Summary
Мы описываем метод для генерации glmS-на основе условного нокдаун мутантов в Plasmodium falciparum с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9.
Abstract
Малярия является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. Эта болезнь, которая прежде всего затрагивает людей, живущих в тропических и субтропических районах, вызванного инфекцией с Plasmodium паразитов. Разработка более эффективных лекарственных препаратов для борьбы с малярией может быть ускорен путем улучшения нашего понимания биологии этого комплекса паразита. Генетические манипуляции этих паразитов является ключом к пониманию их биологии; Однако геном P. falciparum исторически трудно манипулировать. Недавно изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 был использован в малярийных паразитов, позволяющие проще белка, пометки, поколение нокдаунов условного белка и удаления генов. Изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 оказался мощным инструментом для продвижения области исследований малярии. Здесь мы описываем ТРИФОСФАТЫ/Cas9 метод для генерации glmS-на основе условного нокдаун мутантов в P. falciparum. Этот метод является весьма адаптированы для других типов генетических манипуляций, включая пометки белка и Джин нокауты.
Introduction
Малярия является разрушительное заболевание, вызванное простейших паразитов рода Plasmodium. P. falciparum, наиболее смертоносной человека малярийного паразита, вызывает около 445 000 смертей в год, главным образом детей в возрасте до пяти1. Plasmodium паразиты имеют сложный жизненный цикл, с участием вектора комаров и позвоночных хост. Сначала люди заражаются когда зараженный комар берет крови еды. Затем паразит вторгается в печень, где он растет, развивается и делит приблизительно одну неделю. После этого процесса паразиты попадают в кровь, где они проходят бесполое репликации в красные кровяные клетки (эритроциты). Рост паразитов внутри эритроцитов непосредственно отвечают за клинические симптомы, связанные с малярией2.
До недавнего времени, производство трансгенных P. falciparum был трудоемкий процесс, с участием нескольких раундов выбора препарата, который занимает много месяцев и имел высокий коэффициент отказа. Это длительная процедура relieson генерации случайных ДНК влезает в регионе интереса и эндогенных способность паразита починить его генома хотя гомологичных ремонт3,4,5,6 . Недавно изменения генома кластерного регулярно Interspaced рецидивирующий Repeat/Cas9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) успешно использовались в P. falciparum7,,8. Введение этой новой технологии в исследований малярии играет решающую роль для углубления понимания биологии этих смертоносных Plasmodium паразитов. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 позволяет для конкретного нацеливания генов через руководство РНК (оформления), которые являются гомологичного гена интереса. Комплекс Cas9 gRNA признает гена через gRNA и Cas9 затем вводит двухручьевой перерыв, заставляя начала ремонт механизмов в организме9,10. Потому что P. falciparum не хватает техники для ремонта разрывы ДНК путем присоединения к не гомологичных конец, он использует механизмы гомологичная рекомбинация и интегрирует transfected гомологичных ДНК шаблоны для ремонта Cas9/gRNA индуцированной двухручьевой перерыв11,12.
Здесь мы представляем протокол для генерации условных нокдаун мутантов в P. falciparum с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Протокол демонстрирует использование glmS рибозима условно нокдаун белка уровни PfHsp70x (PF3D7_0831700), сопровождающий экспортируемые P. falciparum в принимающей RBCs13,14. GlmS рибозима активируется путем обращения с глюкозамином, (который преобразуется в глюкозамин-6-фосфат в клетках) для расщеплять связанные мРНК, приводит к уменьшению белков14. Этот протокол может быть легко адаптирована для использования других условных нокдаун инструменты, такие как дестабилизации доменов или РНК аптамеры4,5,15. Наши детали протокола поколения ремонта плазмида, состоящий из гемагглютинина (HA) тег и glmS рибозима кодирования последовательности параллельной последовательности, гомологичных PfHsp70x рамка чтения открытая (ORF) и 3'-УТР. Мы также описывают поколения второй плазмида диск выражение gRNA. Эти два плазмиды, вместе с третьим, что диски, проявление Cas9, transfected в эритроциты и используется для изменения генома P. falciparum паразитов. Наконец, мы описываем полимеразной цепной реакции (ПЦР)-на основе технику для проверки интеграции тег и glmS рибозима. Этот протокол является весьма гибкой для модификации или полный нокаут любой P. falciparum генов, повышение нашей способности генерировать новые идеи в биологии малярийного паразита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Непрерывное культуры P. falciparum требует использования человека эритроциты, и мы использовали коммерчески приобретенных единиц крови, которые были лишены всех идентификаторов и анонимными. Обзор наших протоколов и утверждены все протоколы, используемые в нашей лаборатории институциональных Наблюдательный Совет и управление биобезопасности в Университете Джорджии.
