Summary
우리 glmS생성 하는 방법에 설명- 변형 체 falciparum 게놈 편집 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 최저의 돌연변이 체를 기반으로.
Abstract
말라리아 병 적 상태와 사망률 전세계의 중요 한 원인입니다. 주로 열 대와 아열대 지역에 그 생활에 영향을 미치는,이 질병은 변형 체 기생충 감염에 의해 발생 합니다. 전투 말라리아에 더 효과적인 약물의 개발이 복잡 한 기생충의 생물학의 우리의 이해를 개선 하 여 가속 될 수 있다. 이 기생충의 유전자 조작; 그들의 생물학을 이해 하는 열쇠 이다 그러나, 역사적으로의 P. falciparum 게놈이 되었습니다 조작 하기 어려운. 최근, CRISPR/Cas9 게놈 편집 태그, 조건부 단백질 knockdowns의 생성 및 유전자의 삭제 쉽게 단백질에 대 한 허용 하는 말라리아 기생충에 이용 되어 있다. CRISPR/Cas9 게놈 편집 말라리아 연구의 분야를 발전을 위한 강력한 도구가 될 입증 되었습니다. 여기, 우리가 glmS생성 하는 CRISPR/Cas9 방법 설명- P. falciparum에 조건부 최저의 돌연변이 기반으로. 이 메서드는 매우 다른 종류의 유전자 조작, 단백질 태그를 포함 하 여 및 유전자 녹아웃에 적응할 수 있습니다.
Introduction
말라리아 속 변형 체의 protozoan 기생충에 의해 발생 하는 치명적인 질병 이다. P. falciparum, 대부분 치명적인 인간 말라리아 기생충 51세 미만의 아이 들에서 주로 년 당 약 445,000 사망자를 발생합니다. 변형 체 기생충 모기 벡터와 척추와 관련 된 복잡 한 라이프 사이클 있다. 인간은 먼저 감염 된 모기는 혈액 식사 때 감염 될. 그런 다음, 기생충 어디 그것은 성장, 발전 하 고 분할 약 1 주일 간 침공. 이 과정 후, 기생충은 어디 그들이 받을 성적 복제 적혈구 (Rbc)에 혈 류로 발표 됩니다. Rbc 내 기생충의 성장을 직접 말라리아2와 관련 된 임상 증상에 대 한 책임이 있습니다.
최근까지, 유전자 변형 P. falciparum 에의 생산 힘 드는 과정, 몇 달 동안을 했다 하 고 높은 고장율을 했다 약물 선택의 여러 라운드를 포함 했다. 이 시간이 걸리는 절차 relieson 무작위 DNA의 세대 나누기 관심 영역에 비록 그것의 게놈을 고쳐야 하는 기생충의 내 생 능력 동종 수리3,,45,6 . 최근, 클러스터 정기적으로 Interspaced 구조 반복/Cas9 (CRISPR/Cas9) 게놈 편집은 성공적으로 이용 되어 P. falciparum7,8. 말라리아 연구에서이 새로운 기술의 도입이 치명적인 변형 체 기생충의 생물학의 이해를 발전에 대 한 중요 한 되었습니다. CRISPR/Cas9 가이드 동종 관심사의 유전자는 RNAs (gRNAs)을 통해 유전자의 특정 대상에 대 한 수 있습니다. GRNA/Cas9 복잡 한 gRNA를 통해 유전자 인식 하 고 Cas9 다음 유기 체9,10수리 메커니즘의 개시를 강제로 이중 가닥 브레이크 소개. P. falciparum 복구 비 동종 끝에 합류를 통해 DNA 나누기 기계 부족, 때문에 그것은 동종 재결합 메커니즘을 활용 하 고 Cas9/gRNA-유도 복구 동종 transfected DNA 템플릿을 통합합니다 두 배 물가 틈11,12.
여기, 선물이 프로토콜 P. falciparum 에 조건부 최저의 돌연변이의 발생을 위한 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용 하 여. 프로토콜에는 PfHsp70x의 조건에 따라 최저 단백질 수준 glmS ribozyme의 사용 방법을 보여 줍니다 (PF3D7_0831700)는 보호자 여 내보낸 P. falciparum 호스트에 Rbc13,14. GlmS ribozyme 다니엘의 관련된 mRNA, 단백질14에 있는 감소에 지도를 (어떤 셀에 글루코사민-6-인산으로 변환 됩니다) 글루코사민 치료 활성화 됩니다. 이 프로토콜 불안 도메인 또는 RNA aptamers4,,515등 다른 조건부 최저의 도구 활용을 쉽게 적응 될 수 있다. 우리의 프로토콜 내용을 조류 (HA) 태그와 glmS ribozyme 코딩 시퀀스 시퀀스에 의해 형벌의 구성 된 수리 플라스 미드의 세대는 동종 PfHsp70x 열려있는 독서 프레임 (ORF)와 3'-UTR에 있습니다. 우리는 또한 드라이브 식는 gRNA의 두 번째 플라스 미드의 생성을 설명합니다. 드라이브 Cas9의 표현 제 3 함께 이러한 두 개의 플라스 미드는 Rbc로 페 고 P. falciparum 기생충의 게놈을 수정 하는 데 사용. 마지막으로, 우리는 연쇄 반응 (PCR) 기술-태그와 glmS ribozyme의 통합을 확인 하는 기술을 기반으로. 이 프로토콜은 수정 이나 말라리아 기생충의 생물학에 새로운 통찰력을 생성 하는 우리의 기능을 강화, 어떤 P. falciparum 유전자의 완전 한 녹아웃에 대 한 높은 적응력입니다.
