Summary
Beschrijven we een methode voor het genereren van glmS-op basis van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in Plasmodium falciparum met behulp van CRISPR/Cas9 genoom bewerken.
Abstract
Malaria is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Deze ziekte, die voornamelijk degenen die leven in tropische en subtropische gebieden treft, wordt veroorzaakt door infectie met Plasmodium parasieten. De ontwikkeling van meer effectieve medicijnen tegen malaria kan versneld worden door het verbeteren van ons begrip van de biologie van deze complexe parasiet. Genetische manipulatie van deze parasieten is de sleutel tot het begrijpen van hun biologie; echter is historisch het genoom van P. falciparum moeilijk geweest om te manipuleren. Onlangs, CRISPR/Cas9 genoom bewerken is gebruikt in de malariaparasieten, waardoor voor eenvoudiger eiwit tagging, generatie van voorwaardelijke eiwit knockdowns, en de deletie van genen vertonen. CRISPR/Cas9 genoom bewerken heeft bewezen als een krachtig instrument voor het bevorderen van het gebied van malaria-onderzoek. Hier beschrijven we een CRISPR/Cas9-methode voor het genereren van glmS-op basis van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in P. falciparum. Deze methode is zeer aangepast aan andere soorten genetische manipulaties, met inbegrip van eiwit tagging en gene uitsparingen.
Introduction
Malaria is een verwoestende ziekte veroorzaakt door eencellige parasieten van het geslacht Plasmodium. P. falciparum, de meeste dodelijke menselijke malariaparasiet, veroorzaakt ongeveer 445.000 sterfgevallen per jaar, meestal bij kinderen onder de leeftijd van vijf1. Plasmodium parasieten hebben een ingewikkelde levenscyclus waarbij een mug vector en een gewervelde gastheer. Mensen raken eerst besmet wanneer een geïnfecteerde mug een bloed-maaltijd neemt. Vervolgens valt de parasiet binnen de lever waar het groeit, ontwikkelt en verdeelt voor ongeveer een week. Na dit proces, zijn de parasieten in de bloedbaan, waar ze ondergaan ongeslachtelijke replicatie in rode bloedcellen (RBC) uitgebracht. Groei van de parasieten binnen de RBC zijn rechtstreeks verantwoordelijk voor de klinische symptomen die gepaard gaan met malaria2.
Tot voor kort was de productie van transgene P. falciparum een moeizaam proces, waarbij verschillende rondes van de selectie van de drug die vele maanden nam en een hoge mislukkingstarief had. Deze tijdrovende procedure relieson breekt de generatie van willekeurige DNA in de regio van belang en de endogene capaciteit van de parasiet te herstellen zijn genoom wel homologe reparatie3,4,5,6 . Onlangs, geclusterd regelmatig Interspaced palindromische Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) genoom bewerken is met succes gebruikt in P. falciparum7,8. De invoering van deze nieuwe technologie in malaria onderzoek is cruciaal voor het bevorderen van begrip van de biologie van deze dodelijke parasieten van Plasmodium . CRISPR/Cas9 voorziet in specifieke doelgerichtheid van genen via gids RNAs (gRNAs), dat homoloog aan het gen van belang zijn. De gRNA/Cas9 complexe herkent het gen via de gRNA, en Cas9 introduceert dan een pauze van de dubbel-strand, dwingen de inleiding van herstelmechanismes in het organisme9,10. Omdat P. falciparum de machine om te herstellen van DNA-einden ontbreekt via niet-homologe einde deelname aan, het maakt gebruik van homologe recombinatie mechanismen en integreert transfected homologe DNA sjablonen om te herstellen van de Cas9/gRNA-veroorzaakte Tweepersoonskamer-strand break11,12.
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in P. falciparum met behulp van CRISPR/Cas9 genoom bewerken. Het protocol demonstreert het gebruik van de Ribozym van de glmS naar voorwaardelijk vechtpartij eiwitniveaus van PfHsp70x (PF3D7_0831700), een chaperone geëxporteerd door P. falciparum in gastheer RBC13,14. De glmS Ribozym wordt geactiveerd door behandeling met glucosamine (die wordt geconverteerd naar glucosamine-6-fosfaat in cellen) om te klieven zijn bijbehorende mRNA, wat leidt tot een verlaging van de eiwit-14. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het gebruik van andere voorwaardelijke vechtpartij hulpmiddelen, zoals destabilisatie domeinen of RNA aptamers4,5,15. Onze gegevens-protocol het genereren van een plasmide van de reparatie die bestaat uit een hemagglutinine (HA)-tag en glmS Ribozym codering reeks geflankeerd door sequenties die zijn homoloog aan de PfHsp70x open leesraam (ORF) en de 3'-UTR. Ook beschrijven we de generatie van een tweede plasmide tot uitdrukking van de aandrijving van de gRNA. Deze twee plasmiden, samen met een derde die uitdrukking van Cas9, rijdt zijn transfected in RBC en gebruikt voor het wijzigen van het genoom van P. falciparum parasieten. Ten slotte, beschrijven we een polymerase-kettingreactie (PCR)-techniek om te controleren of de integratie van de tag en glmS Ribozym gebaseerd. Dit protocol is hoogst aanpasbaar voor de wijziging of de volledige knockout van alle genen van P. falciparum , verbetering van ons vermogen om het genereren van nieuwe inzichten in de biologie van de malariaparasiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Continue cultuur van P. falciparum vereist het gebruik van menselijke RBC en we commercieel gekochte eenheden van bloed dat waren ontdaan van alle id's en anoniem gemaakt gebruikt. De institutionele Review Board en de Office bioveiligheid aan de Universiteit van Georgia gecontroleerd onze protocollen en goedgekeurd op alle protocollen die worden gebruikt in ons lab.