1. Выбор gRNA последовательности
- Перейдите к CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) и выберите «Fasta Target». Под «Целевой»вставьте 200 пар от 3' конца открытого чтение фрейма (ORF) гена и 200 пар от начала ген 3'-УТР. В разделе «В», выберите «P. falciparum» (3D 7 v3.0) и выберите «ТРИФОСФАТЫ/Cas9» в «Using». Затем нажмите кнопку «найти целевых сайтов».
- Выберите последовательность gRNA из вариантов, представленных, отдавая предпочтение наиболее эффективным gRNA, ближайший на сайт изменения и что имеет наименьшее количество сайтов пробить.
Примечание: Потенциальные gRNA последовательности определяются потому что они сразу вверх по течению прилегающих мотив Protospacer (PAM), который необходим для вербовки Cas9 ДНК. Последовательность, которая копируется в ПМК U6, вектор, что диски gRNA выражение, является 20 баз сразу вверх по течению от PAM. PAM для Cas9 S. pyogenes нуклеотидная последовательность NGG и не должны быть включены в последовательности, клонирован в ПМК U6.
Примечание: CHOPCHOP визуально занимает gRNA последовательностей, показ лучших вариантов в зеленый, менее идеальным вариантов в янтаре и худших вариантов в красном. CHOPCHOP дает каждой последовательности gRNA Оценка эффективности, которая рассчитывается, используя самые современные параметры, имеющиеся в литературе, и они предсказывают пробить сайты, которые могут быть признаны gRNA. Два или три gRNA последовательности может потребоваться быть пытались найти gRNA наиболее подходят для конкретной ген. - Покупка gRNA последовательность и ее реверс дополнения как электрофорез геля полиакриламида-очищенная oligos. GRNA последовательность, используемая для целевого PfHSP70x можно найти на рисунке 1B.
Примечание: Этот oligo должна включать 15 пар гомологичных gRNA выражая плазмиды, которые необходимы для последовательности и перевязка независимые клонирования (SLIC) в ПМК U6 вектор16.
2. клонирование gRNA последовательности в ПМК U6
-
Дайджест ПМК U6 с BtgZI.
- Дайджест 10 мкг ПМК U6 с 5 мкл BtgZI фермента (5000 единиц/мл) 3 часа при температуре 60 ° C. Следуйте фермента производителя протокол для условий реакции.
- После инкубационного периода 3 h добавьте дополнительные 3 мкл BtgZI реакции для обеспечения полного переваривания плазмиды. Дайджест за дополнительные 3 h, еще следующие инструкции производителя для обеспечения условий правильного реакции.
- Для того чтобы очистить переваривается ПМК U6 от реакции, используйте комплект очистки ПЦР, на основе столбцов, согласно инструкциям производителя.
- Отдельные переваривается ДНК с помощью геля агарозы 0,7% и извлекать группы пара 4200 base.
-
Отжиг oligos, содержащие gRNA последовательности.
- Воссоздания страницы очищенная oligos к концентрации 100 мкм с использованием воды, свободной от нуклеиназы.
- Объединить 10 мкл каждого oligo с 2.2 мкл буфера 10 x 2 (см. Таблицу материалы). Убедитесь, что общая реакция объем 22.2 мкл.
- Запустите gRNA отжига программы в Термоциклер: шаг 1: 95 ° C, 10 мин; Шаг 2: 95 ° C, 1 сек, с уменьшением температуры 0,6 ° C/цикл; Шаг 3: перейдите к шагу 2, 16 раз; Шаг 4: 85 ° C, 1 мин; Шаг 5: 85 ° C, 1 сек, с уменьшением температуры 0,6 ° C/цикла; Шаг 6: перейдите к шагу 5, 16 раз; Шаг 7: 75 ° C, 1 мин; Шаг 8: 75 ° C, 1 сек, с уменьшением температуры 0,6 ° C/цикл; Шаг 9: перейдите к шагу 8, 16 раз. Шаги 10-21: повторить процедуру, используемую в шаги 4 – 9 до тех пор, пока температура достигает 25 ° C; Шаг 22:25 ° C, 1 мин.
