR/Cas9 ist die Länge der Homologie Regionen in der Reparatur-Vorlage verwendet. Dieses Protokoll empfiehlt, dass die Homologie Regionen sollte ca. 800 Basenpaare pro, aber wir auch im Umgang mit kleineren Regionen Nummerierung 500 Basenpaare3erfolgreich gewesen. Erfolgreiche Genom Modifikation mit CRISPR/Cas9 und kurze Homologie Arme auf PCR-Produkte werden auch in anderen Protozoen Parasiten wie Toxoplasma Gondii und Trichomonas Vaginalis24,25. Wir testeten die Machbarkeit der Verwendung kleiner Homologie Arme auf PCR-Produkte (50, 75 oder 100 Basenpaare) durch den Versuch, Ko GFP in B7 Parasiten mit einem Blasticidin Widerstand Kassette21. Wir sahen einige Integration der Blasticidin Widerstand Kassette auf 5 Tage Post Transfektion; Diese Parasiten erholte sich jedoch nie von Transfektion. Für diese Transfektionen wählten wir für die Cas9 exprimierenden Plasmid mit DSM1. Eine andere Auswahl-Methode, z. B. Behandlung von transfizierten Kulturen mit Blasticidin S, allein oder in Kombination mit DSM1, kann die Parasiten wieder auftauchen, wenn Sie kürzere Homologie Regionen verwenden für die Reparatur der Cas9/gRNA-induzierte Pausen verbessern. In diesem Fall haben wir nicht mit Blasticidin S gewählt, da wir wollten testen, ob kurze Homologie Arme könnte in Fällen verwendet werden, wo eine Droge-Widerstand-Kassette nicht integriert wird in das Genom, z. B. Wenn ein Protein markiert ist.
Die Kernkomponenten der CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung sind diskutiert Cas9 Endonuklease, die gRNA und die Reparatur-Vorlage. Wir beschreiben einen drei-Plasmid Ansatz dieser Komponenten in die Parasiten zu bringen, wo Cas9, die gRNA und die Reparatur Vorlage in separaten Plasmide gefunden werden. Zusätzlich zu diesem Ansatz hat unser Labor gelungen mit einem zwei-Plasmid-Ansatz in der Cas9 und gRNA Ausdruck werden angetrieben durch ein einzelnes Plasmid und die Reparatur Vorlage ist in einem zweiten Plasmid3gefunden. Ähnliche zwei-Plasmid Ansätze sind auch erfolgreich von anderen Labors eingesetzt worden, um Mutanten7,8,26,27,28,29zu generieren. Darüber hinaus nutzen mehrere Labore eine Belastung von Plasmodium (NF54AttB), die CAS9 und eine T7-RNA-Polymerase Laufwerk Ausdruck gRNAs30konstitutiv ausdrückt. In diesem Fall ein einzelnes Plasmid mit dem Reparatur-Vorlage und die gRNA sind in NF54AttB Parasiten31,32transfiziert. Schließlich wurde ein Plasmid-freie Ansatz unter Verwendung eines gereinigten Cas9-gRNA Ribonucleoprotein komplexe Mutationen in das Genom, als gut33Einfügen verwendet. Der Erfolg dieser unterschiedlichen Ansätze zeigt Flexibilität der Methoden in denen Forscher in den Parasiten Cas9/gRNA Komponenten vorstellen können.
Schließlich kann die Wahl der Droge Druck anzuwenden, transfizierte Parasiten verändert werden, je nach Konstrukte verwendet. Hier zeigen wir erfolgreiche Generation von Mutanten durch vorübergehend auswählen für das Cas9 exprimierenden Plasmid mit DSM1 bis Parasiten wieder auftauchen. Um PfHsp70x ko-Parasiten zu generieren, wurde pfhsp70x mit dem menschlichen dihydrofolat-Reduktase-gen ersetzt, und Parasiten wurden dann mit WR9921013. Der kürzlich beschriebene TetR PfDOZI Knockdown System beruht auf Integration von ein Plasmid enthält ein Blasticidin S-Resistenz-Gen, so dass für die Auswahl der Parasiten mit Blasticidin S15,31.
Alles in allem CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung von p. Falciparum erweist sich ein mächtiges Werkzeug in der Malaria-Forschung, und hier das Protokoll beschreibt die Methoden zur Erzeugung von bedingten Knockdown Mutanten3,7,8 , 13 , 20 , 28. dieses Protokolls ist sehr anpassungsfähig an individuellen Forschungsinteressen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Muthugapatti Kandasamy Herzstück der University of Georgia (UGA) biomedizinischen Mikroskopie für technische Hilfe und Jose Juan Lopez-Rubio für den Austausch der pUF1-Cas9 und pL6 Plasmide. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Bögen Foundation Awards, D.W.C. und H.M.K., UGA Start Mittel caracterización, Zuschüsse aus der March of Dimes Foundation (Basil O'Connor Starter Gelehrter Forschungspreis) gegangen und US National Institutes of Health gewährt (R00AI099156 und R01AI130139), caracterización und (T32AI060546), H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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