1. het kiezen van een gRNA reeks
- Ga naar CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) en selecteer ' Fasta Target'. Onder 'Target', plakt u de 200 basenparen van 3' eind van de open leesraam (ORF) van een gen en 200 basenparen vanaf het begin van de genes 3'-UTR. Selecteer onder 'In', 'P. falciparum' (3D 7 v3.0), en selecteer ' CRISPR/Cas9 ' onder 'Gebruiken'. Klik vervolgens op ' vinden Target Sites'.
- Selecteer een gRNA-reeks uit de opties gepresenteerd, voorkeur te geven aan de meest efficiënte gRNA die zich het dichtst bij de site van wijziging en dat heeft de minste uit doelsoort zijn sites.
Opmerking: Potentiële gRNA sequenties worden geïdentificeerd omdat ze onmiddellijk stroomopwaarts van een Protospacer aangrenzende Motif (PAM), die nodig is voor de aanwerving van Cas9 tot DNA. De volgorde die wordt gekloond in pMK-U6, de vector die gRNA expressie, maar dan drijft is de 20 honken onmiddellijk voorafgaand aan de PAM. De specifiek voor S. pyogenes Cas9 PAM is de nucleotide-volgorde NGG en niet moet worden opgenomen in de volgorde die wordt gekloond in pMK-U6.
Opmerking: CHOPCHOP visueel gelederen de sequenties van de gRNA, de beste opties in groen, de minder ideale opties in barnsteen, en de ergste opties in het rood weer te geven. CHOPCHOP geeft de volgorde van elke gRNA een efficiëntie-score die wordt berekend met behulp van de modernste parameters gevonden in de literatuur, en ze voorspellen uit doelsoort zijn sites die kunnen worden herkend door de gRNA. Twee of drie gRNA sequenties wellicht worden geprobeerd te vinden van de gRNA die het beste geschikt is voor een bepaald gen. - De volgorde van de gRNA en het omgekeerde-complement als Polyacrylamide-Gel-elektroforese-gezuiverd oligos kopen. De volgorde van de gRNA gebruikt voor het doel PfHSP70x kan worden gevonden in figuur 1B.
Opmerking: Deze oligo dient 15 basenparen homoloog aan de gRNA-uiten plasmide, die nodig voor de reeks en Afbinding-onafhankelijke klonen (SLIC) in de pMK-U6 vector16 zijn.
2. het klonen van de gRNA volgorde in pMK-U6
-
Verteren de pMK-U6 met BtgZI.
- Digest 10 μg pMK-U6 met 5 μl van BtgZI enzym (5.000 eenheden/mL) gedurende 3 uur bij 60 ° C. Volg van de fabrikant van het enzym protocol voor reactie voorwaarden.
- Na de incubatietijd van 3 h, voeg toe een extra 3 μL van BtgZI aan de reactie op de zorgen van de volledige spijsvertering van de plasmide. Verteren voor een extra 3 h, nog steeds na instructies van de fabrikant om te zorgen voor de juiste omstandigheden.
- Als u wilt zuiveren het verteerd pMK-U6 uit de reactie, een kolom gebaseerde PCR Schoonmaakbeurt kit volgens de instructies van de fabrikant te gebruiken.
- Scheid het verteerd DNA met behulp van een 0,7% agarose gel en uitpakken van de 4.200-basenpaar band.
-
Ontharden de oligos met de gRNA reeks.
- Het reconstrueren van de pagina-gezuiverd oligos tot een concentratie van 100 μM met behulp van de nuclease-gratis water.
- 10 μL van elke oligo combineren met 2.2 μL van 10 x buffer 2 (Zie Tabel van materialen). Zorg ervoor dat het volume van de totale reactie 22.2 μL.
