Summary
Descriviamo un metodo per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in Plasmodium falciparum utilizzando CRISPR/Cas9 editing genomico.
Abstract
La malaria è una causa significativa della morbosità e della mortalità in tutto il mondo. Questa malattia, che colpisce soprattutto coloro che vivono nelle regioni tropicali e subtropicali, è causata da infezione con parassiti del plasmodio . Lo sviluppo di farmaci più efficaci per combattere la malaria può essere accelerato da migliorare la nostra comprensione della biologia di questo parassita complesso. Manipolazione genetica di questi parassiti è la chiave per comprendere la loro biologia; Tuttavia, il genoma del p. falciparum è storicamente difficile da manipolare. Recentemente, è stato utilizzato CRISPR/Cas9 editing genomico in parassiti della malaria, consentendo per la proteina più semplice tagging, generazione di atterramenti proteina condizionale e delezione dei geni. L'editing genomico CRISPR/Cas9 ha dimostrato di essere un potente strumento per far progredire il campo della ricerca sulla malaria. Qui, descriviamo un metodo CRISPR/Cas9 per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in p. falciparum. Questo metodo è altamente adattabile ad altri tipi di manipolazioni genetiche, tra cui proteine tagging e knockout del gene.
Introduction
La malaria è una malattia devastante causata da protozoi parassiti del genere Plasmodium. P. falciparum, il parassita della malaria umana mortale la maggior parte, provoca circa 445.000 morti all'anno, principalmente in bambini sotto l'età di cinque1. Parassiti del plasmodio hanno un ciclo di vita intricato che coinvolgono un vettore zanzara e un ospite vertebrato. Gli esseri umani in primo luogo essere infettati quando una zanzara infetta prende un pasto di sangue. Quindi, il parassita invade il fegato dove cresce, si sviluppa e si divide per circa una settimana. Dopo questo processo, i parassiti vengono rilasciati nel flusso sanguigno, dove subiscono asessuale replica in globuli rossi (RBCs). Crescita dei parassiti all'interno di globuli rossi sono direttamente responsabili per i sintomi clinici associati con la malaria2.
Fino a poco tempo, produzione di transgenici da p. falciparum era un processo laborioso, che coinvolge diverse fasi di selezione della droga che ha preso molti mesi e aveva un alto tasso di fallimento. Questa procedura richiede molto tempo relieson la generazione di casuale del DNA si rompe nella regione di interesse e la capacità endogena del parassita per riparare il suo genoma però riparazione omologa3,4,5,6 . Recentemente, l'editing genomico cluster regolarmente intervallate palindromi Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) è stato correttamente utilizzato in falciparum del p.7,8. L'introduzione di questa nuova tecnologia nella ricerca sulla malaria è stato fondamentale per far progredire la comprensione della biologia di questi parassiti Plasmodium mortale. CRISPR/Cas9 permette di targeting specifico di geni attraverso guida RNAs (gRNAs) che è omologo al gene di interesse. Il gRNA/Cas9 complesso riconosce il gene attraverso il gRNA e Cas9 introduce quindi una rotture a doppio filamento, costringendo l'iniziazione dei meccanismi di riparazione nell'organismo9,10. P. falciparum manca il macchinario per riparare le rotture del DNA attraverso unirsi non-omologo fine, si utilizza meccanismi di ricombinazione omologa e integra modelli del DNA omologhe trasfettate per riparare il Cas9/gRNA-indotta rotture a doppio filamento11,12.
Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di mutanti condizionali atterramento in p. falciparum usando CRISPR/Cas9 editing genomico. Il protocollo viene illustrato l'utilizzo del ribozima glmS ai livelli della proteina in modo condizionale atterramento di PfHsp70x (PF3D7_0831700), uno chaperon esportati da p. falciparum in host RBCs13,14. Il ribozima glmS viene attivato dal trattamento con glucosamina (che viene convertito in glucosamina-6-fosfato in cellule) per fendere il suo mRNA associato, che conduce ad una riduzione della proteina14. Questo protocollo può essere facilmente adattato per utilizzare altri strumenti di atterramento condizionale, ad esempio domini di destabilizzazione o RNA aptameri4,5,15. I nostri dettagli del protocollo la generazione di un plasmide di riparazione che consiste di un ribozima emoagglutinina (HA) di tag e glmS sequenza fiancheggiato da sequenze di codificazione che sono omologhi al PfHsp70x open reading frame (ORF) e 3'-UTR. Inoltre descriviamo la generazione di un plasmide seconda espressione di unità del gRNA. Questi due plasmidi, insieme a un terzo che spinge espressione di Cas9, sono trasfettati in RBCs e utilizzati per modificare il genoma del p. falciparum parassiti. Infine, descriviamo una reazione a catena della polimerasi (PCR)-tecnica per verificare l'integrazione del ribozima tag e glmS basata. Questo protocollo è altamente adattabile per la modifica o la completa eliminazione di eventuali geni di p. falciparum , aumentando la nostra capacità di generare nuove intuizioni riguardanti la biologia del parassita della malaria.
