Summary
Biz glmSoluşturmak için bir yöntem tarif- Plasmodium falciparum CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak koşullu devirme mutantlar dayalı.
Abstract
Sıtma morbidite ve mortalite dünya çapında önemli bir nedenidir. Öncelikle tropikal ve subtropikal bölgelerde yaşayanlar etkiler, bu hastalığı enfeksiyon için Plasmodium parazit neden olur. Daha etkili mücadele sıtma ilaçlara gelişimi bu karmaşık parazit biyoloji anlayışımız geliştirerek hızlandırılabilir. Bu parazitler genetik manipülasyon biyolojilerinin anlama anahtarıdır; Ancak, tarihsel olarak P. falciparum genom işlemek zor olmuştur. Son zamanlarda, sıtma parazit, etiketleme, koşullu protein nakavtlar nesil ve silme genlerin daha kolay protein için izin içinde CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 genom düzenleme alanı sıtma araştırmanın ilerleyen için güçlü bir araç olduğu ispatlanmıştır. Burada, glmSüretmek için CRISPR/Cas9 yöntemi açıklamak- P. falciparumkoşullu devirme mutantlar dayalı. Bu yöntem son derece gen basılmasını ve genetik manipülasyon, protein etiketleme de dahil olmak üzere, diğer türleri için uyarlanabilir.
Introduction
Sıtma Plasmodiumcinsi protozoon parazitler tarafından neden yıkıcı bir hastalıktır. P. falciparum, en ölümcül insan sıtma parazit, her yıl, yaklaşık 445.000 ölümler çoğunlukla beş1yaşın altındaki çocuklarda neden olur. Plasmodium parazitleri bir sivrisinek vektör ve omurgalı bir ana bilgisayar içeren karmaşık bir yaşam döngüsü var. Ne zaman virüslü bir sivrisinek bir kan yemek alır insanlar ilk bulaşabilir. O zaman, parazit nerede büyür, gelişir ve yaklaşık bir hafta için böler karaciğer işgal etti. Bu işlem sonra parazitleri kan dolaşımına nerede kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) eşeysiz çoğaltma geçmesi, serbest bırakılır. Büyüme parazit RBCs içinde sıtma2ile ilişkili klinik belirtiler doğrudan sorumlu.
Yakın zamana kadar transgenik P. falciparum üretim zahmetli bir süreç, birkaç tur birçok ay sürdü ve yüksek başarısızlık oranı olan ilaç seçimi içeren oldu. Bu zaman alan yordamı relieson rasgele DNA nesil bölgenin ilgi ve parazit endojen yeteneğine rağmen genomunu onarmaya tatili homolog onarım3,4,5,6 . Son zamanlarda, kümelenmiş düzenli olarak Interspaced palindromik tekrar/Cas9 (CRISPR/Cas9) genom düzenleme başarıyla P. falciparum7,8' kullanılmıştır. Bu yeni teknoloji sıtma araştırma giriş yapılmış bu ölümcül Plasmodium parazitler biyoloji anlayış ilerleyen için kritik. CRISPR/Cas9 Kılavuzu RNA'ların (gRNAs) faiz gen için homolog genlerin özel hedefleme için sağlar. GRNA/Cas9 karmaşık gen gRNA yoluyla tanır ve Cas9 sonra tamir mekanizmaları organizma9,10inisiyasyon zorlama iki iplikçikli mola tanıtır. P. falciparum homolog olmayan son katılma yoluyla DNA sonları onarmak için makine eksik olduğundan, Homolog rekombinasyon mekanizmaları kullanır ve Cas9/gRNA-indüklenen onarmak için transfected homolog DNA şablonları entegre iki iplikçikli ara11,12.
Burada, bir protokol P. falciparum koşullu devirme mutantların üretimi için CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak mevcut. Protokol glmS ribozyme PfHsp70x koşullu olarak devirme protein düzeyleri için kullanımı gösterilmiştir (PF3D7_0831700), bir koruyucuya ihraç P. falciparum tarafından ev sahibi RBCs13,14. GlmS ribozyme (ki glucosamine-6-fosfat hücrelerdeki dönüştürülür) glucosamine ile tedavi tarafından protein14bir azalma önde gelen onun ilişkili mRNA ayırmak için etkinleştirilir. Bu iletişim kuralı kolayca istikrarsızlık etki alanları veya RNA aptamers4,5,15gibi diğer koşullu devirme araçlarını kullanmak için adapte edilebilir. Bizim iletişim kuralı dizileri tarafından çevrili sıra kodlama hemagglutinin (HA) etiketi ve glmS ribozyme oluşan bir onarım plazmid nesil bu PfHsp70x açık okuma çerçevesi (ORF) ve 3' UTR homolog ayrıntılardır. Ayrıca gRNA sürücü ifade için ikinci bir plazmid nesil açıklar. Bir ifade Cas9, sürücüler üçüncü ile birlikte bu iki plazmit RBCs transfected ve P. falciparum parazitler genom değiştirmek için kullanılır. Son olarak, biz bir polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarif-entegrasyon-in etiket ve glmS ribozyme doğrulamak için teknik dayalı. Bu son derece uyarlanabilir ve/veya sıtma parazit biyoloji yeni görüşler üretmek için bizim yetenek geliştirme herhangi bir P. falciparum genlerin tam nakavt için iletişim kuralıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
P. falciparum sürekli kültür insan RBCs kullanımı gerektirir ve biz ticari satın alınan ünite kan tüm tanımlayıcıları çıkardı ve anonimleştirilir faydalanır. Kurumsal değerlendirme Komitesi ve biyogüvenlik Office Georgia Üniversitesi, bizim protokolleri gözden geçirilmiş ve onaylanmış bizim laboratuarda kullanılan tüm iletişim kuralları.