-
Вставьте отожженная gRNA oligos плазмида BtgZI усваивается и гель очищенная ПМК U6.
- Комбинат 100 нг переваривается ПМК U6 с 1 мкл 10 x буфер 2.1 и 3 мкл отожженная gRNA oligos. Повышайте громкость до 9,5 мкл с нуклеиназы свободной воды.
- Добавить 0,5 мкл T4 полимеразы и инкубировать реакции при комнатной температуре в течение 2,5 мин.
- Переместите реакция на лед и проинкубируйте втечение 10 мин.
- Сразу преобразование 5 мкл реакции в E. coli компетентным согласно инструкциям поставщика бактерий. Пластина бактерии на плиты агара Lysogeny бульон (LB), содержащие 100 мкг/мл ампициллина.
- Разрешить преобразованные бактерий расти при 37 ° C на ночь, а затем выберите колоний и извлечь ДНК с комплектом алкалический коммерчески доступных плазмиды.
3. Проектирование гомологии регионов ремонт шаблона
-
Дизайн щит мутации в шаблоне ремонт гомологии для предотвращения повторного резки ДНК, которая интегрирована в геноме.
Примечание: Щит мутации обычно состоит из представляя молчание мутации изменить PAM, так, что Cas9 не вызовет разрыв в шаблоне ремонт. Диспетчер PAM требуется для Cas9, используемые в настоящем Протоколе нуклеотидной последовательности «Нг», где «N» — любой нуклеотидов. Если возможно измените один из нуклеотидов G A, C, или т.- Если диспетчер PAM не мутировал молча, ввести по крайней мере 2 немого мутации в 6 пар оснований, непосредственно прилегающих к PAM,78.
Примечание: Эти мутации предотвратить признание ремонт шаблона, gRNA и предотвратить повторно резки отремонтированы локуса, Cas9 gRNA комплекс. Щит мутации могут быть введены в регионе гомологии усилительных ДНК с праймерами, которые содержат мутации.
- Если диспетчер PAM не мутировал молча, ввести по крайней мере 2 немого мутации в 6 пар оснований, непосредственно прилегающих к PAM,78.
-
Усилить ORF гомологии региона для ремонта шаблона.
- С помощью ПЦР, усиливают 800 пар от 3' конца целевого гена ORF. Дизайн грунты, которые будут использоваться для исключения из этой ампликон стоп-кодон.
- Дизайн праймеров для вставки этой ампликон в ФГА -glmS , который был переваривается с SacII и АФМП посредством реакции перешнуровки дна или ломтик16.
-
Усилить регионе гомологической 3'-UTR для ремонта шаблона.
- С помощью ПЦР, усиливают 800 пар сразу же после стоп-кодон целевого гена. Праймеры дизайн для вставки этой ампликон в ФГА -glmS , который был переваривается с HindIII и NheI посредством реакции перешнуровки дна или ломтик16.
Примечание: Высокое содержание P. falciparum генома может затруднить амплификации регионов таких необычных. Альтернативный подход к с помощью ПЦР синтезирующим гомологии регионов.
- С помощью ПЦР, усиливают 800 пар сразу же после стоп-кодон целевого гена. Праймеры дизайн для вставки этой ампликон в ФГА -glmS , который был переваривается с HindIII и NheI посредством реакции перешнуровки дна или ломтик16.
4. клонирование гомологии регионов в плазмиду ремонт
-
Вставьте ORF гомологии региона в ФГА -glmS.
- Дайджест pHA -glmS с SacII и АФМП, следуя инструкциям изготовителя фермента. Вставьте переваривается плазмида с использованием SLIC16продукт PCR региона гомологии ORF.
- Преобразуйте в сведущее Escherichia coli , выполнена в шагах 2.3.4 и 2.3.5.
-
Вставьте 3'-UTR гомологии региона в ФГА glmS плазмиды, уже содержащий ORF гомологии региона (см. шаг 4.1).
- Дайджест плазмида с HindIII и NheI согласно инструкциям производителя фермента. Ампликон региона гомологической 3'-UTR вставьте переваривается плазмида с использованием SLIC16.