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Protocol
Continua cultura di p. falciparum richiede l'uso di globuli rossi umani, e abbiamo utilizzato commercialmente acquistato unità di sangue che sono stati spogliati di tutti gli identificatori e resi anonimi. L'Institutional Review Board e l'ufficio di biosicurezza presso l'Università della Georgia esaminato i nostri protocolli e approvato tutti i protocolli utilizzati nel nostro laboratorio.
1. scegliere una gRNA sequenza
- Vai a CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) e seleziona ' Fasta Target'. Sotto 'Target', incollare le 200 coppie di basi dall'estremità 3' dell'open reading frame (ORF) di un gene e 200 paia di basi fin dall'inizio di 3'-UTR del gene. In 'In', selezionare 'P. falciparum' (3 7 v 3.0) e selezionare ' CRISPR/Cas9 ' sotto 'Using'. Fare clic su ' trovare siti di destinazione '.
- Selezionare una sequenza di gRNA le opzioni presentate, dando la preferenza al gRNA più efficiente che è più vicina al sito di modifica e che ha i minor numero siti fuori bersaglio.
Nota: Potenziali gRNA sequenze sono identificate perché sono immediatamente a Monte di un motivo adiacente Protospacer (PAM), che è necessaria per l'assunzione di Cas9 a DNA. La sequenza che viene duplicata in pMK-U6, il vettore che spinge gRNA espressione, è la 20 basi immediatamente a Monte del PAM. Il PAM specifico per Cas9 di S. pyogenes è la sequenza nucleotidica NGG e non devono essere inclusi nella sequenza che viene duplicata in pMK-U6.
Nota: CHOPCHOP truppa visivamente le sequenze gRNA, visualizzare le opzioni migliori in verde, le opzioni meno ideale in ambra e le opzioni peggiori in rosso. CHOPCHOP dà ogni sequenza gRNA un punteggio di efficienza che viene calcolato utilizzando i più aggiornati parametri trovati nella letteratura, e predicono fuori bersaglio siti che potrebbero essere riconosciuti dal gRNA. Due o tre sequenze di gRNA potrebbero essere necessario essere tentato di trovare il gRNA migliore adatto a un particolare gene. - È possibile acquistare la sequenza gRNA e suo inverso-complemento come oligos purificato per elettroforesi su Gel di poliacrilammide. La sequenza di gRNA utilizzata per destinazione PfHSP70x può essere trovata in Figura 1B.
Nota: Questa oligo dovrebbe includere 15 paia di basi omologa per il plasmide che esprimono gRNA, che sono necessari per la sequenza e la legatura-indipendente clonazione (SLIC) nel vettore pMK-U616.
2. clonazione gRNA sequenza in pMK-U6
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Digerire il pMK-U6 con BtgZI.
- Digest 10 μg di pMK-U6 con 5 μL di enzima BtgZI (5.000 unità/mL) per 3 ore a 60 ° C. Seguire il protocollo del produttore enzima per condizioni di reazione.
- Dopo il periodo di incubazione di 3 h, è possibile aggiungere un ulteriore 3 μL di BtgZI alla reazione per garantire la completa digestione del plasmide. Digerire per ulteriori 3 ore, sempre seguendo le istruzioni del produttore per garantire le condizioni di reazione corretta.
- Per purificare il pMK-U6 digeriti dalla reazione, utilizzare un kit di pulizia PCR basata su colonne secondo le istruzioni del produttore.
- Separare il DNA digerito utilizzando un gel di agarosio di 0,7% ed estrarre la band di 4.200-accoppiamenti.
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Tempri il oligos contenente la sequenza di gRNA.
- Ricostituire il pagina-purificato oligos ad una concentrazione di 100 μM utilizzando acqua priva di nucleasi.
- Unire 10 μL di ogni oligo con 2,2 μL di tampone di 10 x 2 (Vedi Tabella materiali). Assicurarsi che il volume di reazione totale è 22,2 μL.
- Eseguire il programma in un termociclatore di ricottura di gRNA: passo 1: 95 ° C, 10 min; Passo 2: 95 ° C, 1 s, con una riduzione della temperatura di 0,6 ° C/ciclo; Passo 3: andare al passaggio 2, 16 volte; Passo 4: 85 ° C, 1 min; passo 5: 85 ° C, 1 s, con una riduzione della temperatura di 0,6 ° C/ciclo; passaggio 6: andare al passaggio 5, 16 volte; Passo 7: 75 ° C, 1 min; passo 8: 75 ° C, 1 s, con una riduzione della temperatura di 0,6 ° C/ciclo; passaggio 9: andare al passaggio 8, 16 volte. Passaggi da 10 a 21: ripetere la procedura utilizzata nei passaggi 4 – 9 fino a quando la temperatura raggiunge i 25 ° C; passo 22:25 ° C, 1 min.