1. bir gRNA sıra seçimi
- CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) gidin ve ' Fasta hedef 'seçin. 'Hedef'altında 200 baz çifti 3' sonundan itibaren açık okuma çerçevesi bir genin (ORF) ve 200 baz çifti başlar, Gen 3' UTR-yapıştırın. 'In'altında 'P. falciparum' seçin (3D 7 v3.0) ve ' CRISPR/Cas9 ' 'Using'altında seçin. Sonra ' hedef siteleri bulmak 'tıklayın.
- Bir gRNA serisi bu değişiklik siteye en yakın ve en az sayıda hedef kapalı siteleri olan en verimli gRNA vererek sunulan seçenekler arasından seçin.
Not: DNA Cas9 alımı için gereken bir Protospacer bitişik motifi (PAM in), hemen ters yönde oldukları için potansiyel gRNA dizileri tanımlanır. PMK-U6 gRNA ifade, sürücüler vektör klonlanmış sıra 20 üsleri olduğunu hemen ters yönde, PAM. S. pyogenes Cas9 için belirli PAM nükleotid dizisi NGG ve pMK-U6 klonlanmış sıra dahil edilmemesini.
Not: CHOPCHOP görsel olarak gRNA dizileri, yeşil, daha az ideal seçenekler, amber ve kırmızı en kötü seçeneklerinde en iyi seçenekleri görüntüleme yer alıyor. CHOPCHOP her gRNA sıra literatürde bulunan en güncel parametreler kullanılarak hesaplanır bir verimlilik puan verir ve onlar gRNA tarafından tanınan hedef kapalı siteleri tahmin. İki ya da üç gRNA dizileri için belirli bir gen uygun gRNA en iyi bulmak için denenmesi gerekebilir. - GRNA sıra ve tersi tamamlayıcı Polyacrylamide jel elektroforez saf oligos satın alabilirsiniz. Hedef PfHSP70x kullanılan gRNA sırası Şekil 1Badımında bulunabilir.
Not: Bu oligo 15 sıra ve ligasyonu bağımsız (dilim) pMK-U6 vektör16klonlama için gerekli olan çift gRNA ifade plazmid için homolog içermelidir.
2. gRNA sıra pMK-U6 içine klonlama
-
BtgZI ile pMK U6 sindirmek.
- PMK-U6 Özet 10 μg 5 μL 60 ° C'de 3 h için BtgZI enzim (5000 adet/mL) ile Enzim üreticinin Protokolü reaksiyon koşulları için izleyin.
- 3 h kuluçka dönemi sonra BtgZI bir ek 3 μL plazmid tam sindirim sağlamak için tepki ekleyin. Bir ek 3 h, hala doğru reaksiyon koşulları sağlamak için üreticinin yönergelerini takip için sindirmek.
- Sindirilir pMK U6 reaksiyon gelen arındırmak için üreticinin yönergelerine göre sütunlara göre PCR temizleme seti kullanın.
- % 0.7 özel jel kullanarak sindirilir DNA ayırmak ve 4200-baz çifti grup ayıklayın.
-
GRNA sıra içeren oligos tavlamak.
- 100 μM nükleaz ücretsiz su kullanarak bir konsantrasyon için sayfa saf oligos sulandırmak.
- Her oligo 10 μL 10 x arabellek ( Tablo malzemelerigörmek) 2 2.2 μL ile birleştirin. Toplam reaksiyon birim 22,2 μL olduğundan emin olun.
- Bir thermocycler programda tavlama gRNA çalıştırın: adım 1: 95 ° C, 10 min; Adım 2: 95 ° C, 1 0.6 sıcaklık bir azalma ile s ° C/döngüsü; Adım 3: adım 2, 16 kere; git Adım 4: 85 ° C, 1 dk; Adım 5: 85 ° C, 1 s, sıcaklık bir azalma 0,6 ° C/döngüsü; Adım 6: adım 5, 16 kere; gidin Adım 7: 75 ° C, 1 dk; Adım 8: 75 ° C, 1 0.6 sıcaklık bir azalma ile s ° C/döngüsü; Adım 9: 16 kez adım 8, git. Adım 10-21: sıcaklık 25 ° C; ulaşıncaya kadar 4 – 9 adımda kullanılan yordamı yineleyin adım 22:25 ° C, 1 dak.