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Protocol
P. falciparum 에의 지속적인 문화 인간의 RBCs의 사용을 요구 하 고 우리 모든 식별자의 박탈 되었고 익명 혈액의 상업적으로 구입한 단위를 활용. 제도적 검토 보드와 조지아 대학에서 Biosafety 사무실 우리의 프로토콜을 검토 하 고 우리가 실험실에서 사용 되는 모든 프로토콜을 승인 했다.
1. gRNA 시퀀스 선택
- CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/)에 고 ' Fasta 대상 '을 선택 합니다. '대상', 열려있는 독서 프레임 (ORF) 유전자의 3' 끝에서 200 기본적인 쌍 그리고 유전자의 3'-UTR의 시작에서 200 자료 쌍을 붙여 넣습니다. 아래 '에서', 'P. falciparum' 선택 (3D 7 v3.0), ' CRISPR/Cas9 ' 에서 '사용'을 선택 하 고. 다음, ' 찾을 대상 사이트 '를 클릭 합니다.
- 가장 효율적인 gRNA 수정의 사이트에 가장 가까이 있고 가장 적은에서 대상 사이트에 특혜를 주는 제시, 옵션에서 gRNA 시퀀스를 선택 합니다.
참고: 때문에 그들은 즉시 업스트림의 Protospacer 인접 한 모티브 (PAM),이 DNA에 Cas9의 채용에 필요한 잠재적인 gRNA 시퀀스 식별 됩니다. PMK-U6, 벡터는 gRNA 식으로 복제 되는 순서는 20 기지 PAM의 즉시 업스트림. S. pyogenes Cas9에 대 한 특정 팸 뉴클레오티드 순서 NGG 이며 pMK U6로 복제 시퀀스에 포함 되 면 안.
참고: CHOPCHOP 시각적으로 순위 gRNA 시퀀스, 앰버, 덜 이상적인 옵션 녹색과 빨간색으로 최악의 옵션에서 최고의 옵션을 표시 합니다. CHOPCHOP 각 gRNA 시퀀스는 문학에서 가장 최신 매개 변수를 사용 하 여 계산 하는 효율성 점수를 그리고 그들은 예측 대상 오프 사이트는 gRNA에 의해 인식 될 수 있는. 2 개 또는 3 개의 gRNA 시퀀스는 특정 유전자에 적합 한 최고의 gRNA를 찾으려고 시도 할 수 있습니다. - GRNA 시퀀스 및 그것의 반전 보수 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 정화 oligos로 구입. 대상 PfHSP70x 사용 하는 gRNA 순서는 그림 1B에서 찾을 수 있습니다.
참고:이 올리고 15 기본 쌍 gRNA 표현 플라스 미드를 동종 시퀀스 및 결 찰 독립적인 pMK U6 벡터16으로 (SLIC) 복제에 필요한을 포함 해야 합니다.
2. 복제 시퀀스 pMK U6 gRNA
-
BtgZI와 pMK U6 다이제스트.
- 60 ° c.에 3 h BtgZI 효소 (5, 000 단위/mL)의 5 μ와 pMK U6의 다이제스트 10 μ g 반응 조건에 대 한 효소 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
- 3 h 잠복기 후 플라스 미드의 완전 한 소화를 위해 반응에 BtgZI의 추가 3 μ를 추가 합니다. 아직도 정확한 반응 조건 보장에 대 한 제조업체의 지침에 따라 추가 3 h에 대 한 다이제스트.
- 반응에서 소화 pMK U6 정화 열 기반 PCR 정리 키트 제조업체의 지침에 따라 사용 합니다.
- 0.7 %agarose 젤을 사용 하 여 소화 DNA를 분리 하 고 추출 4200 기반 쌍 밴드.
-
GRNA 시퀀스가 포함 된 oligos anneal
- Nuclease 무료 물을 사용 하 여 100 μ M의 농도에 페이지 정화 oligos reconstitute
- 10 x 버퍼 2 ( 재료의 표참조)의 2.2 μ와 각 oligo의 10 μ를 결합 합니다. 총 반응 볼륨 22.2 μ 인지 확인 합니다.