- Uitvoeren van het programma in een thermocycler gloeien gRNA: stap 1: 95 ° C, 10 min; stap 2: 95 ° C, 1 s, met een daling van de temperatuur van 0,6 ° C/cyclus; stap 3: Ga naar stap 2, 16 keer; stap 4: 85 ° C, 1 min; stap 5: 85 ° C, 1 s, met een daling van de temperatuur van 0,6 ° C/cyclus; stap 6: gaat u naar stap 5, 16 keer; stap 7: 75 ° C, 1 min; stap 8: 75 ° C, 1 s, met een daling van de temperatuur van 0,6 ° C/cyclus; stap 9: gaat u naar stap 8, 16 keer. Stap 10 tot en met 21: Herhaal de procedure gebruikt in stappen 4 tot en met 9 totdat de temperatuur 25 ° C; stap 22:25 ° C, 1 min.
-
Het ontharde gRNA oligos invoegen door de BtgZI-verteerd en gel-gezuiverd pMK-U6 plasmide.
- Combineer 100 ng van verteerd pMK-U6 met 1 μL van 10 x buffer 2.1 en 3 μL van oligos van de ontharde gRNA. Verhoog het volume naar 9,5 μL met nuclease-gratis water.
- Voeg 0,5 μL van T4 polymerase en Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 2,5 minuten.
- Verplaats de reactie op ijs en incubeer gedurende 10 min.
- Onmiddellijk transformeren 5 μL van de reactie in bevoegde E. coli volgens de instructies van de leverancier van de bacteriën. Plaat van de bacteriën op lysogenie Bouillon (LB) agar platen met 100 μg/mL ampicilline.
- Zodat de getransformeerde bacteriën groeien bij 37 ° C's nachts, dan Selecteer kolonies en uitpakken van DNA met een commercieel beschikbare plasmide miniprep kit.
3. ontwerpen homologie-regio's van de reparatie-sjabloon
-
Ontwerp schild mutaties binnen de homologie reparatie sjabloon om te voorkomen dat opnieuw snijden van het DNA dat het genoom is geïntegreerd.
Opmerking: Een mutatie van het schild bestaat meestal uit de invoering van een stille mutatie om te wijzigen de PAM zodat Cas9 zal niet het induceren van een breuk in de sjabloon van de reparatie. De PAM vereist voor de Cas9 gebruikt in dit protocol de nucleotide sequentie "NGG" is, waarbij "N" staat voor elk nucleotide. Indien mogelijk, omzetten in een van de G-nucleotiden een A, C of T.- Als de PAM kan niet stil worden gemuteerd, voeren ten minste 2 stille mutaties in de 6 basenparen direct grenzend aan de PAM7,8.
Opmerking: Deze mutaties zal voorkomen dat erkenning van de reparatie-sjabloon door de gRNA en te voorkomen dat opnieuw het snijden van de gerepareerde locus door de Cas9/gRNA complex. Het schild mutaties kunnen door het sturen van het DNA met inleidingen die de mutatie bevatten de homologie regio worden binnengebracht.
- Als de PAM kan niet stil worden gemuteerd, voeren ten minste 2 stille mutaties in de 6 basenparen direct grenzend aan de PAM7,8.
-
Versterken de ORF homologie regio voor de reparatie-sjabloon.
- Met behulp van PCR, versterken 800 basenparen van 3' eind van het target-gen ORF. De inleidingen die worden gebruikt voor het uitsluiten van de stop codon van deze amplicon te ontwerpen.
- Het ontwerp van de inleidingen voor het inbrengen van deze amplicon in het pHA -glmS die met SacII en AfeI via een DNA afbinding reactie of SLIC16heeft zijn verteerd.
-
Versterken van de 3'-UTR homologie regio voor de reparatie-sjabloon.
- Met behulp van PCR, versterken de 800 basenparen onmiddellijk na de stop codon van het target-gen. Het ontwerpen van inleidingen voor het invoegen van deze amplicon in het pHA -glmS die met HindIII en NheI via een DNA afbinding reactie of SLIC16heeft zijn verteerd.
Opmerking: De hoge inhoud van het genoom van P. falciparum kan bemoeilijken versterking van regio's zoals UTRs. Een alternatieve benadering voor het gebruik van PCR is de synthese van de homologie-regio's.
- Met behulp van PCR, versterken de 800 basenparen onmiddellijk na de stop codon van het target-gen. Het ontwerpen van inleidingen voor het invoegen van deze amplicon in het pHA -glmS die met HindIII en NheI via een DNA afbinding reactie of SLIC16heeft zijn verteerd.
4. klonen homologie regio's in de plasmide reparatie
-
De ORF homologie regio invoegen door het pHA -glmS.
- Verteren het pHA -glmS met SacII en AfeI, volgens de instructies van de fabrikant van het enzym. Het PCR-product van de ORF homologie-regio in het verteerd plasmide met behulp van SLIC16invoegen.
- Transformeren in bevoegde E. coli zoals uitgevoerd in stappen 2.3.4 en 2.3.5.
-
De 3'-UTR homologie gebied invoegen in een plasmide pHA-glmS, die al de ORF homologie regio bevat (zie stap 4.1).