-
Tavlanmış gRNA oligos BtgZI sindirilmiş ve jel saf pMK U6 plazmid yerleştirin.
- Sindirilir pMK-U6 birleştirmek 100 ng 10 arabellek 2.1 ve 3 μL tavlanmış gRNA oligos, x 1 μL ile. Nükleaz ücretsiz su ile 9.5 μL birime artırın.
- T4 polimeraz 0.5 μL ekleyin ve reaksiyon 2.5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Buz ve 10 dakikadır kuluçkaya tepki taşıyın.
- Hemen tepki yetkili E. coli bakteri üreticinin yönergelerine uygun içine 5 μL dönüşümü. Lysogeny suyu (LB) ağar kaplamalar 100 μg/mL ampisilin içeren bakteri plaka.
- 37 ° C'de bir gecede büyümek sonra kolonileri seçin ve DNA ile bir piyasada bulunan plasmid miniprep kit ayıklamak dönüştürülmüş bakteri izin.
3. Homoloji bölgelerinde onarım şablon tasarımı
-
Tasarım kalkan mutasyonlar genom entegre DNA'ın yeniden kesme önlemek için Homoloji onarım şablon içinde.
Not: Cas9 bir ara onarım şablon ile teşvik değil PAM değiştirmek için sessiz bir mutasyon tanıtan bir kalkan mutasyon genellikle oluşur. Bu protokol için kullanılan Cas9 nükleotid dizisi "NGG", "N" herhangi bir nükleotit nerede için PAM gerekli. Mümkünse, bir A, C veya t G nükleotit birini değiştirmek- PAM'yi sessizce mutasyona uğramış olamaz Eğer PAM7,8' e bitişik 6 baz çifti içine en az 2 Sessiz mutasyonlar tanıtmak.
Not: Bu mutasyonlar onarım şablon tanınması gRNA tarafından önlemek ve Cas9/gRNA tarafından onarılan locus karmaşık yeniden kesme önlemek. Kalkan mutasyonlar Homoloji bölgeye DNA mutasyon içeren astar ile yükseltecek tarafından tanıttı olabilir.
- PAM'yi sessizce mutasyona uğramış olamaz Eğer PAM7,8' e bitişik 6 baz çifti içine en az 2 Sessiz mutasyonlar tanıtmak.
-
ORF Homoloji bölge onarım şablon için yükseltmek.
- PCR kullanarak, 800 baz çifti 3' sonundan itibaren hedef Gene'in ORF yükseltmek. Bu amplicon kodonu dışlamak için kullanılan astar tasarım.
- Bu amplicon SacII ve AfeI ile DNA ligasyonu tepki veya dilim16yoluyla sindirilmiş pHA -glmS içine ekleme için astar tasarım.
-
3' UTR Homoloji bölge onarım şablon için yükseltmek.
- PCR kullanarak, hemen ardından kodonu hedef gen 800 baz çifti yükseltmek. Bu amplicon HindIII ve NheI ile bir DNA ligasyonu tepki veya dilim16üzerinden sindirilmiş pHA -glmS içine ekleme için tasarım astar.
Not: P. falciparum genom içeriğini lisesinde UTRs gibi bölgelerde amplifikasyon zorlaştırabilir. PCR kullanarak alternatif bir yaklaşım Homoloji bölgeleri sentezleme.
- PCR kullanarak, hemen ardından kodonu hedef gen 800 baz çifti yükseltmek. Bu amplicon HindIII ve NheI ile bir DNA ligasyonu tepki veya dilim16üzerinden sindirilmiş pHA -glmS içine ekleme için tasarım astar.
4. klonlama Homoloji bölgelere onarım plazmid
-
ORF Homoloji bölge pHA -glmSyerleştirin.
- PHA -glmS SacII ve AfeI, enzim üretici yönergelerine göre sindirmek. ORF Homoloji bölge PCR ürünü kullanma dilim16sindirilir plazmid takın.
- Yetkili E. coli adım 2.3.4 ve 2.3.5 seslendirilen dönüşümü.
-
3' UTR Homoloji bölge ORF Homoloji bölge içeren bir pHA-glmS plazmid takın (bkz. Adım 4.1).
- HindIII ve NheI ile plazmid enzim üretici yönergelerine göre sindirmek. 3' UTR Homoloji bölge amplicon dilim16kullanılarak sindirilir plazmid yerleştirin.
- Yetkili E. coli dönüştürmek ve plazmid DNA (adım 2.3.4 ve 2.3.5) ayıklayın.