- 어 닐 링 한 thermocycler 프로그램 gRNA를 실행: 단계 1: 95 ° C, 10 분; 단계 2: 95 ° C, 1 0.6의 온도 있는 감소와 함께 s ° C/사이클; 3 단계: 2 단계 16 번; 이동 단계 4: 85 ° C, 1 분; 단계 5: 85 ° C, 1 s, 0.6 ° C/주기;의 온도 있는 감소와 함께 6 단계: 16 번; 5, 단계로 이동 단계 7: 75 ° C, 1 분; 8: 75 ° C, 1 단계 0.6의 온도 있는 감소와 함께 s ° C/사이클; 9 단계: 16 번, 8 단계로 이동. 단계 10-21: 4-9 단계에서 사용 하는 온도 25 ° C에 도달할 때까지 절차를 반복 단계 22시 25분 ° C, 1 분.
-
BtgZI 소화 하 고 젤 정화 pMK U6 플라스 미드에 단련된 gRNA oligos를 삽입 합니다.
- 단련된 gRNA oligos의 버퍼 2.1 및 3 μ x 10의 1 μ와 소화 pMK U6의 결합 100 ng. Nuclease 무료 물 9.5 μ를 볼륨을 증가.
- T4 중 합 효소의 0.5 μ를 추가 하 고 품 어 2.5 분 동안 실내 온도에 반응.
- 얼음을 10 분 동안 품 어 반응을 이동 합니다.
- 즉시 5 μ로 유능한 대장균 박테리아 공급 업체의 지침에 따라 반응의 변환. Lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지 100 μ g/mL 암 피 실린 포함에 박테리아 접시
- 37 ° C에서 하룻밤, 그 후에 식민지를 선택 성장과 상용 플라스 미드 miniprep 키트와 함께 DNA를 추출 변환된 박테리아 허용.
3. 상 동 지역 복구 서식 파일의 디자인
-
다시는 게놈으로 통합 된 DNA의 절단을 방지 하기 위해 상 동 수리 템플릿에서 디자인 방패 돌연변이.
참고: 방패 돌연변이 일반적으로 이루어져 있다 Cas9 복구 서식 파일에서 휴식을 유도 하지 것입니다 있도록 PAM을 변경할 침묵 돌연변이 소개. PAM이이 프로토콜에서 사용 하는 Cas9 "NGG", 여기서 "N"은 어떤 뉴클레오티드 염기 순서에 대 한 필요 합니다. 만약에 가능 하다 면, 변경 중 G 뉴클레오티드는 A, C, 또는 T- PAM는 자동으로 변경 될 수 없습니다, 경우 직접 인접 하는 PAM7,86 기본적인 쌍에 2 침묵 돌연변이 소개 합니다.
참고: 이러한 돌연변이 gRNA에 의해 수리 템플릿 인정을 방지 하 고 다시 절단 Cas9/gRNA에 의해 복구 된 로커 스의 복잡 한 방지 됩니다. 방패 돌연변이 돌연변이 포함 하는 뇌관으로 DNA를 증폭 하 여 상 동 지역에 도입 될 수 있습니다.
- PAM는 자동으로 변경 될 수 없습니다, 경우 직접 인접 하는 PAM7,86 기본적인 쌍에 2 침묵 돌연변이 소개 합니다.
-
복구 서식 파일에 대 한 ORF 상 동 영역을 증폭.
- PCR를 사용 하 여 대상 유전자의 ORF의 3' 끝에서 800 기본 쌍 증폭. 디자인 뇌관이이 amplicon에서 정지 codon를 제외 하는 데 사용 됩니다.
- 에는 pHA-glmS DNA 결 찰 반응 또는 SLIC16SacII와 AfeI 소화 되어이 amplicon의 삽입을 위한 뇌관 디자인.
-
3'-UTR homology 지역 복구 서식 파일에 대 한 증폭.
- PCR를 사용 하 여 대상 유전자의 정지 codon 직후 800 기본 쌍 증폭. 프라이 머는 pHA-glmS DNA 결 찰 반응 또는 SLIC16HindIII와 NheI 소화 된로이 amplicon의 삽입에 대 한 디자인.
참고: P. falciparum 게놈의 내용에서 높은 증폭 Utr 등 지역의 어려운 만들 수 있습니다. PCR를 사용 하 여 다른 접근 방법 상 동 지역 합성 이다.
- PCR를 사용 하 여 대상 유전자의 정지 codon 직후 800 기본 쌍 증폭. 프라이 머는 pHA-glmS DNA 결 찰 반응 또는 SLIC16HindIII와 NheI 소화 된로이 amplicon의 삽입에 대 한 디자인.
4. 수리 플라스 미드로 상 동 영역 복제
-
PHA-glmS에 ORF 상 동 영역을 삽입 합니다.
- 효소 제조 업체의 지침에 따라는 pHA-glmS SacII와 AfeI, 소화. SLIC16를 사용 하 여 소화 플라스 미드에 ORF homology 지역 PCR 제품을 삽입 합니다.
- 2.3.4, 2.3.5 단계에서 유능한 대장균 에 변환.
-
3'-UTR homology 지역 ORF 상 동 지역에 이미 있는 pHA glmS 플라스 미드에 삽입 (단계 4.1 참조).
- 효소 제조 업체의 지침에 따라 HindIII와 NheI 플라스 미드를 소화. 3'-UTR homology 지역 amplicon SLIC16를 사용 하 여 소화 플라스 미드에 삽입 합니다.