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Inserire i oligos ricotto gRNA nel plasmide BtgZI-digerito e gel-purificato pMK-U6.
- Combine 100 ng di pMK-U6 digerito con 1 μL di 10 x μL di tampone 2.1 e 3 dei oligos gRNA ricotto. Aumentare il volume a 9,5 μL con acqua priva di nucleasi.
- Aggiungere 0,5 μL della polimerasi di T4 e incubare la reazione a temperatura ambiente per 2,5 min.
- Spostare la reazione di ghiaccio e incubare per 10 min.
- Immediatamente trasformare 5 μL della reazione in competente e. coli secondo le istruzioni del fornitore di batteri. Piastra i batteri sui piatti di agar Lisogenesi brodo (LB) contenente 100 μg/mL Ampicillin.
- Consentire i batteri trasformati crescere a 37 ° C durante la notte, quindi selezionare colonie ed estrarre il DNA con un kit miniprep plasmide commercialmente disponibili.
3. progettazione di regioni di omologia del modello riparazione
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Progettazione scudo mutazioni all'interno del modello di riparazione di omologia per evitare ri-taglio del DNA che è integrato nel genoma.
Nota: Una mutazione di scudo in genere consiste nell'introdurre una mutazione silenziosa per alterare il PAM, in modo che Cas9 non indurrà una pausa nel modello di riparazione. Il PAM necessari per il Cas9 utilizzata nel presente protocollo è la sequenza di nucleotide "NGG", dove "N" è qualsiasi nucleotide. Se possibile, modificare uno dei nucleotidi G in un A, C o T.- Se il PAM non può essere mutato in silenzio, introdurre almeno 2 mutazioni silenti nelle 6 coppie di basi direttamente adiacente al PAM7,8.
Nota: Queste mutazioni saranno impedire il riconoscimento del modello riparazione dal gRNA e prevenire rimacinazione del locus riparato da Cas9/gRNA complesse. Le mutazioni di scudo possono essere introdotto nella regione di omologia di amplificare il DNA con gli iniettori che contengono la mutazione.
- Se il PAM non può essere mutato in silenzio, introdurre almeno 2 mutazioni silenti nelle 6 coppie di basi direttamente adiacente al PAM7,8.
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Amplificare la regione di omologia ORF per il modello di riparazione.
- Usando la PCR, amplificare 800 paia di basi da estremità 3' del ORF di gene dell'obiettivo. Progettare il primer che verrà utilizzato per escludere il codone di arresto da questo amplicon.
- Progettare il primer per l'inserimento di questo amplicon nel pHA -glmS ha stato digerito con Silvio e AfeI attraverso una reazione di legatura del DNA o SLIC16.
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Amplificare la regione di omologia di 3'-UTR per il modello di riparazione.
- Usando la PCR, amplificare le 800 coppie di basi, immediatamente dopo il codone di arresto del gene target. Disegnare primers per l'inserimento di questo amplicon nel pHA -glmS ha stato digerito con HindIII e NheI attraverso una reazione di legatura del DNA o SLIC16.
Nota: L'alto contenuto del genoma del p. falciparum può rendere l'amplificazione delle regioni quali l'UTR difficile. Un approccio alternativo all'utilizzo di PCR sta sintetizzando le regioni di omologia.
- Usando la PCR, amplificare le 800 coppie di basi, immediatamente dopo il codone di arresto del gene target. Disegnare primers per l'inserimento di questo amplicon nel pHA -glmS ha stato digerito con HindIII e NheI attraverso una reazione di legatura del DNA o SLIC16.
4. clonazione omologia regioni nel plasmide riparazione
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Inserire la regione di omologia ORF la pHA -glmS.
- Digerire il pHA -glmS con Silvio e AfeI, secondo le istruzioni del produttore degli enzimi. Inserire il prodotto PCR di ORF omologia regione nel plasmide digerito utilizzando SLIC16.
- Trasformare in competente Escherichia coli come eseguita in punti 2.3.4 e 2.3.5.
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Inserire la regione di omologia di 3'-UTR in un plasmide di pHA-glmS che già contiene la regione di omologia ORF (Vedi punto 4.1).
- Digerire il plasmide con HindIII e NheI secondo le istruzioni del produttore degli enzimi. Inserire l'amplicone di regione 3'-UTR omologia nel plasmide digerito utilizzando SLIC16.
- Trasformare in competente Escherichia coli ed estrarre il plasmide DNA (punti 2.3.4 e 2.3.5).