- Превратить в сведущее Escherichia coli и извлечь плазмидной ДНК (шаги 2.3.4 и 2.3.5).
5. осаждения ДНК для Transfection
- Добавьте 40 мкг каждая ПМК U6, pUF1-Cas9 и pHA -glmS ДНК (для в общей сложности 120 мкг ДНК) в трубку microcentrifuge стерильные 1,5 мл.
- Добавить 1/10 объема ДНК 3 M ацетата натрия в воде (рН 5.2) на трубу и перемешать хорошо с помощью вихря (например, если объем в шаге 5.1 было 100 мкл, добавить 10 мкл ацетат натрия).
- Добавить в 2,5 раза объем 100% этанола в трубку и размешать хорошо используя вихревой для по крайней мере 30 s (например, если объем в 5.1 100 мкл, добавить 250 мкл, 100% этанола).
- Место труб на льду или в-20 ° C за 30 мин.
- Центрифуга трубку 18300 x г за 30 мин при 4 ° C.
- Осторожно удалите супернатант из трубки. Не беспокоить гранулы.
- Добавить 3 раза объем 70% этанола в трубку и перемешать кратко с помощью вихря (например., если объем в 5.1 100 мкл, добавьте 300 мкл на 70% спирте).
- Центрифуга трубку 18300 x г за 30 мин при 4 ° C.
Примечание: Этот шаг должен выполняться в стерильных условиях в биологической безопасности кабинета. - Осторожно удалите супернатант из трубки. Не беспокоить гранулы. Оставьте открытым трубки и позволяют Пелле высохнуть в течение 15 мин.
- Храните осажденный ДНК при-20 ° C до тех пор, пока это необходимо для transfection.
6. изоляция человека эритроциты из цельной крови в рамках подготовки к Transfection
- Аликвота свежей крови в стерильных 50 мл конические трубы (примерно 25 мл на трубу).
- Центрифуга трубы в 1088 x g для 12 мин, с тормозами центрифуги, равным 4.
- Аспирационная вне Баффи и супернатанта пальто. Ресуспензируйте РБК лепешка с равным объемом неполной RPMI.
Примечание: Неполные RPMI готовится путем дополнения RPMI 1640 с 10.32 тимидина мкм, 110.2 мкм гипоксантина, пируват натрия 1 мм, бикарбонат натрия 30 мм, 5 мм HEPES, 11,1 мм глюкозы и гентамицин 0,02% (v/v). - Повторите шаги 6.2-6.3 дважды. После последнего мыть Ресуспензируйте эритроцитов в равным объемом неполной RPMI и хранить трубы при 4 ° C.
7. transfecting эритроцитов с ТРИФОСФАТЫ/Cas9 плазмид (предстоит асептически)
Примечание: P. falciparum культур поддерживаются как описано в других докладах17. Поддержание всех культур при 37 ° C под 3% O2, 3% CO2и 94% N2 , если не указано иное. Всякий раз, когда кровь используется в настоящем Протоколе, он имеет в виду чисто красных кровяных клеток, подготовленный на шаге 6. Крови, используемые должны быть не старше 6 недель, как в старых крови обычно снижение распространения паразита. Следующие шаги описывают предварительной загрузки эритроцитов с ДНК и добавление паразита культуры transfected клеток. Другие протоколы, установленные трансфекции совместимы с transfecting18,эти конструкции19.
- Подготовьте 1 x cytomix буфер в воде (120 мм KCl, 0,15 мм CaCl2, 2 мм EGTA, 5 мм MgCl2, 10 мм K2HPO4, 25 мм HEPES, рН 7,6). Фильтр стерилизуйте буфер с помощью фильтра 0.22 мкм.
- Добавьте что 380 мкл cytomix 1 x ДНК осажденного в шаге 5 и вихрь распустить. Разрешить ДНК, чтобы растворить в 1 x cytomix за 10 минут, vortexing каждые 3 мин 10 s.
- В стерильные 15 мл Конические трубки, объединить 300 мкл эритроцитов (50% гематокрита, начиная с шага 6) в неполной RPMI с 4 мл 1 x cytomix.
- Центрифуга эритроцитов из шага 7.3 на 870 x g на 3 мин, а затем удалить супернатант от РБК Пелле.
- Ресуспензируйте РБК лепешка с ДНК/cytomix смесь из шага 6.2 и передачи в кювет электропорации 0,2 см.