- 유능한 대장균 으로 변환 하 고 플라스 미드 DNA (2.3.4 단계와 단계 2.3.5) 추출.
5. 계기 DNA Transfection에 대 한
- 추가 40 μ g 각 pMK U6, pUF1-Cas9, 그리고 pHAglmS DNA (DNA의 120 μ g의 총)에 대 한 살 균 1.5 mL microcentrifuge 관에의 합니다.
- 1/10을 추가 물 (pH 5.2) 튜브에 3m 나트륨 아세테이트의 DNA의 소용돌이 사용 하 여 잘 섞는다 (예를 들어, 단계 5.1에서에서 볼륨은 100 μ, 추가 나트륨 아세테이트의 10 μ).
- 튜브를 2.5 배 100% 에탄올의 볼륨을 추가 하 고 적어도 30에 대 한 소용돌이 사용 하 여 잘 섞어 s (예: 5.1에서 볼륨은 100 μ, 추가 100% 에탄올의 250 μ).
- 얼음에 또는 30 분 동안-20 ° C에서 튜브를 놓습니다.
- 18,300 x g 4 ° c.에 30 분 동안에 관을 원심
- 튜브에서는 상쾌한을 조심 스럽게 제거. 펠 릿을 방해 하지 마십시오.
- 튜브를 3 번 70% 에탄올의 볼륨을 추가 하 고 간단히 소용돌이 사용 하 여 그것을 혼합 (예. 5.1에서 볼륨 100 μ, 있었다면, 70% 에탄올의 300 μ 추가).
- 18,300 x g 4 ° c.에 30 분 동안에 관을 원심
참고:이 단계는 생물 안전 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다. - 튜브에서는 상쾌한을 조심 스럽게 제거. 펠 릿을 방해 하지 마십시오. 튜브를 열어두고 고 15 분 동안 건조를 펠 릿.
- Transfection를 위해 필요한 때까지-20 ° C에서 침전 된 DNA를 저장 합니다.
6. 인간의 Rbc Transfection에 대 한 준비의 전체 혈액에서 분리
- Aliquot 살 균 50 mL 원뿔 튜브 (튜브 당 약 25 mL) 신선한 혈액.
- 4로 설정 하는 원심 브레이크와 함께 1,088 x g 12 분에 튜브를 원심.
- 표면에 뜨는 버 피 코트에서 발음. 불완전 한 RPMI의 동등한 양으로 RBC 펠 릿 resuspend
참고: 불완전 한 RPMI 10.32 μ M 티 미 딘와 110.2 μ M hypoxanthine, 1mm 나트륨 pyruvate, 30 mM 나트륨 중 탄산염, 5 mM HEPES, 포도 당 11.1 m m, 0.02% (v/v) gentamicin RPMI 1640을 보완 하 여 준비 된다. - 6.2-6.3 단계를 두 번 반복 합니다. 마지막 세척 후 불완전 RPMI의 동일 볼륨에 있는 Rbc를 resuspend 및 4 ° c.에 튜브를 저장
7. CRISPR/Cas9 플라스 미드와 transfecting Rbc (해야 할 Aseptically)
참고: P. falciparum 문화는 다른 보고서17에 설명 된 대로 유지 됩니다. 달리 명시 하지 않는 한 3% O2, 3%의 CO2및 94% N2 에서 37 ° C에서 모든 문화를 유지 합니다. 혈액이 프로토콜에서을 사용할 때마다 순수한 적혈구 단계 6에서에서 준비 참조입니다. 일반적으로 오래 된 혈액에서 기생충 확산 감소는 혈액 사용 6 주 이상 수 없습니다. 다음 단계는 DNA와 transfected 세포에 기생 문화를 추가 사전 로드 Rbc를 설명 합니다. 다른 설립된 transfection 프로토콜 이러한 구문을18,19transfecting와 호환 됩니다.
- 준비 물 (120 m m KCl, 0.15 m m CaCl2, 2mm EGTA, 5 m MgCl2, 10 m m K2HPO4, 25mm HEPES, pH 7.6 m)에 1 x cytomix 버퍼. 필터-0.22 μ m 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독.
- DNA에 1 x cytomix의 380 μ 침전 단계에서 5, 그리고 해산 하는 소용돌이 추가 합니다. 1 x cytomix에서 10 분, vortexing 10 매 3 분에 대 한 해산 DNA 수 s.
- 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 결합 RBCs의 300 μ (50% 보통, 단계 6에서에서) 1 개의 x cytomix의 4 mL와 불완전 RPMI에.
- 3 분, 870 x g 에서 7.3 단계에서 Rbc 원심 고는 상쾌한 RBC 펠 릿에서 제거.
- 6.2 단계에서 DNA/cytomix 혼합과 펠 릿 RBC 및 0.2 cm electroporation 베트에 resuspend.
- Electroporate 다음 조건을 사용 하 여 Rbc: 0.32 kV, 925 µ F, "높은 모자", 그리고 저항을 설정 "무한"로 설정.