- Verteren het plasmide met HindIII en NheI volgens de instructies van de fabrikant van het enzym. Plaats de 3'-UTR homologie regio amplicon in het verteerd plasmide met behulp van SLIC16.
- Transformeren in bevoegde E. coli en haal het plasmide DNA (stappen 2.3.4 en 2.3.5).
5. Neerslagmiddel DNA voor Transfectie
- Voeg toe 40 μg van pMK-U6, pUF1-Cas9 en pHA -glmS DNA (voor een totaal van 120 μg van DNA) in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Toevoegen van 1/10de de hoeveelheid DNA van 3 M Natriumacetaat in water (pH 5.2) aan de buis en meng goed met behulp van een draaikolk (bijvoorbeeld als het volume in stap 5.1 was 100 μl, voeg toe 10 μL van natriumacetaat).
- 2,5 maal het volume van 100% ethanol toevoegen aan de buis en meng goed met behulp van een draaikolk voor ten minste 30 s (bijvoorbeeld als het volume in 5.1 was 100 μl, voeg toe 250 μL van 100% ethanol).
- Plaats de buis op ijs of op-20 ° C gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de buis bij 18,300 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant voorzichtig uit de buis. De pellet niet storen.
- 3 maal het volume van 70% ethanol toevoegen aan de buis en mix kort met behulp van een draaikolk (bijv., als het volume in 5.1 100 μl was, voeg 300 l 70% ethanol).
- Centrifugeer de buis bij 18,300 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een biologische veiligheidskast. - Verwijder het supernatant voorzichtig uit de buis. De pellet niet storen. Laat de buis open en laat de pellet te drogen gedurende 15 minuten.
- De neergeslagen DNA bij-20 ° C worden opgeslagen totdat het nodig is voor Transfectie.
6. het isoleren van menselijke ige suspensie van RBC van volbloed ter voorbereiding van de Transfectie
- Aliquot vers bloed in steriele 50 mL conische buizen (ongeveer 25 mL per buis).
- Centrifugeer de buizen bij 1.088 x g gedurende 12 minuten, met de remmen van de centrifuge ingesteld op 4.
- Gecombineerd uit het supernatant en buffy coat. Resuspendeer de pellet van de RBC met een gelijk volume van onvolledige RPMI.
Opmerking: Onvolledige RPMI wordt bereid door RPMI 1640 aan te vullen met 10.32 μM thymidine, 110.2 μM hypoxanthine, 1 mM natrium pyruvaat, natriumbicarbonaat 30 mM, 5 mM HEPES, 11.1 mM glucose en gentamicine 0,02% (v/v). - Herhaal stap 6.2 – 6.3 tweemaal. Na de laatste wash, resuspendeer de RBC in een gelijk volume van onvolledige RPMI en opslaan van de buizen bij 4 ° C.
7. transfecting RBC met de CRISPR/Cas9-plasmiden (moet aseptisch worden gedaan)
Opmerking: P. falciparum culturen worden onderhouden zoals beschreven in andere verslagen-17. Handhaven alle culturen bij 37 ° C onder 3% O2, 3% CO2en 94% N2 tenzij anders vermeld. Wanneer het bloed in dit protocol wordt gebruikt, verwijst het naar de zuivere rode bloedcellen bereid in stap 6. Het bloed gebruikt mag niet ouder zijn dan 6 weken, want er meestal een afname van de proliferatie van de parasiet in oudere bloed is. De volgende stappen beschrijven vooraf laden RBC met DNA en de cultuur van een parasiet aan transfected cellen toe te voegen. Andere gevestigde transfectie protocollen zijn compatibel met de transfecting van deze constructies18,19.
- Bereiden een 1 x cytomix buffer in water (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6). Filter-steriliseren de buffer met behulp van een filter 0,22 μm.
- Voeg 380 μL van de cytomix van 1 x tot het DNA neergeslagen in stap 5, en vortex te ontbinden. Toestaan van het DNA te ontbinden in de 1 x cytomix voor 10 minuten, vortexing elke 3 min voor 10 s.
- Combineren in een steriele 15 mL conische buis, 300 μL van RBC (50% hematocriet, vanaf stap 6) in de onvolledige RPMI met 4 mL 1 x cytomix.
- Centrifugeer het RBC uit stap 7.3 op 870 x g gedurende 3 minuten en verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de RBC-pellet.
- Resuspendeer de pellet van de RBC met het mengsel van de DNA/cytomix vanaf stap 6.2 en overdracht aan een 0,2 cm electroporation cuvette.
- Electroporate de RBC met behulp van de volgende voorwaarden: 0.32 kV 925 precisiecapaciteit ingesteld op "Hoog Cap" en weerstand, μF ingesteld op "Oneindig".
- Na electroporation, breng de inhoud van de Cuvet een 15 mL kegelvormig met 5 ml van de volledige RPMI (cRPMI). Centrifugeer de buis bij 870 x g gedurende 3 minuten bij 20 ° C, en vervolgens de bovendrijvende vloeistof decanteren.