5. Hizlandirici DNA Transfection için
- 40 μg her pMK-U6, pUF1-Cas9 ve pHA -glmS DNA (için toplam DNA'ın 120 μg) steril 1.5 mL microcentrifuge tüp içine ekleyin.
- 1/10th eklemek DNA 3 M sodyum asetat su (pH 5.2) tüp hacmi ve iyi bir girdap kullanarak karıştırarak (Örneğin, adım 5.1 hacmindeki 100 μL olsaydı eklemek sodyum asetat 10 μL).
- % 100 etanol hacmi 2,5 kat tüp ve de en az 30 için bir girdap kullanarak karıştırın s (Örneğin, 5.1 ses 100 μL olsaydı Ekle % 100 etanol 250 μL).
- Tüp buz veya 30 dakika-20 ° C'de ekleyin.
- Tüp 18.300 x g 4 ° C'de 30 dk için de santrifüj kapasitesi
- Dikkatli bir şekilde süpernatant tüpünden çıkarın. Pelet rahatsız etmeyin.
- % 70 etanol hacmi 3 kez tüp ve kısaca bir girdap kullanarak karıştırın (Örn., 5.1 ses 100 μL olsaydı % 70 etanol 300 μL eklemek).
- Tüp 18.300 x g 4 ° C'de 30 dk için de santrifüj kapasitesi
Not: Bu adımı biyolojik güvenlik kabin steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor. - Dikkatli bir şekilde süpernatant tüpünden çıkarın. Pelet rahatsız etmeyin. Tüp açık bırakın ve Pelet 15dk için kurumasını bekleyin.
- Transfection için gerekinceye kadar zarlarını DNA-20 ° C'de depolayın.
6. tam kan Transfection için hazırlık üzerinden insan RBCs yalıtma
- Steril 50 mL konik tüpler (yaklaşık 25 mL tüp başına) içine aliquot taze kan.
- 1,088 x g 12 dk için de tüpler santrifüj kapasitesi ile santrifüj fren 4'e ayarlayın.
- Süpernatant ve buffy kat Aspire edin. RBC Pelet eksik RPMI eşit bir hacmi ile resuspend.
Not: Eksik RPMI RPMI 1640 10,32 mikron timidin, 110.2 mikron hypoxanthine, 1 mM sodyum pyruvate, 30 mM sodyum bikarbonat, 5 mM HEPES, 11.1 mM glikoz ve %0.02 (v/v) gentamisin ile ilave tarafından hazırlanmıştır. - 6.2-6.3 adımları iki kez tekrarlayın. Son yıkama sonra RBCs eşit birimlere eksik RPMI resuspend ve tüpler 4 ° C'de depolayın
7. transfecting RBCs CRISPR/Cas9 Plasmid'ler ile (aseptik yapılması)
Not: P. falciparum kültürler diğer raporları17' açıklandığı gibi korunur. %3 O2, % 3 CO2ve % 94'ü N2 altında 37 ° C'de tüm kültürler aksi belirtilmedikçe korumak. Kan bu protokol için kullanıldığı her yerde 6. adımda hazırlanan saf kırmızı kan hücreleri için yönlendiriyordur. Olarak genellikle bir düşüş parazit nükleer silahların yayılmasına karşı büyük kan kanı kullanılan 6 hafta, eski olmamalıdır. Aşağıdaki adımlar, önceden yükleme RBCs DNA ve parazit kültür transfected hücrelere ekleme açıklar. Bu yapıları18,19transfecting ile uyumlu diğer kurulan transfection kurallarıdır.
- Su (120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6) 1 x cytomix arabellekte hazırlayın. 0,22 mikron filtre kullanarak filtre olarak sterilize et.
- DNA için 1 x cytomix 380 μL adım 5 ve çözülmeye girdap çöktürülmüş ekleyin. 10 dakika, vortexing her 3 dakikada 10 için 1 x cytomix çözülmeye DNA izin s.
- Steril 15 mL konik tüp RBCs 300 μL birleştirmek (% 50 hematokrit, adım 6) ile 4 mL 1 x cytomix eksik RPMI içinde.
- Adım 7,3 870 x g 3 dk de RBCs santrifüj kapasitesi ve süpernatant RBC Pelet kaldır.
- RBC Pelet adım 6.2 DNA/cytomix karışımı ile ve 0.2 cm Elektroporasyon küvet transfer resuspend.
- Electroporate aşağıdaki koşullar kullanarak RBCs: 0,32 kV, 925 μF, "Yüksek kap" ayarlı direnç kapasitans ayarla "Sonsuz".
- Elektroporasyon içeriği tam RPMI (cRPMI) için bir 15 mL konik içeren 5 mL küvet aktarın. 870 x g 20 ° C'de 3 dk de tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
Not: cRPMI % 0.25 (w/v) lipid zengini Sığır serum albümin ilavesi ile eksik RPMI olarak aynı yöntemi ile hazırlanır. - Pelet 4 ml cRPMI ve bir 6-iyi doku kültürü plaka bir kuyuda transfer resuspend. Bir yüksek-schizont kültürün 400 μL ekleyin (7-%10 schizont parasitemia idealdir) transfected RBCs için.