- Electroporate эритроцитов, с использованием следующих условий: 0,32 кв, 925 μФ, емкость, равным «Высокая шапка» и сопротивление присвоено значение «Бесконечность».
- После электропорация передавать содержимое из кювета в 15 мл конические содержащие 5 мл полной RPMI (cRPMI). Центрифуга трубки на 870 x g 3 мин при 20 ° C, а затем декантируют супернатант.
Примечание: cRPMI готовится через тот же метод как неполные RPMI с добавлением 0,25% (w/v) липидов богатых бычьим сывороточным альбумином. - Ресуспензируйте гранулы в 4 мл cRPMI и передачи одной скважины в пластине 6-ну тканевые культуры. Добавить 400 мкл Шизонт высокой культуры (7-10% Шизонт паразитемии идеально) для transfected эритроцитов.
Примечание: Паразитемия определяется как процент паразит инфицированных эритроцитов. - Следующий день, мыть культуры с 4 мл cRPMI. Центрифуга культуры на 870 g x 3 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте культуры в 4 мл cRPMI.
- 48 ч после завершения шага 7.6, мыть культуры с 4 мл cRPMI. Затем Ресуспензируйте культуры в cRPMI, содержащие 1 мкм DSM1 выбрать для Cas9 плазмиды.
-
Далее, мытье культур каждый день с cRPMI до паразитов больше не видны мазок крови. После этого, заменить питательной среды с свежим cRPMI плюс 1 мкм DSM1 каждые 48 ч.
- Чтобы сделать мазок крови, Пипетка 150 мкл культуры в 0,6 мл пластиковых пробирок. Пелле клетки центрифугированием в 1700 x g 30 s.
- Аспирационная покинуть супернатант. Использование пипетки передать гранулированных клетки на стеклянное скольжение. С помощью второй слайд стекла, состоявшейся под углом 45° к первому слайду, мазок капелька крови. Пятно слайда с помощью коммерчески доступных окрашивание комплекта согласно протоколу производителя.
- Просмотр паразитов, с использованием 100 X цель погружения нефти.
- Начиная с 5 дней после трансфекции (шаг 7.6), удалите 2 мл культуры с RBCs высокомобильна в среде культуры. Добавить задней 2 мл свежих средних (cRPMI плюс 1 мкм DSM1) и крови на гематокрит 2%. Добавьте свежей крови таким образом после недели до паразитов снова, как определяется мазок тонкие крови (шаг 7.11).
Примечание: Если интеграция является успешной, паразиты обычно появляются в культуре на один месяц после transfection. - После того, как паразиты возродиться, удалите DSM1 наркотиков давление. В качестве альтернативы удалите наркотиков давления после того, как паразиты клонировали вне.
8. Проверка паразитов для интеграции ремонт шаблона
- Когда паразиты являются видимыми снова по мазку тонкие крови, изолируйте дна от культуры, с использованием соответствующего набора.
-
Использование ПЦР для того чтобы усилить регионе изменение генома для определения если целевые Локус успешно изменен и обнаружению неизмененном одичал тип локус (индикативный одичал тип паразитов).
- Для обнаружения паразитов, которые интегрировали ремонт шаблон, используйте вперед грунт, который сидит в начале ORF, за пределами региона клонированных гомологии. Используйте обратный грунт, который сидит в 3'-УТР.
Примечание: Как это усиление включает в себя последовательности HA Теги и glmS рибозима, ампликонов от комплексных паразитов будет больше, чем того же региона усиливается в одичал тип паразитов.
- Для обнаружения паразитов, которые интегрировали ремонт шаблон, используйте вперед грунт, который сидит в начале ORF, за пределами региона клонированных гомологии. Используйте обратный грунт, который сидит в 3'-УТР.
9. клонирование паразитов, ограничивая разрежения
-
Выполните серийных разведений культуры паразита из шага 7.13 для достижения конечной концентрации 0,5 паразитов/200 мкл. Добавьте 200 мкл разбавленного культуры к добрам плиты 96-луночных культуры ткани.
Примечание: Поскольку паразитемии определяется как процент инфицированных эритроцитов и гематокрита является также определенное число (2%), количество паразитов на единицу объема легко получается.- Подготовка 1 мл культуры в cRPMI на 5% паразитемии и 2% гематокрит (на этих уровнях паразитемии и гематокрита, культура содержит 1 x 10-7 паразитов/мл).