- Electroporation, 다음 완전 한 RPMI (cRPMI)의 15 mL 원뿔 포함 5 mL에는 베트에서 내용을 전송. 870 x g 20 ° C에서 3 분에 튜브 원심 고는 상쾌한을 가만히 따르다.
참고: cRPMI는 0.25% (w/v) 지질이 풍부한 소 혈 청 알 부 민 추가 불완전 RPMI로 동일한 방법을 통해 준비 하 고 있습니다. - CRPMI 및 6 잘 조직 문화 접시에 하나 잘 전송 4 mL에 펠 릿을 resuspend. 높은 schizont 문화의 400 μ 추가 (7-10% schizont parasitemia 이상적 이다) transfected RBCs를.
참고: Parasitemia 기생충에 감염 된 RBCs의 백분율로 정의 됩니다. - 다음 날, cRPMI의 4 mL와 함께 문화를 씻어. 원심 870 x g 3 분에 문화 하 고는 상쾌한 발음. CRPMI의 4 mL에 문화를 resuspend.
- 7.6, 단계를 완료 한 후 48 h cRPMI의 4 mL와 함께 문화를 씻어. 다음 문화 1 μ M를 포함 하는 cRPMI에서 resuspend DSM1 Cas9 플라스 미드에 대 한 선택.
-
세탁 문화 cRPMI와 함께 매일 기생충은 더 이상 혈액 얼룩으로 표시 될 때까지 계속 합니다. 이 시점 이후 바꿉니다 문화 매체 신선한 cRPMI 플러스 1 μ M DSM1 모든 48 h.
- 혈액 얼룩, 0.6 mL 원심 분리기 관으로 문화의 150 μ를 플라스틱을 확인 하십시오. 1700 x g 30에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 s.
- 상쾌한에서 발음. 수송과 세포를 유리 슬라이드에 전송 하는 피 펫을 사용 합니다. 첫 번째 슬라이드에 45 ° 각도에서 열린 두 번째 유리 슬라이드를 사용 하 여, 혈액 방울 얼룩. 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 얼룩 키트를 사용 하 여 슬라이드를 얼룩.
- 기름 침수 목표 X 100을 사용 하 여 기생충을 볼.
- 5 일 후 transfection (7.6 단계) Rbc 문화 매체에서 resuspended와 문화의 2 개 mL를 제거 합니다. 다시 2 mL 신선한 매체 추가 (cRPMI 1 μ M 플러스 DSM1)과 2%가 혈액. 추가 신선한 혈액이 방식에서까지 주 기생충 다시 한 번 얇은 혈액 얼룩 (스텝 7.11)에 의해 결정으로.
참고: 통합에 성공할 경우 기생충 일반적으로 다시 문화에 한 달 후 transfection에 의해. - 기생충 reemerge DSM1 마약 압력 제거. 기생충으로 복제 된 후에 또는 마약 압력을 제거 합니다.
8. 복구 서식 파일의 통합에 대 한 기생충 검사
- 기생충 얇은 혈액 얼룩에 의해 다시 표시 될 때, 적절 한 키트를 사용 하 여 문화에서 DNA를 분리.
-
PCR를 사용 하 여 대상된 로커 스 성공적으로 변경 되었습니다 및 수정 되지 않은 야생-타입 로커 스 (야생 형 기생충의 지표)는 감지 하는 경우 결정 하는 게놈의 수정 된 영역을 증폭.
- 복구 템플릿 통합 기생충 검출, ORF, 복제 된 상 동 지역 외부의 시작 부분에 위치 하 고 앞으로 뇌관을 사용 합니다. 3'-UTR에 앉아 역방향 뇌관을 사용 합니다.
참고:이 증폭 하 태그와 glmS ribozyme의 시퀀스를 포함, 통합된 기생충에서 amplicons 될 것입니다 야생 형 기생충에 증폭 같은 지역 보다.
- 복구 템플릿 통합 기생충 검출, ORF, 복제 된 상 동 지역 외부의 시작 부분에 위치 하 고 앞으로 뇌관을 사용 합니다. 3'-UTR에 앉아 역방향 뇌관을 사용 합니다.
9. 희석을 제한 하 여 기생충 복제
-
기생충 문화의 직렬 희석 단계의 7.13 0.5 기생충/200 μ의 최종 농도 달성 하기 위해 수행 합니다. 96-잘 조직 배양 접시의 우물에 희석 문화의 200 μ를 추가 합니다.
참고: parasitemia 감염 된 RBCs의 백분율로 정의가 정의 수 (2%) 이기도 하기 때문에, 단위 부피 당 기생충의 수는 쉽게 유추.- 5 %parasitemia 및 2%가 cRPMI에서 문화의 1 mL를 준비 (이러한 parasitemia 및 보통 수준의 문화 포함 1 x 107 기생충/mL).
- CRPMI와이 문화 1: 100 희석. 다시 cRPMI와 1: 100 희석.
- 1:400 희석. 이 희석 문화의 62.5 μ 25 mL cRPMI의 및 혈액의 1 mL에 추가 하 여 수행 합니다. 이 희석 0.5 기생충/200 μ의 원하는 농도에서 발생합니다.