Not: Parasitemia parazit bulaşmış RBCs yüzdesi olarak tanımlanır. - Ertesi gün, kültür cRPMI 4 mL ile yıkayın. 870 x g 3 dk de kültür santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Kültür 4 mL cRPMI resuspend.
- Adım 7,6, tamamladıktan sonra 48 h kültür cRPMI 4 mL ile yıkayın. 1 mikron içeren cRPMI kültür resuspend DSM1 Cas9 plazmid için seçin.
-
Parazitler artık kan yayması tarafından görünür hale gelene kadar her gün cRPMI ile kültürler yıkama devam edin. Bu noktadan sonra taze cRPMI artı 1 mikron ile kültür orta yerine DSM1 her 48 h.
- Bir kan yayma, kültür 150 μL 0.6 mL santrifüj tüpüne pipet yapmak. Hücreleri tarafından Santrifüjü 1.700 x g 30 de cips s.
- Süpernatant Aspire edin. Bir pipet pelleted hücreleri bir cam slayt aktarmak için kullanın. İlk slayt için 45 ° açıyla düzenlenen ikinci bir cam slayt kullanarak, kan damlacık yayma. Üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan bir boyama seti kullanarak slayt leke.
- Bir 100 X yağı daldırma amacı istimal parazitler görüntüleyin.
- 5 gün başlayan sonrası transfection (7,6. adım) kaldırmak 2 mL kültür kültür ortamında resuspended RBCs ile. Taze orta arka 2 mL ekleyin (cRPMI artı 1 mikron DSM1) ve % 2 hematokrit kana. Bir kez bir hafta öncesine kadar parazitler yeniden, taze kan ince kan yayması (adım 7,11) tarafından belirlenen bu şekilde ekleyin.
Not: Tümleştirme başarılı olursa, parazitler genellikle kültüründe bir ay sonrası transfection tarafından yeniden görünür. - Bir kez parazitler reemerge, DSM1 uyuşturucu basıncı kaldır. Alternatif olarak, parazitleri dışarı klonlanmış sonra uyuşturucu basınç kaldırın.
8. kontrol parazitler için onarım şablon entegrasyon
- Parazitler daha ince kan yayması tarafından görünür olduğunda, DNA uygun bir seti kullanarak kültüründen izole et.
-
PCR değiştirilmiş bölge hedefli locus başarıyla değiştirildi ve değiştirilmemiş vahşi tipi odağı (vahşi tipi parazitler gösterge) tespit ise belirlemek için genomunun yükseltmek için kullanın.
- Onarım şablon entegre etmiş parazitler algılamak için klonlanmış Homoloji bölge dışında ORF başında oturur ileri bir astar kullanın. İçinde 3'-UTR'nin oturur ters bir astar kullanın.
Not: Bu amplifikasyon HA Etiketler ve glmS ribozyme dizileri içerir, amplicons entegre parazitler gelen vahşi tipi parazitler içinde güçlendirilmiş aynı bölgede daha uzun olacaktır.
- Onarım şablon entegre etmiş parazitler algılamak için klonlanmış Homoloji bölge dışında ORF başında oturur ileri bir astar kullanın. İçinde 3'-UTR'nin oturur ters bir astar kullanın.
9. seyreltme sınırlayarak parazitler klonlama
-
Parazit kültürünün seri dilutions adımı 7,13 0.5 parazitler/200 μL son bir konsantrasyon elde etmek için gerçekleştirin. 200 μL seyreltilmiş kültürünün bir 96-iyi doku kültürü tabak wells için ekleyin.
Not: çünkü parasitemia enfekte RBCs yüzdesi olarak tanımlanır ve hematokrit tanımlanmış numarası (% 2) Ayrıca, parazitler birim hacim başına sayısı kolayca anlaşılmaktadır.- 1 mL cRPMI %5 parasitemia ve % 2 hematokrit, kültür hazırlamak (Bu parasitemia ve hematokrit düzeylerinde kültürü 1 x 107 parazitler/mL içerir).
- CRPMI ile bu kültür 1: 100 oranında seyreltin. Yine cRPMI ile 1: 100 oranında seyreltin.
- 1: 400 oranında seyreltin. Bu seyreltme 25 mL cRPMI ve 1 mL kan kültür 62.5 μL ekleyerek gerçekleştirin. Bu seyreltme 0.5 parazitler/200 μL istenen konsantrasyon sonuçlanır.
-
Parazitler wells için yapılan tespit olana klonlama plaka korumak.
- Her 48 h, 96-şey plaka ortamda ile taze orta yerine.