5. precipitazione del DNA per la transfezione
- Aggiungere 40 µ g di pMK-U6, pUF1-Cas9 e pHA -glmS DNA (per un totale di 120 µ g di DNA) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sterile.
- Aggiungere 1/10th il volume di DNA di 3M acetato di sodio in acqua (pH 5.2) nella provetta e mescolare bene con un vortex (ad esempio, se il volume nel passaggio 5.1 era 100 μL, aggiungere 10 μL di acetato di sodio).
- Aggiungere 2,5 volte il volume di etanolo al 100% nella provetta e mescolare bene con un vortex per almeno 30 s (ad esempio, se il volume in 5.1 era 100 μL, aggiungere 250 µ l di etanolo al 100%).
- Porre la provetta in ghiaccio o a-20 ° C per 30 min.
- Centrifugare la provetta a 18.300 x g per 30 min a 4 ° C.
- Rimuovere con cautela il surnatante dal tubo. Non disturbare il pellet.
- Aggiungere 3 volte il volume di etanolo al 70% al tubo e mescolare brevemente con un vortex (ad es., se il volume in 5.1 era 100 μL, aggiungere 300 µ l di etanolo al 70%).
- Centrifugare la provetta a 18.300 x g per 30 min a 4 ° C.
Nota: Questo passaggio deve essere eseguito in condizioni di sterilità in una cappa di sicurezza biologica. - Rimuovere con cautela il surnatante dal tubo. Non disturbare il pellet. Lasciare aperto il tubo e lasciar asciugare all'aria per 15 min il pellet.
- Conservare il DNA precipitato a-20 ° C fino a quando non è necessario per la transfezione.
6. isolamento umano RBCs da sangue intero in preparazione per la transfezione
- Aliquota sangue fresco in provette coniche da 50 mL sterile (circa 25 mL per tubo).
- Centrifugare le provette a 1.088 x g per 12 min, con freni centrifuga impostati su 4.
- Aspirate fuori il surnatante e buffy coat. Risospendere il pellet di RBC con un volume uguale di RPMI incompleta.
Nota: Incomplete RPMI è preparato completando RPMI 1640 con 10,32 timidina μM, 110,2 ipoxantina μM, piruvato di sodio 1 mM, 30 mM bicarbonato di sodio, 5 mM HEPES, 11,1 millimetri di glucosio e gentamicina 0,02% (v/v). - Ripetere i passaggi da 6.2 – 6.3 due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i globuli rossi in un volume uguale di RPMI incompleta e conservare i capillari a 4 ° C.
7. trasfettando RBCs con i plasmidi CRISPR/Cas9 (per essere fatto in modo asettico)
Nota: P. falciparum culture sono mantenute come descritto in altri rapporti17. Mantenere tutte le culture a 37 ° C sotto il 3% O2, 3% CO2e 94% N2 salvo diversa indicazione. Ogni volta che il sangue è utilizzata nel presente protocollo, si riferisce ai globuli rosso puri preparati nel passaggio 6. Il sangue utilizzato non deve essere più vecchio di 6 settimane, come c'è in genere una diminuzione nella proliferazione del parassita nel sangue più anziani. I passaggi seguenti descrivono RBCs pre-caricamento con il DNA e l'aggiunta di una cultura di parassita alle cellule trasfettate. Altri protocolli di transfezione stabiliti sono compatibili con questi costrutti18,19di trasfezione.
- Preparare un tampone x cytomix 1 in acqua (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10mm K2HPO4, 25mm HEPES, pH 7,6). Filtro-sterilizzare il buffer utilizzando un filtro di 0,22 μm.
- Aggiungere 380 μL della cytomix 1x al DNA precipitato nel passaggio 5 e vortexare per sciogliere. Consentire il DNA da sciogliere nella cytomix 1x per 10 minuti, Vortex ogni 3 min per 10 s.
- In una provetta conica sterile 15 mL, unire 300 μL di globuli rossi (50% ematocrito, dal passaggio 6) nel RPMI incompleta con 4 mL di 1x cytomix.
- Centrifugare i globuli rossi dal punto 7.3 a 870 x g per 3 minuti e quindi rimuovere il supernatante dal pellet RBC.
- Risospendere il pellet di RBC con la miscela di DNA/cytomix dal punto 6.2 e trasferirlo in una cuvetta di elettroporazione di 0,2 cm.
- Electroporate globuli rossi utilizzando le seguenti condizioni: 0,32 kV, 925 μF, capacità impostata su "High Cap" e resistenza impostata su "Infinito".
- A seguito di elettroporazione, trasferire il contenuto dalla cuvette di 15 mL conica contenente 5 mL di RPMI completo (cRPMI). Centrifugare la provetta a 870 x g per 3 min a 20 ° C e quindi decantare il supernatante.