- Разбавьте 1: 100 этой культуры с cRPMI. Разбавьте снова масштаба 1: 100 с cRPMI.
- Разбавьте 1: 400. Выполните этот разрежения, добавив 62,5 мкл культуры 25 мл cRPMI и 1 мл крови. Этот разбавления приводит к желаемой концентрации 0,5 паразитов/200 мкл.
-
Поддерживать клонирования пластины до тех пор, пока паразиты обнаруживаются в скважинах.
- Каждые 48 ч, замените средний в пластину 96-луночных свежие среднего.
- Раз в неделю, начиная с 5 дней после начала пластину клонирования (шаг 9.1), удалите 100 мкл из каждой скважины и добавьте обратно 100 мкл свежие среднего + крови (2% гематокрита).
-
Выявление любых скважин, содержащие паразитов.
- Место пластину 96-луночных под углом 45° для примерно 20 мин, позволяя крови поселиться на угол в пределах пластину.
- Место пластину 96-луночных на световой короб. Обратите внимание, что Уэллс, содержащие паразитов содержат СМИ это желтого цвета, по сравнению с розовым СМИ бесплатно Паразит скважин, из-за подкисление среды паразитов.
- С помощью Серологические Пипетки, переместите содержимое паразита содержащих скважин к пластине 24-ну тканевые культуры разрешить расширение паразитемии.
- С помощью ПЦР-анализа, как описано в шаге 8, проверьте эти клоновых паразита линии для правильной интеграции.
10. нокдаун белка, рассматривая паразитов с глюкозамином и подтверждение через Западный анализ помаркой
- Приготовляют раствор запасов ГСПРП (глюкозамин) 0.5 M, который может храниться при температуре-20 ° C.
- Добавить ГСПРП в glmS паразит культур и дать им возможность расти в присутствии ГСПРП.
Примечание: Конечная концентрация и сроки лечения ГСПРП зависит от линии эксперимент и паразитов. ГСПРП может повлиять паразита роста, поэтому родительский паразита штамм должны подвергаться диапазон ГСПРП концентрации для определения ее чувствительность к комплексу. Часто концентрация 2.0-7,5 мм ГСПРП — используется13,14,20. - Изолируйте образцы протеина от ГСПРП лечение паразитов13.
-
Используйте образцы протеина для Западный анализ помаркой для выявления сокращений в белка13.
- Для определения белка HA-glmS меткой используйте антитела анти Ха согласно инструкциям производителя. Сравните HA группа управления загрузки, например PfEF1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1показаны схема плазмид, используемые в этот метод, а также пример щит мутации. В качестве примера как идентифицировать мутант паразитов после трансфекции результаты от PCRs для проверки интеграции ха -glmS конструкции показано на рисунке 2. Представитель изображение клонирования плиты это показано на рисунке 3 продемонстрировать изменение цвета среды при наличии паразитов. Результаты от assay иммунофлюоресценции и западных blotting экспериментов показано на рисунке 4 для демонстрации возможностей HA тега и glmS-на основе сокращения белков в паразитов. Рисунок 5 демонстрирует неспособность короткие гомологии оружия на продукты PCR изменять паразита геном и получить жизнеспособные мутантов.