- Haftada bir kez, klonlama plaka (adım 9.1) başlayan sonra 5 gün başlayarak, her kuyudan 100 μL kaldırın ve geri 100 μL taze orta + kan (%2 hematokrit) ekleyin.
-
Parazit içeren herhangi bir kuyu tanımlayın.
- 96-şey plaka için yaklaşık 20 dk kan plaka içinde bir açıyla yerleşmek izin, bir 45 ° açıyla yerleştirin.
- 96-şey plaka üzerinde bir ışık kutusu yerleştirin. Parazit içeren wells asitleştirme parazitler tarafından orta nedeniyle parazit ücretsiz Wells pembe medyaya göre renkli, sarı bir medya içermediğine dikkat edin.
- Serolojik pipet kullanarak, parazit içeren wells içeriğini parasitemia genişlemesi izin vermek için bir 24-iyi doku kültürü plaka taşı.
- PCR analiz 8. adımda açıklandığı gibi kullanarak, bu klonal parazit satırları doğru tümleştirme için denetleyin.
10. nakavt parazitler Glucosamine ve Western Blot analizi yoluyla onay ile davranarak protein
- -20 ° C'de depolanan bir 0, 5 M GlcN (glucosamine) hisse senedi çözüm hazırlamak
- Ve GlcN huzurunda büyümeye izin GlcN glmS parazit kültürler için ekleyin.
Not: Son konsantrasyon ve zamanlama GlcN tedavi deney ve parazit hatta bağlıdır. Yani hassasiyeti bileşiği belirlemek için bir Aralık GlcN konsantrasyonları ebeveyn parazit zorlanma maruz GlcN parazit büyüme, etkileyebilir. Çoğu zaman, bir konsantrasyon 2.0-7.5 mm GlcN kullanılan13,14,20' dir. - Protein örnekleri13GlcN tedavi parazitleri izole et.
-
Protein örnekleri western blot analizi için protein13' te indirimleri algılamak için kullanır.
- Üreticinin yönergelerine uygun bir anti-HA antikor HA glmS öğesini protein algılamak için kullanır. PfEF1α gibi bir yükleme denetim HA gruba karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kullanılan bu yöntem yanı sıra bir kalkan mutasyon örneği plazmid şematik resim 1' de gösterilmiştir. Transfection sonra mutant parazitler nasıl bir örnek olarak, HA -glmS yapı entegrasyonu denetimi PCR sonuçlarını Şekil 2' de gösterilir. Klonlama bir tabak temsilcisi bir görüntüsünü parazitler huzurunda orta renk değişimi göstermek için Şekil 3 ' te gösterilmiştir. Bir ayirt tahlil ve western Blot deney sonuçlarından HA etiketi ve glmSişlevselliği göstermek için Şekil 4 ' te gösterilen-indirimleri parazitleri proteinlerin dayalı. Şekil 5 kısa Homoloji silah parazit genleri değiştirmek ve uygun mutantlar elde etmek için PCR ürünlerde yetersizliği gösterir.
Şekil 1: CRISPR/Cas9 ve gRNA oligo ve kalkan mutasyon örnekleri üç-plazmid yaklaşımımız özetini. (A)şemaları boş pHA-glmS ve pMK-U6 klonlama için kullanılan Restriksiyon enzimi siteleri ile gösterilir. Ayrıca gösterilen pHA-glmS ve pMK-U6 sonra Homoloji silah ve gRNA dizileri, onları içine sırasıyla klonlanmış. Son olarak, pUF1-Cas9 gösterilir. yDHOD Maya dihydrofolate redüktaz, direnç işaretçisi için DSM1 =. (B) PfHsp70x gRNA sıra pMK-U6 içine klonlama için kullanılan ileri oligo, büyük harf ve küçük harflerle (üst) klonlama için gerekli pMK-U6 Homoloji silah gRNA sırayla gösterilir. PfHsp70x gRNA genomik hedef aşağı akım PAM, kırmızı (orta) olarak gösterilir. PAM PfHsp70x gRNA kalkan mutasyon kırmızı (alt) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: CRISPR/Cas9 genom değişiklik pHA-glmS ve bir strateji kullanarak tümleştirme teyit için şematik. (A)Cas9, genomik bir odağı bir gRNA tarafından destekli DNA'daki Çift Kişilik strand ara neden olmaktadır. Parazit pHA-glmS plazmid şablon olarak kullanarak ve HA-glmS sıra genom tanıştırmak çift crossover homolog onarım, yoluyla hasar onarır. (B) A PCR testi HA-glmS sıra doğru entegrasyonunu tanımlamak için. P1 ve P2 primerler kullanılarak, 3' ORF vahşi-türü PfHsp70x ve PfHsp70x -glmS mutant güçlendirilmiş13vardır. Amplicon PfHsp70x-glmS dan daha uzun vahşi-türü ekleme HA-glmS sırası nedeniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir 96-şey klonlama plaka parazit