Opmerking: cRPMI is bereid via dezelfde methode als onvolledig RPMI met de toevoeging van 0,25% (m/v) lipide-rijke bovien serumalbumine. - Resuspendeer de pellet in 4 mL van cRPMI en overdracht aan één putje in een 6-well weefselkweek plaat. Voeg 400 μL van de cultuur van een hoog-schizont (7-10% schizont parasitemia is ideaal) naar de transfected RBC.
Opmerking: Parasitemia is gedefinieerd als het percentage van de parasiet besmet RBC. - De volgende dag was de cultuur met 4 mL cRPMI. Centrifugeer de cultuur op 870 x g gedurende 3 minuten en het supernatant gecombineerd. Resuspendeer de cultuur in 4 mL cRPMI.
- 48 uur na het voltooien van stap 7.6, was de cultuur met 4 mL cRPMI. Vervolgens resuspendeer de cultuur in cRPMI 1 μM met DSM1 om te selecteren voor het Cas9-plasmide.
-
Blijven de culturen wassen elke dag met cRPMI tot parasieten niet langer zichtbaar door bloed-uitstrijkje zijn. Na dit punt, vervangt het kweekmedium met verse cRPMI plus 1 μM DSM1 elke 48 uur.
- Om een bloed smear, Pipetteer 150 μl van cultuur in een centrifugebuis 0,6 mL. Pellet de cellen door centrifugeren bij 1700 x g gedurende 30 s.
- Gecombineerd uit het supernatant. Gebruik een pipet de Ingehuld cellen overbrengen naar een glasplaatje. Met behulp van een tweede glasplaatje gehouden in een hoek van 45° aan de eerste dia, uitstrijkje van de druppel bloed. Vlek op de dia met behulp van een commercieel beschikbare kleuring kit volgens protocol van de fabrikant.
- Bekijk de parasieten die met behulp van een 100 X olie onderdompeling doelstelling.
- Vanaf 5 dagen na transfectie (stap 7.6), verwijderen van 2 mL van de cultuur met RBC geresuspendeerde in het kweekmedium. Voeg terug 2 mL verse medium (cRPMI plus 1 μM DSM1) en bloed aan 2% hematocriet. Vers bloed wordt toevoegen op deze manier zodra een week tot parasieten weer, zoals bepaald door dun bloed-uitstrijkje (stap 7.11).
Opmerking: Als integratie succesvol is, parasieten in het algemeen wel weer in de cultuur van één maand na transfectie. - Zodra de parasieten weer, verwijderen DSM1 drug druk. U kunt ook verwijderen drug druk nadat parasieten hebben gekloond uit.
8. controle van parasieten voor integratie van de reparatie-sjabloon
- Als parasieten opnieuw door dun bloed-uitstrijkje zichtbaar zijn, isoleren DNA van de cultuur met behulp van een passende kit.
-
Hiermee kunt u dat PCR versterken de gemodificeerde regio van het genoom te bepalen als de gerichte locus met succes veranderd is en als de ongewijzigde wild-type locus (indicatief van wild-type parasieten) kan worden opgespoord.
- Gebruiken voor het detecteren van parasieten die zijn geïntegreerd met de reparatie-sjabloon, een voorwaartse primer die aan het begin van de ORF, buiten de gekloonde homologie-regio zit. Gebruik een omgekeerde primer die in de 3'-UTR zit.
Opmerking: Deze versterking bevat de sequenties van de HA codes en glmS Ribozym, waarbij van geïntegreerde parasieten zullen langer dan dezelfde regio versterkt in wild-type parasieten.
- Gebruiken voor het detecteren van parasieten die zijn geïntegreerd met de reparatie-sjabloon, een voorwaartse primer die aan het begin van de ORF, buiten de gekloonde homologie-regio zit. Gebruik een omgekeerde primer die in de 3'-UTR zit.
9. het klonen van parasieten door verdunning te beperken
-
Seriële verdunningen van de parasiet cultuur vanuit stap 7.13 om een eindconcentratie van 0,5 μL van de parasieten/200 uitvoeren. Breng 200 μL van de verdunde cultuur in de putjes van een weefselkweek 96-wells-plaat.
Opmerking: Omdat parasitemia is gedefinieerd als het percentage van geïnfecteerde RBC en de hematocriet is ook een gedefinieerde getal (2%), het aantal parasieten per eenheid volume is gemakkelijk afgeleid.- Bereiden 1 mL van de cultuur in cRPMI op 5% parasitemia en 2% hematocriet (deze parasitemia en niveau hematocriet, de cultuur bevat 1 x 107 parasieten/mL).
- Verdun deze cultuur-1:100 met cRPMI. Verdun weer 1:100 met cRPMI.
- Verdunde 1:400. Het uitvoeren van deze tweevoudige verdunning door toevoeging van 62,5 μL van cultuur aan 25 mL van cRPMI en 1 mL bloed. Deze verdunning leidt tot de gewenste concentratie van 0,5 μL van de parasieten/200.