Рисунок 1: резюме наших трех плазмида подхода к ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и примеры gRNA щит и oligo мутации. (A) схемы пустой pHA-glmS и ПМК U6 показываются с энзима ограничения сайтов, используемых для клонирования. Также показано pHA-glmS и ПМК U6 после гомологии оружия и gRNA последовательности был клонирован в них, соответственно. Наконец показана pUF1-Cas9. yDHOD = дрожжи дигидрофолатредуктаз, сопротивление маркер DSM1. (B) вперед oligo используется для клонирования PfHsp70x gRNA последовательности в ПМК U6 показано, с gRNA последовательность заглавных букв и ПМК U6 гомологии оружия необходимы для клонирования строчными буквами (вверху). Геномной целевой PfHsp70x gRNA отображается как течению PAM, в красном (посередине). Щит мутации в PfHsp70x gRNA PAM показан красным (внизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема модификации генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 с помощью pHA-glmS и стратегию для подтверждения интеграции. (A) Cas9, руководствуясь в геномной Локус gRNA вызывает разрыв двойной нити ДНК. Паразит ремонт повреждение через двойной кроссовер гомологичных ремонт, используя плазмида pHA-glmS в качестве шаблона и представляя ха glmS последовательность в геном. (B) ПЦР тест для определения правильной интеграции ха glmS последовательности. Используя праймеры P1 и P2, 3' ORF одичал типа PfHsp70x и PfHsp70x -glmS мутантов, усиленный13. Ампликон из PfHsp70x-glmS больше, чем одичал типа из-за вставки ха glmS последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: выявление скважин, содержащих паразитов в 96-луночных клонирования пластине. (A) 96-луночных пластина расположен под углом 45 ° для примерно 20 минут позволить крови поселиться на угол в пластине. (B) колодец в левой части содержит культуры паразита, обозначается желтый цвет среды по сравнению с розовый среднего паразита-Free хорошо на право. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: assay иммунофлюоресценции показывает правильный ха тегов PfHsp70x и Западный blotting показывает снижение уровня белка PfHsp70x во время лечения с глюкозамином. (A) PfHsp70x -glmS паразитов были исправлены и витражи с DAPI (ядро маркера) и антитела к HA и MAHRP1 (мембраны связанные гистидина богатые белок 1, маркер белка экспорта принимающей РБК)13. (B) PfHsp70x -glmS паразитов относились с глюкозамином 7,5 мм, и целом паразит лизатов были использованы для западных blotting анализа13. Мембрана был исследован с антителами HA и PfEF1α как погрузка управления13. Как и ожидалось, глюкозамин лечения привело к снижению белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: использование коротких гомологию последовательностей для ремонта. (A) схематически показаны Нокаут гена GFP в B7 паразитов21. B7 паразиты являются производной 3D 7, в котором с GFP меткой Plasmepsin II. Продукты PCR, содержащих 50, 75 или 100 пар GFP гомологии регионов фланговые кассету сопротивления blasticidin S (с пометкой «маркер»), наряду с pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, плазмиды, выражая Cas9 и GFP gRNA, были transfected в B7 паразитов. Каждый transfection была проведена дважды. Давление DSM1 наркотиков был прикладной 2 дня после transfection. (B) показанный здесь являются ПЦР тесты на ДНК, изолированный от transfected паразитов 5 дней после transfection и 2 месяца после transfection. Грунты, используется для проверки интеграции кассеты сопротивления BSD даст пары 584 продукт для родителей паразитов B7 и 2020-пары продукта для паразитов, которые интегрировали маркера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Осуществление ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в P. falciparum как повысить эффективность работы и уменьшилось количество времени, необходимое для изменения генома паразита, по сравнению с предыдущим методами генетической манипуляции. Этот всеобъемлющий протокол описаны шаги, необходимые для генерации условных мутантов, используя ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в P. falciparum. Хотя метод здесь направлена специально для поколения ха -glmS мутантов, эта стратегия может быть адаптирована для различных нужд, включая пометки генов, Джин нокауты и введение точечные мутации.
Критические первый шаг в этот протокол является выбор gRNA последовательности. При выборе gRNA, есть несколько моментов, чтобы рассмотреть как где сидит gRNA, насколько она эффективна и ли или не она имеет потенциал для пробить эффектов. GRNA последовательность должна быть как можно ближе к месту модификации, в идеале в течение 200 пар оснований. Это снижает вероятность паразитов, используя шаблон ремонт исправить их геном без интеграции в тег. Инструмент, используемый здесь, чтобы найти gRNA был бесплатно, онлайн сервис под названием CHOPCHOP22. Другой онлайн инструмент, эукариотический патогенный ТРИФОСФАТЫ руководство РНК/ДНК дизайн инструмента (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/), также может быть использоваться23. EuPaGDT предоставляет дополнительные характеристики gRNA последовательностей, включая прогнозирование пробить хитов и потенциальные проблемы, которые могут помешать транскрипции gRNA. EuPaGDT также имеет инструменты для пакетной обработки оформления для нескольких генов или весь геном. Выбранный gRNA должен быть один, который сидит ближе на сайт модификации с наивысшей эффективности и минимальным пробить хитов. Важное ограничение ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования, которые могут возникнуть является неспособность разработать подходящую gRNA целевой гена интереса. В таких случаях может потребоваться метод проб и ошибок, используя несколько субоптимальных gRNA последовательности, пока не будет найден лучший вариант, и редактирования успешно гена произошла.