Nota: cRPMI è preparato tramite lo stesso metodo come incompleta RPMI con l'aggiunta di albumina di siero bovino di 0.25% (p/v) ricca di lipidi. - Risospendere il pellet in 4 mL di cRPMI e trasferimento in un pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti. Aggiungere 400 μL di una cultura alta-schizonte (7 – 10% schizonte parassitemia è ideale) ai globuli rossi trasfettate.
Nota: La parassitemia è definita come la percentuale di globuli rossi infettati dal parassita. - Il giorno successivo, lavare la cultura con 4 mL di cRPMI. Centrifugare la coltura a 870 x g per 3 min e aspirare il supernatante. Risospendere la cultura in 4 mL di cRPMI.
- 48 ore dopo aver completato il passaggio 7.6, lavare la cultura con 4 mL di cRPMI. Quindi Risospendere la cultura in cRPMI contenente 1 μM DSM1 per selezionare per il plasmide Cas9.
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Continuare a lavare le culture ogni giorno con cRPMI fino a quando i parassiti non sono più visibili di striscio di sangue. Dopo questo punto, sostituire il terreno di coltura fresco cRPMI Plus 1 μM DSM1 ogni 48 h.
- Per rendere un sangue striscio, aggiungere 150 μL di coltura in una provetta da centrifuga 0,6 mL. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 1.700 x g per 30 s.
- Aspirare il sovranatante. Utilizzare una pipetta per trasferire le cellule pellettate a una lastra di vetro. Utilizzando una seconda lastra di vetro tenuta ad un angolo di 45° alla prima diapositiva, striscio la goccia di sangue. Macchia la diapositiva utilizzando un kit di colorazione commercialmente disponibile secondo il protocollo del produttore.
- Mostra i parassiti utilizzando un 100x obiettivo a immersione in olio.
- A partire da 5 giorni post-transfezione (punto 7.6), rimuovere da 2 mL della cultura con RBCs risospese in terreno di coltura. Aggiungere posteriore 2 mL di terreno nuovo (cRPMI plus 1 μM DSM1) e nel sangue 2% ematocrito. Aggiungere sangue fresco in questo modo una volta a settimana fino a riappaiono i parassiti, come determinato da striscio di sangue sottile (passo 7.11).
Nota: Se l'integrazione viene eseguita correttamente, parassiti generalmente riappaiono nella cultura di un mese post-transfezione. - Una volta che i parassiti riemergere, rimuovere DSM1 farmaco pressione. In alternativa, rimuovere la pressione di droga dopo che i parassiti sono stati clonati fuori.
8. controllo parassiti per l'integrazione del modello di riparazione
- Quando i parassiti sono visibili ancora per sbavatura di anima sottile, isolare il DNA dalla cultura utilizzando un apposito kit.
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Utilizzare la PCR per amplificare la regione modificata del genoma per determinare se il luogo di destinazione è stato modificato con successo e il locus di selvaggio-tipo non modificato (indicativo di selvaggio-tipo parassiti) è rilevabile.
- Per rilevare i parassiti che hanno integrato il modello di riparazione, utilizzare un primer in avanti che si trova all'inizio del ORF, di fuori della regione di omologia clonato. Utilizzare un primer inverso che si siede in 3'-UTR.
Nota: Questa amplificazione include le sequenze del tag HA e glmS ribozima, ampliconi di parassiti integrati sarà più lungo della stessa regione amplificata nel selvaggio-tipo parassiti.
- Per rilevare i parassiti che hanno integrato il modello di riparazione, utilizzare un primer in avanti che si trova all'inizio del ORF, di fuori della regione di omologia clonato. Utilizzare un primer inverso che si siede in 3'-UTR.
9. clonazione parassiti limitando la diluzione
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Effettuare diluizioni seriali della cultura parassita dal passaggio 7.13 per ottenere una concentrazione finale di 0,5 parassiti/200 μL. Aggiungere 200 μL della cultura diluito nei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti.
Nota: Poiché la parassitemia è definita come la percentuale di globuli rossi infetti e l'ematocrito è anche un numero definito (2%), facilmente si deduce che il numero di parassiti per unità di volume.- Preparare 1 mL di coltura in cRPMI al 5% parassitemia e 2% ematocrito (a questi livelli di parassitemia e l'ematocrito, la cultura contiene 1 x 107 parassiti/mL).
- Diluire questa cultura di 1: 100 con cRPMI. Nuovo diluire 1: 100 con cRPMI.
- Diluire 1: 400. Eseguire questa diluizione aggiungendo 62,5 μL della cultura a 25 mL di cRPMI e 1 mL di sangue. Questa diluizione conseguente alla concentrazione desiderata di 0,5 parassiti/200 μL.