-
De klonen plaat handhaven parasieten zijn opspoorbaar in de putjes.
- Elke 48 h, wordt het medium in de 96-wells-plaat vervangen door verse medium.
- Eenmaal per week, vanaf 5 dagen na het begin van de klonen plaat (stap 9.1), verwijder 100 μl uit elk putje en voeg terug 100 μl van verse medium + bloed (2% hematocriet).
-
Eventuele putjes met parasieten te identificeren.
- Plaats de 96-wells-plaat duikt met een hoek van 45° gedurende ongeveer 20 minuten, waardoor het bloed te vestigen op een hoek in de plaat.
- Plaats de 96-wells-plaat op een lichtbak. U ziet dat de putjes met parasieten media die is geel van kleur bevat, in vergelijking met de roze media van parasiet-vrije wells, als gevolg van verzuring van het medium door de parasieten.
- Met behulp van een serologische precisiepipet, verplaatst u de inhoud van de parasiet-bevattende putten aan een 24-well weefselkweek plaat dat uitbreiding van de parasitemia.
- Met behulp van PCR analyse zoals beschreven in stap 8, controleer deze klonale parasiet lijnen voor correcte integratie.
10. knockdown van het eiwit door de behandeling van parasieten met Glucosamine en bevestiging via westelijke vlekkenanalyse
- Bereid een 0,5 M-oplossing voor het voorraad van GlcN (glucosamine), die kan worden opgeslagen bij-20 ° C.
- Voeg GlcN aan de glmS parasiet culturen en laat hen om te groeien in aanwezigheid van GlcN.
Opmerking: De eindconcentratie en timing van de GlcN behandeling hangt af van het experiment en parasiet lijn. GlcN, kan dit gevolgen hebben voor groei van de parasiet, zodat de ouderlijke parasiet stam mag worden blootgesteld aan een reeks van GlcN concentraties te bepalen van de gevoeligheid voor de verbinding. Vaak is een concentratie van 2.0-7,5 mM GlcN gebruikte13,14,20. - Isoleren EiwitSteekproeven van de GlcN behandelde parasieten13.
-
Gebruiken EiwitSteekproeven voor westelijke vlekkenanalyse voor het detecteren van verlaging van de eiwit-13.
- Gebruik een anti-HA antilichaam volgens de instructies van de fabrikant om de HA-glmS-gelabeld proteïne te ontdekken. Vergelijk de HA band aan een besturingselement van het laden, zoals PfEF1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische voorstelling van de plasmiden gebruikt in deze methode, evenals een voorbeeld van een mutatie van het schild worden weergegeven in Figuur 1. Als een voorbeeld van hoe te identificeren van mutant parasieten na transfectie, zijn resultaten van PCRs voor het controleren van de integratie van de HA -glmS construct afgebeeld in Figuur 2. Een representatief beeld van een klonen plaat is afgebeeld in Figuur 3 om aan te tonen van de kleur te veranderen van het medium in de aanwezigheid van parasieten. Resultaten van een bepaling van de immunofluorescentie en westelijke bevlekkende experimenten worden weergegeven in Figuur 4 om aan te tonen van de functionaliteit van de HA tag en glmS-op basis van reducties van eiwitten in de parasieten. Figuur 5 toont het onvermogen van korte homologie wapens op PCR producten te wijzigen van het genoom van de parasiet en haalbare mutanten te krijgen.
Figuur 1: samenvatting van onze drie-plasmide benadering van CRISPR/Cas9 en voorbeelden van een gRNA oligo en schild mutatie. (A) schema van lege pHA-glmS en pMK-U6 worden weergegeven met de websites van de restrictie-enzym gebruikt voor het klonen. Vertoond zijn pHA-glmS en pMK-U6 na de homologie armen en gRNA sequenties hebben gekloond in hen, respectievelijk. Tot slot, pUF1-Cas9 wordt weergegeven. yDHOD = gist dihydrofolate reductase, de markering van de weerstand aan DSM1. (B) de voorwaartse oligo gebruikt voor het klonen van de volgorde van de gRNA PfHsp70x in pMK-U6 wordt weergegeven, met de volgorde van de gRNA in hoofdletters en de pMK-U6 homologie armen nodig voor het klonen van in kleine letters (boven). Het genomisch doelwit van de gRNA van de PfHsp70x wordt weergegeven als de downstream PAM, in het rood (midden). De mutatie van het schild in het PfHsp70x gRNA PAM wordt weergegeven in het rood (onder). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematische van CRISPR/Cas9 genoom wijziging met behulp van pHA-glmS en een strategie voor het bevestigen van integratie. (A) Cas9, naar een genomic locus geleid door een gRNA, induceert een dubbele strand vakantie in het DNA. De parasiet herstelt de schade door dubbele crossover homologe reparatie, met behulp van de plasmide pHA-glmS als een sjabloon en invoering van de volgorde van de HA-glmS in het genoom. (B) een PCR testen ter identificatie van de correcte integratie van de HA-glmS-reeks. Gebruikend inleidingen P1 en P2, zijn de 3-' ORF van wild-type PfHsp70x en PfHsp70x -glmS -mutanten versterkte13. De amplicon van PfHsp70x-glmS is langer dan wild-type als gevolg van de inlassing van de HA-glmS-reeks. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: identificatie van putten met parasieten in een klonen 96-wells-plaat. (A) de 96-wells-plaat ligt op een hoek van 45 ° gedurende ongeveer 20 minuten om het bloed te vestigen op een hoek in de plaat. (B) de put aan de linkerkant bevat een parasiet cultuur, aangegeven door de gele kleur van het medium in vergelijking met het roze medium van de parasiet-vrij goed op het recht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: een immunofluorescentietest assay toont de juiste HA-tagging van PfHsp70x en westelijke bevlekken toont verlaging van PfHsp70x eiwit tijdens behandeling met glucosamine. (A) PfHsp70x -glmS parasieten waren vastgesteld en gekleurd met DAPI (nucleus marker) en antilichamen tegen HA en MAHRP1 (membraan geassocieerde Histidine Rich eiwit 1, een marker van eiwit exporteren naar de host RBC)13. (B) PfHsp70x -glmS parasieten werden behandeld met 7,5 mM glucosamine, en geheel-parasiet lysates werden gebruikt voor het westelijke bevlekken analyse13. Het membraan was gesondeerd met antilichamen voor HA en PfEF1α zoals een laden controleren13. Zoals verwacht, resulteerden glucosamine behandeling in een daling van het eiwit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: met behulp van korte homologie sequenties voor reparatie. (A) Schematische weergave weergegeven: knockout van GFP in B7 parasieten21. B7 parasieten zijn een afgeleide van 3D 7 waarin heeft Plasmepsin II is gelabeld met GFP. PCR producten met 50, 75 of 100 basenparen van GFP homologie gebieden flankerende een blasticidin S weerstand cassette (het label van "marker"), samen met pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, een uiting van Cas9 en een gRNA van GFP, plasmide zijn transfected in B7 parasieten. Elke transfectie werd tweemaal uitgevoerd. Toegepaste 2 dagen na transfectie was DSM1 drug druk. (B) getoond hier zijn PCR-tests op DNA van transfected parasieten 5 dagen na transfectie en 2 maanden na transfectie geïsoleerd. Inleidingen gebruikt voor het testen van de integratie van de BSD weerstand cassette zal opleveren een 584-basenpaar product voor B7 ouderlijke parasieten en een 2020-basenpaar voor parasieten die de markering zijn geïntegreerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deimplementatie van CRISPR/Cas9 in P. falciparum heeft zowel verhoogde de efficiëntie van en verminderde van de hoeveelheid tijd die nodig is voor het wijzigen van de parasiet genoom, vergeleken met vorige methoden van genetische manipulatie. Dit uitgebreide protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van voorwaardelijke mutanten met behulp van CRISPR/Cas9 in P. falciparum. Terwijl de methode hier is gericht specifiek voor de generatie van HA -glmS mutanten, kan deze strategie worden aangepast voor een verscheidenheid van behoeften, met inbegrip van de identificatie van genen, gene uitsparingen, en de invoering van puntmutaties.
Een kritieke eerste stap in dit protocol is de selectie van een reeks gRNA. Bij het selecteren van een gRNA, zijn er verschillende punten te overwegen zoals waar de gRNA zit, hoe efficiënt is en of het heeft het potentieel voor off-target effecten. De volgorde van de gRNA moet zo dicht mogelijk op de site van wijziging, idealiter binnen 200 basenparen. Dit vermindert de kans op de parasieten die met behulp van de sjabloon van de reparatie te lossen hun genoom zonder integratie van de tag. Het hulpprogramma gebruikt hier om te zoeken van de gRNA was een gratis, online dienst genaamd CHOPCHOP22. Een andere online tool, eukaryote Pathogen CRISPR gids van RNA/DNA Design Tool (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/), kunnen ook gebruikte23. EuPaGDT biedt extra karakterisering van gRNA sequenties, met inbegrip van de voorspelling van off-target hits en potentiële problemen die verhinderen transcriptie van de gRNA dat kunnen. EuPaGDT heeft ook hulpmiddelen voor batch-verwerking van gRNAs te richten op meerdere genen of hele genoom. De geselecteerde gRNA moet een die dichtst op de site van de wijziging met de hoogste efficiëntie en minimale uit-target hits zit. Een belangrijke beperking van het bewerken van CRISPR/Cas9-gen die kan ontstaan is het onvermogen om het ontwerpen van een geschikte gRNA te richten op het gen van belang. In dergelijke gevallen een trial-and-error aanpak kan nodig zijn, met behulp van meerdere sub-optimale gRNA sequenties totdat de beste optie is gevonden, en succesvolle gene bewerken is opgetreden.