-
기생충은 우물에서 감지 될 때까지 복제 접시를 유지 합니다.
- 모든 48 h 신선한 매체 96 잘 접시에 매체를 바꿉니다.
- 일주일에 한 번 복제 판 (단계 9.1) 시작 후 5 일 부터는 각 우물에서 100 μ를 제거 하 고 다시 100 μ 신선한 매체 + 혈액 (보통 2%)의 추가.
-
기생충을 포함 하는 어떤 우물을 식별 합니다.
- 약 20 분, 접시 내 각도에서 정착 혈액 수 있도록 45 ° 각도로 96 잘 접시를 놓습니다.
- 라이트 박스에 96 잘 접시를 놓습니다. 기생충을 포함 하는 우물 기생충에 의해 매체의 산성화로 인해 기생충 무료 웰 스의 핑크 미디어에 비해 색상에서 노란색은 미디어를 포함을 확인 합니다.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하는 parasitemia의 확장 있도록 24-잘 조직 문화 접시에 기생충을 포함 하는 웰 스의 내용을 이동 합니다.
- 를 사용 하 여 PCR 분석 8 단계에 설명 된 대로 올바른 통합이 클론 기생충 라인 확인 합니다.
10. 글루코사민과 서쪽 오 점 분석을 통해 확인 된 기생충을 치료 하 여 단백질의 분해
- 0.5 M GlcN (글루코사민) 재고 솔루션,-20 ° c.에 저장 될 수 있는 준비
- GlmS 기생충 문화에 GlcN를 추가 하 고 GlcN의 면 전에 서 성장 하도록 허용.
참고: 최종 농도 및 GlcN 치료의 타이밍 실험 및 기생충 라인에 따라 다릅니다. GlcN 부모의 기생충 스트레인 화합물에 그것의 감도 결정 하는 범위의 GlcN 농도에 노출 되어야 합니다 그래서 기생충 성장 영향을 줄 수 있습니다. 종종, 2.0-7.5 m m GlcN의 농도 사용된13,,1420입니다. - 13GlcN 처리 기생충 단백질 견본을 격리 합니다.
-
서쪽 오 점 분석을 위한 단백질 견본을 사용 하 여 단백질13감소를 감지.
- 제조업체의 지침에 따라 안티-HA 항 체를 사용 하 여 HA glmS 태그 단백질을 검출 하기 위하여. PfEF1α 같은 로드 제어 하 밴드를 비교 합니다.
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Representative Results
방패 돌연변이의 예가이 방법에서 사용 되는 플라스 미드의 회로도 그림 1에 나와 있습니다. Transfection 후 돌연변이 기생충을 식별 하는 방법의 예를 들어, HA-glmS 구문의 통합 검사 PCRs에서 결과 그림 2에 표시 됩니다. 복제 판의 대표 이미지 기생충의 매체의 색상 변화를 설명 하기 위해 그림 3 에 표시 됩니다. 면역 형광 분석 결과 및 서쪽 더 럽 히 실험 결과 HA 태그 glmS기능을 보여 주기 위해 그림 4 에 표시 됩니다-기생충에서 단백질의 감소를 기반으로. 그림 5 에서는 기생충 게놈 수정 가능한 돌연변이 얻을을 PCR 제품에 짧은 상 동 팔의 무 능력을 보여 줍니다.
그림 1: CRISPR/Cas9 및 gRNA 올리고와 방패 돌연변이의 예제 3-플라스 미드 원칙 요약. (A) 회로도 빈 pHA glmS와 pMK U6의 복제에 사용 되는 제한 효소 사이트 함께 표시 됩니다. 또한 표시 된 pHA glmS와 pMK U6 homology 팔 후 있으며 각각 gRNA 시퀀스 그들에 복제 되었습니다. 마지막으로, pUF1-Cas9 표시 됩니다. yDHOD = 효 모 dihydrofolate reductase, DSM1 저항 마커. (B) 대문자 및 소문자 (위)에 복제에 필요한 pMK U6 homology 팔 gRNA 시퀀스와 pMK U6로 PfHsp70x gRNA 시퀀스를 복제에 사용 하는 앞으로 올리고 표시 됩니다. PfHsp70x gRNA의 게놈 대상 다운스트림 팸, 빨간색 (가운데)으로 표시 됩니다. PfHsp70x gRNA 팸에에서 방패 돌연변이 레드 (아래)에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: CRISPR/Cas9 게놈 수정 통합 확인 pHA glmS와 전략을 사용 하 여의 도식. DNA 이중 가닥 휴식을 유도 하는 (A) Cas9, gRNA에 의해 게놈 소재 시에 가이드. 