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Mantenere la clonazione piastra fino a quando i parassiti sono rilevabili nei pozzetti.
- Ogni 48 h, sostituire il mezzo della piastra a 96 pozzetti con medium fresco.
- Una volta a settimana, a partire da 5 giorni dopo l'inizio della piastra clonazione (punto 9.1), rimuovere 100 μL da ogni pozzetto e aggiungere indietro 100 μL di sangue (2% ematocrito) + mezzo fresco.
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Identificare eventuali pozzetti contenenti i parassiti.
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti ad un angolo di 45° per circa 20 min, permettendo al sangue di stabilirsi in un angolo all'interno della placca.
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un light box. Si noti che i pozzetti contenenti parassiti contengono media che è di colore giallo a colore, rispetto ai media rosa pozzetti esenti da parassita, a causa dell'acidificazione del mezzo dai parassiti.
- Utilizzando una pipetta sierologica, spostare il contenuto dei pozzetti contenenti parassita ad una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti per consentire l'espansione la parassitemia.
- Usando l'analisi PCR come descritto nel passaggio 8, controllare queste linee clonali parassita per l'integrazione corretta.
10. knockdown della proteina trattando i parassiti con glucosamina e conferma tramite analisi Western Blot
- Preparare una soluzione stock di GlcN (glucosamina) 0,5 M, che possa essere conservata a-20 ° C.
- Aggiungere GlcN alle culture glmS parassita e consentire loro di crescere in presenza di GlcN.
Nota: La concentrazione finale e la tempistica del trattamento GlcN dipende la linea esperimento e parassita. GlcN può influire sulla crescita del parassita, così il ceppo parentale parassita deve essere esposta a una gamma di GlcN concentrazioni per determinare la sensibilità al composto. Spesso, una concentrazione di 2.0-7.5 millimetri GlcN è usato13,14,20. - Isolare i campioni della proteina dai parassiti GlcN-trattati13.
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Utilizzare campioni di proteine per l'analisi western blot per rilevare riduzioni nella proteina13.
- Utilizzare un anticorpo anti-HA secondo le istruzioni del produttore per rilevare la proteina HA-glmS-etichetta. Confrontare la band HA a un controllo di carico, ad esempio PfEF1α.
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Representative Results
Uno schema dei plasmidi utilizzati in questo metodo, così come un esempio di una mutazione di scudo sono mostrati nella Figura 1. Come un esempio di come identificare parassiti mutanti dopo trasfezione, risultati da PCRs per controllo integrazione del costruttoglmS ettari - sono riportati in Figura 2. Un'immagine rappresentativa di una piastra di clonazione è illustrata nella Figura 3 per dimostrare il cambiamento di colore del mezzo in presenza di parassiti. I risultati di un'analisi di immunofluorescenza e western blotting esperimenti sono illustrati nella Figura 4 per dimostrare la funzionalità del prodotto tag HA e glmS-riduzione delle proteine nei parassiti. Figura 5 dimostra l'incapacità delle armi di omologia breve sui prodotti PCR per modificare il genoma del parassita e ottenere mutanti praticabile.
Figura 1: riepilogo del nostro approccio di tre-plasmide CRISPR/Cas9 e esempi di una mutazione di oligo e scudo di gRNA. (A) schemi di pHA-glmS vuota e pMK-U6 è indicati con i siti di restrizione enzima utilizzati per la clonazione. Anche mostrato sono pHA-glmS e pMK-U6 dopo le braccia di omologia e gRNA sequenze sono stati clonati in loro, rispettivamente. Per concludere, pUF1-Cas9 è indicato. yDHOD = diidrofolato reduttasi di lievito, l'indicatore di resistenza per DSM1. (B) l'oligo avanti utilizzato per la clonazione della sequenza di gRNA PfHsp70x in pMK-U6 viene mostrato, con la sequenza di gRNA in lettere maiuscole e le braccia di omologia pMK-U6 necessarie per la clonazione in lettere minuscole (in alto). La genomica destinazione il gRNA PfHsp70x è indicata come il PAM a valle, in rosso (medio). La mutazione di scudo nel gRNA PfHsp70x PAM è indicata in rosso (in basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schematico di modificazione del genoma CRISPR/Cas9 utilizzando pHA-glmS e una strategia per la conferma integrazione. (A) Cas9, improntata a un locus genomico una gRNA, induce una pausa doppio filamento del DNA. Il parassita ripara i danni attraverso doppio crossover omologa riparazione, utilizzando il plasmide di pHA-glmS come modello e introducendo la sequenza di HA-glmS nel genoma. PCR (B), un test per individuare la corretta integrazione della sequenza HA-glmS. Utilizzando primer P1 e P2, 3' ORF di selvaggio-tipo PfHsp70x