Еще одним важным фактором для рассмотрения при генерации P. falciparum мутантов с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 — длина гомологии регионов, используемые в шаблоне ремонт. Этот протокол рекомендует что гомологии регионов должна быть примерно 800 пар оснований каждого, но мы также добились успеха в использовании небольших регионов, нумерация 500 пар3. Успешное генома модификации с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и короткие гомологии оружия на продукты PCR также были использованы в других простейших паразитов, таких как Toxoplasma gondii и Trichomonas vaginalis24,-25. Мы протестировали целесообразность использования меньших гомологии оружия на продукты PCR (50, 75 или 100 пар оснований), пытаясь Нокаут гена GFP в паразитов B7, с помощью blasticidin сопротивление кассеты21. Мы видели некоторые интеграции blasticidin сопротивление кассеты на 5 дней поста трансфекции; Однако эти паразиты никогда не оправился от transfection. Для этих transfections мы выбрали для Cas9-выражая плазмида с помощью DSM1. Выбор метода, например лечение transfected культур с blasticidin S, отдельно или в сочетании с DSM1, может повысить шансы паразитов, появляясь при использовании короче гомологии регионов для ремонта Cas9/gRNA индуцированной перерывы. В этом случае мы не сделали выбрать с blasticidin S, поскольку мы хотели, чтобы проверить если короткие гомологии оружие может использоваться в случаях, где сопротивление кассету наркотиков не учитываются генома, например, когда белок является меткой.
Основные компоненты ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования обсуждаются Cas9 эндонуклеазы, gRNA и ремонт шаблон. Мы опишем три плазмида подход ввести эти компоненты в паразитов, где Cas9, gRNA и ремонт шаблон находятся в отдельном плазмид. В дополнение к такой подход Наша лаборатория успешно в использовании двух плазмида подход, в котором Cas9 и gRNA выражение управляются одной плазмиды и ремонт шаблон находится в второй плазмида3. Аналогичные подходы двух плазмиды также успешно применялись в других лабораториях для создания мутантов7,8,26,27,,2829. Кроме того несколько лабораторий используют штамм плазмодий (NF54attB), который конститутивно выражает Cas9 и T7 РНК-полимеразы диск выражение оформления30. В этом случае один плазмида, содержащий шаблон ремонт и gRNA являются transfected в NF54attB паразитов31,32. Наконец плазмида свободный подход, используя очищенный Cas9-gRNA рибонуклеопротеида комплекс был использован для вставки мутации в геноме, как хорошо33. Успех этих различных подходов демонстрирует гибкость методов, в которых исследователи могут привнести паразита Cas9/gRNA компонентов.
Наконец выбор наркотиков давления для применения к transfected паразитов может изменяться, в зависимости от конструкции, используемые. Здесь мы покажем успешных поколения мутантов, выбрав временно для Cas9-выражая плазмида с помощью DSM1, до тех пор, пока снова паразитов. Для создания PfHsp70x нокаут паразитов, pfhsp70x был заменен с геном человека дигидрофолат редуктаза, и паразитов, затем были отобраны с использованием WR9921013. Недавно описан тетр-PfDOZI нокдаун система основывается на интеграции плазмида, содержащие ген сопротивления blasticidin S, позволяя для отбора паразитов, используя blasticidin S15,31.
В целом ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирование P. falciparum оказался мощным инструментом исследований малярии, и протокол здесь подробно методы для генерации условных нокдаун мутантов3,,78 , 13 , 20 , 28. Этот протокол является очень подстраивается под индивидуальные исследовательские интересы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Muthugapatti Кандасами сердцевиной биомедицинских микроскопии университета Джорджии (UGA) для оказания технической помощи и Хуан Хосе Лопес-Рубио для совместного pUF1-Cas9 и pL6 плазмид. Эта работа была поддержана дуги Фонд награды для D.W.C. и H.M.K., предоставляет средства запуска UGA в.м., гранты от марта Dimes фонда (Basil о ' Коннор стартера ученый исследования Award) в.м., и нас национальных институтов здравоохранения (R00AI099156 и R01AI130139) к в.м. и (T32AI060546) для H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