기생충 더블 크로스 오버 동종 복구, pHA glmS 플라스 미드를 사용 하 여 템플릿 및 HA glmS 순서는 게놈으로 소개를 통해 손상을 복구 합니다. (B) A PCR 테스트 하 glmS 시퀀스의 올바른 통합 식별 합니다. P1 및 P2 뇌관을 사용 하는 3' ORF 야생-타입 PfHsp70x와 PfHsp70x-glmS 돌연변이의 증폭된13있습니다. PfHsp70x-glmS에서 amplicon는 이상 하 glmS 시퀀스의 삽입으로 인해 야생-타입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 96-잘 복제 판에 기생충을 포함 하는 우물의 식별. (A) 96 잘 접시 접시에 각도에서 정착 혈액 수 있도록 20 분 약 45 ° 각도에서 설정 됩니다. (B) 왼쪽에 잘 포함 기생충 문화, 기생충-오른쪽에 잘 없는 핑크 매체에 비해 중간의 노란색 색상으로 표시 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 면역 형광 분석 결과 PfHsp70x의 올바른 하 태그 고 부 럽 글루코사민 치료 동안 PfHsp70x 단백질 레벨의 감소. (A) PfHsp70x-glmS 기생충 고정 되었고 DAPI (핵 마커)와 HA와 MAHRP1 항 체 얼룩이 (멤브레인 관련 히스티딘 풍부한 단백질 1, 호스트 RBC 단백질 수출의 마커)13. (B) PfHsp70x-glmS 기생충 7.5 m m 글루코사민로 치료 했다 및 전체 기생충 lysates 분석13blotting 서쪽을 위해 사용 되었다. 막 한 로드 제어13HA와 PfEF1α에 대 한 항 체와 함께 조사 했다. 예상 했던 대로, 글루코사민 치료 단백질의 감소에 있는 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 수리를 위해 짧은 homology 시퀀스를 사용 하 여. (A) 표현식 표시의 녹아웃 GFP B7 기생충21. B7 기생충이 있는 Plasmepsin II는 태그 GFP와 3D 7의 파생. PUF1-Cas9-eGFP-gRNA 함께 50, 75, 또는 GFP 상 동 지역 ("마커" 표시), blasticidin S 저항 카세트 측면의 100의 기본적인 쌍을 포함 하는 PCR 제품, 플라스 미드 Cas9와 GFP gRNA B7 기생충으로 페 했다. 각 transfection은 두 번 실시 되었다. DSM1 마약 압력 적용 된 2 일 후 transfection를 했다. (B) 표시 여기는 transfected 기생충 5 일 후 transfection 그리고 2 개월 후 transfection에서 고립 된 DNA에서 PCR 테스트입니다. B7 부모의 기생충 584-기본적인 쌍 제품 및 마커 통합 기생충에 대 한 2020 기본 쌍 제품 뇌관 BSD 저항 카세트의 통합을 테스트 하는 데 사용 얻을 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
CRISPR/Cas9 P. falciparum 에 구현은 모두의 효율성을 증가 하 고 기생충의 게놈, 유전자 조작의 이전 방법에 비해 수정에 필요한 시간을 감소. 이 포괄적인 프로토콜 P. falciparum에 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 돌연변이 생성에 필요한 단계를 설명 합니다. 여기 방법은 하-glmS 돌연변이의 발생을 위해 특별히 기어 드,이 전략의 다양 한 요구, 유전자, 유전자 녹아웃 그리고 점 돌연변이의 소개의 태그를 포함 하 여에 대 한 적응 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요 한 초기 단계는 gRNA 시퀀스의 선택 이다. gRNA를 선택할 때에 gRNA 앉아, 그것은 얼마나 효율적 오프 대상 효과 대 한 잠재력을가지고 여부 등 고려해 야 할 몇 가지 포인트 있다. GRNA 시퀀스 수정, 200의 기본적인 쌍 이내의 사이트에 가능한 한 가까이 있어야 합니다. 이 태그를 통합 하지 않고 그들의 게놈을 해결 하기 위해 복구 서식 파일을 사용 하 여 기생충의 가능성 감소. 여기는 gRNA를 찾는 데 사용 하는 도구 라는 CHOPCHOP22무료, 온라인 서비스 이었다. 다른 온라인 도구, 진 핵 병원 체 CRISPR RNA/DNA 디자인 도구 (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/) 가이드, 사용된23에 영향을 수도 있습니다. EuPaGDT 예측 대상에서 안타와는 gRNA의 녹음 하지 못하도록 하는 잠재적인 문제를 포함 하 여 gRNA 시퀀스의 추가 특성을 제공 합니다. EuPaGDT는 또한 여러 개의 유전자 또는 전체 게놈을 대상으로 gRNAs의 일괄 처리에 대 한 도구를 있다. 선택한 gRNA 하나 높은 효율과 최소 오프 대상 조회 수 수정의 사이트에 가장 가까운 앉아 해야 합니다. 발생할 수 있는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 하는 중요 한 제한 관심사의 유전자를 대상으로 적합 한 gRNA를 디자인 하는 무 능력 이다. 이러한 경우에는 평가판 및 오류 방법은 필요할 수 있습니다, 최고의 옵션을 찾을 때까지 여러 최적의 gRNA 시퀀스를 사용 하 여 그리고 발생 했습니다 성공적인 유전자 편집.