e PfHsp70x -glmS mutanti sono amplificati13. L'amplicone da PfHsp70x-glmS è più lungo di selvaggio-tipo a causa di inserimento della sequenza HA-glmS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: identificazione di pozzetti contenenti parassiti in una piastra a 96 pozzetti clonazione. (A) la piastra a 96 pozzetti è impostata ad un angolo di 45 ° per circa 20 minuti per permettere al sangue di stabilirsi in un angolo della piastra. (B) il pozzo sulla sinistra contiene una cultura di parassita, indicata dal colore giallo del mezzo rispetto il mezzo rosa del parassita-free bene sulla destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: un'analisi di immunofluorescenza Mostra la corretta codifica HA di PfHsp70x e macchiare occidentale Mostra la riduzione dei livelli della proteina di PfHsp70x durante il trattamento con glucosamina. (A) PfHsp70x -glmS parassiti erano fissi e macchiati con DAPI (marcatore di nucleo) e anticorpi anti-HA e MAHRP1 (membrana associati istidina Rich Protein 1, un marcatore dell'esportazione della proteina per l'host RBC)13. (B) PfHsp70x -glmS parassiti sono stati trattati con glucosamina 7,5 mM, e tutto-parassita lisati sono stati utilizzati per Western blotting analisi13. La membrana è stata sondata con gli anticorpi per HA e PfEF1α come un carico di controllo13. Come previsto, trattamento della glucosamina è provocato da una riduzione della proteina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: utilizzando sequenze di omologia breve per riparazione. (A) rappresentazione schematica che mostra a eliminazione diretta di GFP in B7 parassiti21. B7 parassiti sono un derivato di 3 7 in cui Plasmepsin II è stato taggato con GFP. Prodotti di PCR contenente 50, 75 o 100 paia di basi delle regioni di omologia GFP che fiancheggiano una cassetta di resistenza di Dyfed S (contrassegnata come "marker"), insieme a pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, un plasmide esprimente Cas9 e una gRNA GFP, transfected in B7 parassiti. Ogni transfezione è stata effettuata due volte. DSM1 farmaco pressione era applicata 2 giorni post-transfezione. (B) mostrato qui sono le prove di PCR su DNA isolato dai parassiti trasfettate 5 giorni post-transfezione e post-transfezione 2 mesi. Primer utilizzato per testare l'integrazione della cassetta BSD resistenza produrrà un prodotto 584-accoppiamenti per parassiti parentali B7 e un prodotto di coppie di basi 2020 per i parassiti che hanno integrato il marcatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'implementazione di CRISPR/Cas9 a p. falciparum ha aumentato l'efficienza di sia diminuito la quantità di tempo necessario per la modifica del genoma del parassita, rispetto ai precedenti metodi di manipolazione genetica. Questo protocollo completo vengono delineati i passaggi necessari per la generazione di mutanti condizionali utilizzando CRISPR/Cas9 a p. falciparum. Mentre il metodo qui è orientato in modo specifico per la generazione di ettari -glmS mutanti, questa strategia può essere adattata per una varietà di esigenze, tra cui il tagging di geni, knockout del gene e l'introduzione di mutazioni puntiformi.
Un passaggio fondamentale presto in questo protocollo è la selezione di una sequenza di gRNA. Quando si seleziona una gRNA, ci sono diversi punti da considerare come dove siede il gRNA, come efficiente è, e se non ha il potenziale per gli effetti fuori bersaglio. La sequenza di gRNA dovrebbe essere più vicina possibile al sito di modificazione, idealmente entro 200 paia di basi. Questo riduce la probabilità che i parassiti utilizzando il modello di riparazione risolvere il loro genoma senza integrare il tag. Lo strumento utilizzato qui per individuare il gRNA è un servizio online gratuito chiamato CHOPCHOP22. Un altro strumento online, eucariotiche patogeno CRISPR Guida strumento di progettazione di RNA/DNA (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/), può anche essere usato23. EuPaGDT fornisce ulteriore caratterizzazione di sequenze gRNA, tra cui la previsione di colpi fuori bersaglio e potenziali problemi che potrebbero impedire la trascrizione del gRNA. EuPaGDT ha anche strumenti per l'elaborazione batch di gRNAs per indirizzare più geni o interi genomi. Il gRNA selezionato deve essere uno che si siede più vicino al sito di modifica con la massima efficienza e minimi fuori bersaglio colpisce. Una limitazione importante di CRISPR/Cas9 gene editing che può sorgere è l'incapacità di progettare una gRNA adatto per indirizzare il gene di interesse. In tali casi, potrebbe essere necessario un approccio di prova-e-errore, utilizzando sequenze multiple di gRNA sub-ottimale fino a trovata l'opzione migliore, e successo gene editing si è verificato.