Een andere belangrijke factor die meespeelt bij het genereren van P. falciparum mutanten met behulp van CRISPR/Cas9 is de lengte van de homologie-regio's in de reparatie-sjabloon gebruikt. Dit protocol beveelt aan dat de homologie-regio's ongeveer 800 basenparen elk moeten, maar wij ook succesvol geweest in het gebruik van kleinere regio's 500 basenparen3nummering. Wijziging van de succesvolle genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en korte homologie armen op PCR producten zijn ook gebruikt in andere eencellige parasieten zoals Toxoplasma gondii en Trichomonas vaginalis24,25. We testten de haalbaarheid van het gebruik van kleinere homologie wapens op PCR producten (50, 75 of 100-basenparen) door te proberen te knock-out GFP in B7 parasieten met behulp van een blasticidin weerstand cassette21. We zagen sommige integratie van de blasticidin weerstand cassette op 5 dagen post transfectie; echter deze parasieten nooit hersteld van transfectie. Voor deze transfections, die we geselecteerd voor het uitdrukken van Cas9 plasmide met behulp van DSM1. Een andere selectie-methode, zoals de behandeling van transfected culturen met blasticidin S, alleen of in combinatie met DSM1, kan het verbeteren van de kansen van parasieten reappearing bij het gebruik van kortere homologie-regio's voor het herstellen van de Cas9/gRNA-geïnduceerde pauzes. In dit geval deed niet selecteren we met blasticidin S omdat we testen wilden of korte homologie wapens kunnen worden gebruikt in gevallen waar een drug weerstand cassette is niet geïntegreerd in het genoom, zoals wanneer een eiwit is wordt gecodeerd.
De belangrijkste onderdelen van het bewerken van CRISPR/Cas9-gen zijn besproken de endonuclease van de Cas9, de gRNA en het template van de reparatie. Beschrijven we een drie-plasmide aanpak in te voeren van deze componenten in de parasieten, waar Cas9, de gRNA en de reparatie-sjabloon in aparte plasmiden zijn gevonden. Naast deze benadering is ons lab geslaagd in het gebruik van een twee-plasmide aanpak waarin Cas9 en gRNA expressie worden gedreven door een enkele plasmide en de reparatie-sjabloon wordt gevonden in een tweede plasmide-3. Soortgelijke benaderingen van de twee-plasmide hebben ook met succes gewerkt door andere laboratoria voor het genereren van mutanten7,8,26,27,28,29. Anderzijds zijn verschillende labs met behulp van een stam van Plasmodium (NF54attB) die Cas9 en een T7 RNA-polymerase op station expressie van gRNAs30constitutively uitdrukt. In dit geval een één plasmide met de reparatie-sjabloon en de gRNA zijn transfected in NF54attB parasieten31,32. Tot slot is een plasmide-vrije benadering met behulp van een gezuiverde Cas9-gRNA-ribonucleoprotein-complex mutaties in het genoom, als goed33invoegen gebruikt. Het succes van deze verschillende benaderingen toont de flexibiliteit van de manieren waarin onderzoekers Cas9/gRNA componenten in de parasiet introduceren kunnen.
Tot slot, de keuze van de drug druk toe te passen op transfected parasieten kan worden gewijzigd, afhankelijk van de constructies gebruikt. Hier, laten we succesvolle generatie van mutanten door Transient te selecteren voor het uitdrukken van Cas9 plasmide met behulp van DSM1 tot parasieten weer. Voor het genereren van PfHsp70x knock-out parasieten, pfhsp70x werd vervangen door het menselijke dihydrofolate reductase gen en parasieten werden vervolgens geselecteerd met behulp van WR9921013. De recent beschreven vechtpartij TetR-PfDOZI-systeem is gebaseerd op de integratie van een plasmide die met een blasticidin S resistentie gen, waardoor voor selectie van parasieten met behulp van blasticidin S15,31.
Globaal, CRISPR/Cas9 gene bewerken van P. falciparum is gebleken dat een krachtig instrument in de malaria-onderzoek, en het protocol hier details de methoden voor het opwekken van voorwaardelijke vechtpartij mutanten3,7,8 , 13 , 20 , 28. dit protocol is hoogst aanpasbaar aan individuele belangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Muthugapatti Kandasamy bij de Universiteit van Georgia (UGA) Biomedische microscopie kern voor technische bijstand en Jose-Juan Lopez-Rubio voor het delen van de pUF1-Cas9 en pL6 plasmiden. Dit werk werd gesteund door bogen stichting awards te D.W.C. en te H.M.K., UGA opstarten middelen V.M., subsidies uit de maart van dubbeltjes Stichting (Basil O'Connor Starter geleerde Research Award) V.M. en ons National Institutes of Health grants (R00AI099156 en R01AI130139) naar V.M. en (T32AI060546) naar H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