içeren wells tanımlaması. (A)96-şey plaka ayarlanır için kan izin vermek yaklaşık 20 dk 45 ° açıyla plaka bir açıyla yerleşmek için. (B) soldaki şey parazit ücretsiz sağdaki de pembe orta ile karşılaştırıldığında Orta sarı renk ile gösterilen bir parazit kültür içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: bir ayirt tahlil doğru HA-etiketleme ile PfHsp70x gösterir ve Western blot PfHsp70x protein düzeyleri azalma glucosamine ile tedavi sırasında gösterir. (A)PfHsp70xglmS parazit sabit ve DAPI (çekirdek marker) ve HA ve MAHRP1 antikorlar ile lekeli (membran ilişkili histidin zengin Protein 1, protein ihracat RBC ana bilgisayar için bir işaretleyici)13. (B) PfHsp70x -glmS parazitler 7.5 mM glucosamine ile tedavi ve bütün parazit lysates Western blot Analizi13için kullanılmıştır. Bir yükleme kontrol gibi13membran HA ve PfEF1α için antikorlar ile sondaj. Beklendiği gibi glukozamin tedavi protein bir azalma sonuçlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: onarım için kısa Homoloji dizileri kullanarak. (A)şematik Gösterim gösteren nakavt GFP ve B7 parazitler21. B7 parazitler 3D 7 içinde GFP ile Plasmepsin II etiketli bir türevi. PCR ürünleri, 50, 75 veya 100 baz çifti GFP Homoloji bölgeler ("işareti" etiketli), blasticidin S direnç kaset kanat pUF1-Cas9-eGFP-gRNA ile birlikte içeren Cas9 ve GFP gRNA ifade bir plazmid B7 parazitler transfected. Her transfection iki kez gerçekleştirilmiştir. DSM1 uyuşturucu basıncı uygulanan 2 gün sonrası transfection yapıldı. (B) gösterildi burada transfected parazitler 5 gün sonrası transfection ve 2 ay sonrası transfection izole DNA PCR testleri vardır. Entegrasyon BSD direnç kaset sınanacak kullanılan astar B7 ebeveyn parazitleri için 584-baz çifti ürün ve işaretçiyi entegre etmiş parazitleri için 2020-baz çifti ürün ortaya çıkarır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR/Cas9 P. falciparum olarak uygulanması hem verimliliği artan ve asıl olayın asalağın genom, genetik manipülasyon önceki yöntemlerine göre değiştirmek için gereken süreyi azalmıştır. Bu kapsamlı protokol koşullu mutantlar CRISPR/Cas9 P. falciparumkullanarak oluşturmak için gereken adımları açıklar. Yöntemi özellikle HA -glmS mutantlar üretimi için tasarlanmış olsa da, bu strateji ihtiyaçları, genler, gen renkleri çakıştırmama ve giriş noktası mutasyonların etiketleme de dahil olmak üzere çeşitli için adapte edilebilir.
Bu iletişim kuralı bir kritik ilk adım bir gRNA sıra seçimidir. Bir gRNA seçerken, gRNA oturur, ne kadar verimli olur ve hedef kapalı efektleri için potansiyel olsa da olmasa da bu gibi göz önünde bulundurulacak birkaç nokta vardır. GRNA sıra mümkün olduğu kadar yakın siteye değişiklik, 200 baz çifti içinde ideal bir konuma sahip olmalıdır. Bu etiketi entegre olmadan kendi genom gidermek için onarım şablon kullanmayı parazit olasılığını azaltır. Burada gRNA bulmak için kullanılan bir ücretsiz, online hizmet CHOPCHOP22uygulamasıydı. Başka bir online araç, ökaryotik patojen CRISPR RNA/DNA tasarım aracı (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/) Kılavuzu, da-ebilmek var olmak kullanılmış23. EuPaGDT gRNA dizileri, hedef kapalı sayısı ve gRNA, transkripsiyon engelleyebilecek olası sorunları tahmin dahil olmak üzere ek karakterizasyonu sağlar. EuPaGDT aynı zamanda birden fazla gen veya bütün genleri hedeflemek için gRNAs toplu işleme için araçlara sahiptir. Seçili gRNA değişiklik siteye en yüksek verimliliği ve en az off hedef sayısı ile en yakın oturan biri olmalıdır. Ortaya çıkabilecek CRISPR/Cas9 gen düzenleme bir önemli ilgi gen hedeflemek için uygun bir gRNA tasarlamak için yetersizlik kısıtlamadır. Bu gibi durumlarda, bir deneme-yanılma yaklaşım en iyi seçenek bulunana kadar birden çok alt-optimal gRNA dizileri kullanarak gerekli olabilir ve başarılı gen düzenleme oluştu.