P. falciparum 돌연변이 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 생성 하는 때 고려해 야 할 또 다른 중요 한 요인은 복구 서식 파일에 사용 된 상 동 지역의 길이입니다. 이 프로토콜에는 상 동 지역 약 800 기본 쌍 각을 해야 하지만 우리는 또한 작은 지역 500 기본 쌍3를 번호 매기기를 사용 하 여 성공 했습니다 것이 좋습니다. PCR 제품에 CRISPR/Cas9 및 짧은 homology 무기를 사용 하 여 성공적인 게놈 수정 또한 Toxoplasma gondii , Trichomonas vaginalis24,25. 과 같은 다른 protozoan 기생충에 사용 되었습니다. 우리는 녹아웃 GFP B7 기생충 blasticidin 저항 카세트21을 사용 하 여 시도 하 여 PCR 제품 (50, 75, 또는 100의 기본적인 쌍)에 작은 상 동 팔을 사용 하 여의 타당성을 테스트. 우리는 5 일 게시물 transfection;에서 blasticidin 저항 카세트의 일부 통합 본 그러나, 이러한 기생충 transfection에서 결코 회복. 이 transfections에 대 한 우리는 DSM1를 사용 하 여 Cas9 표현 플라스 미드에 대 한 선택. 하거나 DSM1와 함께 blasticidin S transfected 문화 치료와 같은 다른 선택 방법 Cas9/gRNA-유도 나누기를 고치기를 위한 짧은 상 동 영역을 사용 하 여 때 reappearing 기생충의 가능성을 높일 수 있습니다. 이 경우에, 우리 않았다 선택 하지 blasticidin S와 우리는 짧은 상 동 팔 약물 저항 카세트 때 단백질 태그가 지정 되 고 같은 게놈으로 통합 되 고 되지는 경우에 사용 될 수 있는지 테스트 하 고 싶 었 이후.
CRISPR/Cas9 유전자 편집의 핵심 구성 요소는 Cas9 endonuclease, gRNA, 및 복구 템플릿은 논의. Cas9, gRNA, 및 복구 서식 파일 별도 플라스 미드에서 발견 되는 기생충으로 이러한 구성 요소를 소개 하는 3-플라스 미드 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법 이외에 우리의 실험실에 있는 Cas9 및 gRNA 식 단일 플라스 미드에 의해 구동 됩니다 하 고 복구 서식 파일은 두 번째 플라스 미드3에서 발견 2 플라스 미드 방식을 사용 하 여 성공 했다. 유사한 2 플라스 미드 접근은 또한 성공적으로 고용 되었다 다른 실험실에 의해 돌연변이7,8,26,27,,2829생성 하. 또한, 여러 연구소에는 변형 체 (NF54attB)는 constitutively 표현 하는 Cas9 및 gRNAs30의 드라이브 식 T7 RNA 중 합 효소의 변형 사용 하는. 이 경우 수리 템플릿과 gRNA를 포함 하는 단일 플라스 미드 NF54attB 기생충31,32로 페는. 마지막으로, 복잡 한 정화 Cas9 gRNA ribonucleoprotein를 활용 하 여 플라스 미드 무료로 접근 변이 잘33게놈으로 삽입을 사용 되었습니다. 이 다른 접근의 성공에 연구자 수 기생충에 Cas9/gRNA 구성 요소를 소개 하는 방법의 유연성을 보여 줍니다.
마지막으로, transfected 기생충에 적용할 마약 압력의 선택 변경할 수 있습니다, 사용 하는 구문에 따라. 여기, 우리는 뚜렷이 기생충 다시 나타날 때까지 DSM1를 사용 하 여 Cas9 표현 플라스 미드에 대 한 선택 하 여 돌연변이의 성공적인 세대를 보여줍니다. 기생충 WR9921013를 사용 하 여 선택 했다 그리고 PfHsp70x 녹아웃 기생충을 생성 하기 위해 pfhsp70x 인간 dihydrofolate 환 원 효소 유전자로 대체 되었습니다. 최근 설명된 TetR PfDOZI 최저의 시스템 blasticidin S15,31를 사용 하 여 기생충의 선택에 대 한 수 있도록, blasticidin S 저항 유전자를 포함 하는 플라스 미드의 통합에 의존 합니다.
전반적으로, 말라리아 연구에 강력한 도구가 될 수 입증 되었습니다 CRISPR/Cas9 유전자의 P. falciparum 편집 하 고 여기에 프로토콜 세부 조건부 최저의 돌연변이3,,78 을 생성 하기 위한 방법 , 13 , 20 , 28.이 프로토콜은 개별 연구 분야에 매우 적응.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 조지아 대학 (UGA) 생물 현미경 핵심 기술 지원 Muthugapatti Kandasamy와 호세 후안 로페즈-루비 오 pUF1 Cas9 및 pL6 플라스 미드를 공유 하기 위한 감사. 이 작품 호 재단 수상 D.W.C. 하 고 H.M.K.에 의해 지원 되었다 UGA 시작 자금 V.M., V.M., 그리고 미국 국립 보건원에 천 재단 (바 질 오 코너 스타터 학술 연구 상)의 3 월에서에서 보조금을 부여 (R00AI099156 및 R01AI130139) V.M. 하 고 (T32AI060546) H.M.K.를
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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