Un altro fattore importante da considerare durante la generazione di mutanti di falciparum del p. utilizzando CRISPR/Cas9 è la lunghezza delle regioni omologia utilizzato nel modello di riparazione. Questo protocollo raccomanda che le regioni di omologia dovrebbero essere circa 800 paia di basi ogni, ma abbiamo anche avuto successo nell'utilizzo di piccole regioni numerazione 500 paia di basi3. Modificazione del genoma successo con CRISPR/Cas9 e breve omologia braccia su prodotti PCR sono stati usati anche in altri protozoi parassiti come il Toxoplasma gondii e Trichomonas vaginalis24,25. Abbiamo testato la possibilità di utilizzare più piccole armi di omologia su prodotti di PCR (50, 75 o 100 paia di basi) tentando di knockout GFP in B7 parassiti utilizzando una cassetta di resistenza Consciousness21. Abbiamo visto alcuni integrazione della cassetta Consciousness resistenza alle 5 giorni post transfezione; Tuttavia, questi parassiti mai ripreso dalla transfezione. Per questi transfezioni, abbiamo selezionato per il plasmide Cas9-esprimendo utilizzando DSM1. Un metodo di selezione diverse, come ad esempio il trattamento di colture transfettate con Consciousness S da solo o in combinazione con DSM1, può migliorare le probabilità di parassiti riapparire quando si utilizzano più brevi regioni di omologia per riparare le rotture Cas9/gRNA-indotta. In questo caso, non abbiamo scelto con Consciousness S dato che abbiamo voluto testare se armi di omologia breve potrebbero essere utilizzati in casi in cui una cassetta di resistenza di droga non è essere integrata nel genoma, ad esempio quando una proteina è essere taggata.
I componenti di base di CRISPR/Cas9 gene editing discusse sono le endonucleasi Cas9, il gRNA e il modello di riparazione. Descriviamo un metodo di tre-plasmide per introdurre i parassiti, dove si trovano in plasmidi separati Cas9, il gRNA e il modello di riparazione di questi componenti. Oltre a questo approccio, il nostro laboratorio ha avuto successo nell'utilizzo di un approccio di due-plasmide in cui espressione Cas9 e gRNA sono guidati da un plasmide singolo e il modello di riparazione viene trovato in un plasmide secondo3. Approcci simili due-plasmide hanno anche stati impiegati con successo da altri laboratori per generare mutanti7,8,26,27,28,29. Inoltre, diversi laboratori utilizza un ceppo di Plasmodium (NF54attB) che esprime costitutivamente Cas9 e una T7 RNA polimerasi all'espressione di unità di gRNAs30. In questo caso, un singolo plasmide contenente il modello di riparazione e il gRNA transfected in NF54attB parassiti31,32. Infine, un approccio privo di plasmide utilizzando una ribonucleoproteina Cas9-gRNA purificata complessa è stato utilizzato per inserire le mutazioni nel genoma, come ben33. Il successo di questi diversi approcci dimostra la flessibilità dei metodi in cui i ricercatori possono introdurre componenti Cas9/gRNA in parassita.
Infine, la scelta della pressione di droga da applicare ai parassiti transfected può essere modificata, a seconda di costrutti utilizzati. Qui, indichiamo successo generazione di mutanti selezionando transitoriamente per il plasmide Cas9-esprimendo usando DSM1 fino a riappaiono di parassiti. Per generare i parassiti PfHsp70x Ko, pfhsp70x è stato sostituito con il gene della riduttasi del dihydrofolate umano e parassiti sono stati quindi selezionati usando WR9921013. Il sistema di atterramento TetR-PfDOZI recentemente descritto si basa sull'integrazione di un plasmide contenente un gene di resistenza di Dyfed S, permettendo per la selezione dei parassiti utilizzando Consciousness S15,31.
Nel complesso, CRISPR/Cas9 gene editing di p. falciparum ha dimostrato di essere un potente strumento di ricerca sulla malaria e il protocollo qui i dettagli i metodi per la generazione di mutanti condizionali atterramento3,7,8 , 13 , 20 , 28. il presente protocollo è altamente adattabile agli interessi di ricerca individuale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Muthugapatti Kandasamy presso il nucleo di microscopia biomedica Università della Georgia (UGA) per l'assistenza tecnica e Jose-Juan Lopez-Rubio per aver condiviso i plasmidi pUF1-Cas9 e pL6. Quest'opera è stata sostenuta da archi Foundation Award di D.W.C. e di H.M.K., concede fondi avvio UGA di V.M., sovvenzioni da marzo di Dimes Foundation (Basil o ' Connor Starter Scholar Research Award) di V.M. e US National Institutes of Health (R00AI099156 e R01AI130139) di V.M. e (T32AI060546) a H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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