CRISPR/Cas9 kullanarak P. falciparum mutantlar oluştururken göz önünde bulundurulacak bir başka önemli faktör onarım şablonda kullanılan Homoloji bölgeleri uzunluğudur. Bu iletişim kuralı Homoloji bölgeleri yaklaşık 800 baz çifti her olmalı, ama biz de daha küçük bölgeler 500 baz çifti3numaralandırma kullanarak başarılı olmuştur önerir. CRISPR/Cas9 ve kısa Homoloji silah PCR ürünleri kullanarak başarılı genom değişiklik Toxoplasma gondii ve Trikomonas vajinalis24,25. gibi diğer protozoon parazit olarak da kullanılmıştır Nakavt GFP B7 parazitler blasticidin direnç kaset21kullanma girişiminde bulunarak PCR ürünleri (50, 75 veya 100 baz çifti) daha küçük Homoloji silah kullanarak fizibilite test ettik. Blasticidin direnç kaset 5 gün sonrası transfection, bazı entegrasyonu gördük; Ancak, bu parazitler asla yeniden elde etmek--dan transfection. Bu transfections için biz DSM1 kullanarak Cas9 ifade plazmid için seçildi. Transfected kültürleri blasticidin S ile tek başına veya birlikte DSM1 ile tedavi gibi bir farklı seçim yöntemi daha kısa Homoloji bölgeler Cas9/gRNA-indüklenen sonları onarmak için kullanırken reappearing parazit olasılığını artırabilir. Bu durumda, Eğer kısa Homoloji silah durumlarda nerede bir ilaç direnci kaset ne zaman bir protein etiketli gibi soykırım, içine entegre değil kullanılmış test etmek istedim bu yana biz blasticidin S ile seçmediniz.
CRISPR/Cas9 gen düzenleme çekirdek bileşenleri ele Cas9 endonükleaz, gRNA ve onarım şablon vardır. Biz Cas9, gRNA ve onarım şablon ayrı plazmid nerede bulunur parazitler, içine bu bileşenleri tanıtmak bir üç-plazmid yaklaşım tarif. Bu yaklaşım ek olarak bizim laboratuvar Cas9 ve gRNA ifade tek bir plazmid tarafından tahrik edilmektedir ve onarım şablon bir ikinci plazmid3' te bulunan bir iki-plazmid yaklaşım kullanarak başarılı olmuştur. Benzer iki-plazmid yaklaşımlar da başarıyla diğer labs tarafından mutantlar7,8,26,27,28,29oluşturmak için istihdam edilmiştir. Ayrıca, birkaç labs yapısal Cas9 ve sürücü ifade gRNAs30T7 RNA polimeraz ifade Plasmodium (NF54attB) bir tür kullanıyorsunuz. Bu durumda, onarım şablon ve gRNA içeren tek bir plazmid NF54attB parazit31,32transfected. Son olarak, karmaşık bir saf Cas9-gRNA Ribonükleoprotein kullanan plazmid içermeyen bir yaklaşım içine iyi33olarak genom mutasyonlar eklemek için kullanılır. Bu farklı yaklaşımlardan başarısı araştırmacılar parazit Cas9/gRNA bileşenleri tanıtabilirsiniz yöntemleri esnekliğini gösterir.
Son olarak, uyuşturucu basınç seçimi için transfected parazit uygulamak için değiştirilebilir, kullanılan yapıları bağlı olarak. İşte, mutantlar başarılı nesil geçici parazitler yeniden kadar DSM1 kullanarak Cas9 ifade plazmid için seçerek göstermektedir. PfHsp70x nakavt parazitler üretmek için pfhsp70x insan dihydrofolate redüktaz gen ile değiştirildi ve parazitler sonra WR9921013kullanarak seçildi. Son zamanlarda açıklanan Tetra-PfDOZI devirme sistem entegrasyonu parazitler blasticidin S15,31kullanarak seçimi için izin bir blasticidin S direnç geni içeren bir plazmid kullanır.
Genel olarak, CRISPR/Cas9 P. falciparum gen düzenleme sıtma araştırma güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır ve koşullu devirme mutantlar3,7,8 oluşturmak için yöntemleri Protokolü ayrıntıları , 13 , 20 , 28. bu protokol son derece bireysel ilgi alanları için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Muthugapatti Kandasamy Georgia Üniversitesi (UGA) Biyomedikal mikroskobu temel teknik yardım için ve Juan Jose Lopez-Rubio pUF1-Cas9 ve pL6 plazmidleri paylaştığınız için teşekkür ederiz. Bu eser UGA başlangıç fon için VM, m. ve bize Ulusal Sağlık Enstitüleri Mart Dimes Vakfı (fesleğen O'Connor Starter bilim adamı Araştırma Ödülü) hibe verir kemerler Vakfı Ödülü D.W.C. ve H.M.K., tarafından desteklenmiştir (R00AI099156 ve R01AI130139) VM için ve (T32AI060546) H.M.K. için
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
