Summary
我们描述了一种利用 CRISPR/Cas9 基因组编辑在恶性疟原虫中产生glmS的条件击倒突变体的方法。
Abstract
疟疾是全世界发病率和死亡率的一个重要原因。这种疾病主要影响那些生活在热带和亚热带地区的人, 是由疟原虫感染引起的。通过提高我们对这种复杂寄生虫生物学的认识, 可以加速开发更有效的防治疟疾药物。这些寄生虫的基因操纵是了解他们的生物学的关键;然而, 在历史上,恶性疟原虫的基因组一直难以操作。最近, CRISPR/Cas9 基因组编辑已被用于疟疾寄生虫, 允许更容易的蛋白质标记, 产生条件蛋白 knockdowns, 并删除基因。CRISPR/Cas9 基因组编辑已被证明是促进疟疾研究领域的有力工具。在这里, 我们描述了一个 CRISPR/Cas9 的方法来产生glmS的条件下的突变体恶性疟原虫。这种方法非常适合其他类型的基因操作, 包括蛋白质标记和基因挖空。
Introduction
疟疾是疟原虫属原生动物寄生虫造成的一种破坏性疾病。恶性疟原虫是人类最致命的疟疾寄生虫, 每年造成约44.5万人死亡, 其中大部分为五岁以下儿童.疟原虫有一个复杂的生命周期, 涉及蚊子载体和脊椎动物宿主。当被感染的蚊子吃了一顿血时, 人类首先会被感染。然后, 寄生虫侵入它生长、发育和分裂大约一周的肝脏。在这个过程之后, 寄生虫被释放入血液, 在那里他们接受无性复制在红细胞 (红细胞)。红细胞内寄生虫的生长直接负责与疟疾有关的临床症状2。
直到最近, 转基因的恶性疟原虫的生产是一个费力的过程, 涉及几轮的药物选择, 花了几个月, 并有很高的失败率。这一耗时的程序 relieson 在感兴趣的地区产生随机 DNA 断裂和寄生虫的内生能力, 修复其基因组, 虽然同源维修3,4,5,6.最近, 聚集定期 Interspaced 回文 Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) 基因组编辑已成功地应用于恶性疟原虫7,8。在疟疾研究中引入这种新技术对于促进对这些致命疟原虫的生物学的了解至关重要。CRISPR/Cas9 允许特定的基因靶向, 通过引导 rna (gRNAs) 是同源的基因的兴趣。gRNA/Cas9 复合体通过 gRNA 识别该基因, Cas9 然后引入双链断裂, 强制启动修复机制在生物体9,10。由于恶性疟原虫缺乏通过非同源端连接修复 DNA 断裂的机制, 它利用同源重组机制, 整合转染的同源 dna 模板修复 Cas9/gRNA-induced双绞线断裂11,12。
在这里, 我们提出了一个协议, 以产生条件下的突变体恶性疟原虫使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑。该协议表明使用glmS核酶的条件下击倒蛋白水平的 PfHsp70x (PF3D7_0831700), 一个陪同下, 由P. 恶性疟原虫出口到主机红细胞13,14。glmS核酶是通过治疗与氨基葡萄糖 (转化为 glucosamine-6-phosphate 细胞), 以切割其相关的 mRNA, 导致减少蛋白质14。该协议可以很容易地适应使用其他条件击倒工具, 如不稳定域或 RNA 适配子4,5,15。我们的协议详细描述了由血凝素 (HA) 标记和glmS核酶编码序列组成的修复质粒的生成, 这些顺序由与 PfHsp70x 开放阅读框架 (ORF) 和 3 '-UTR 相同源的序列所构成。我们还描述了第二种质粒的生成, 以驱动 gRNA 的表达。这两种质粒, 连同第三个驱动 Cas9 的表达, 被转染成红细胞, 用于改变恶性疟原虫的基因组。最后, 我们描述了一种聚合酶链反应 (PCR) 技术, 以验证标签和glmS核酶的整合。该协议对于任何恶性疟原虫基因的修改或完全挖空具有很强的适应性, 增强了我们对疟原虫生物学的新见解的能力。
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Protocol
恶性疟原虫的持续培养需要使用人类的红细胞, 我们利用了商业上购买的血液, 这些单位被剥夺了所有的识别和匿名。格鲁吉亚大学的机构审查委员会和生物安全办公室审查了我们的议定书, 并批准了我们实验室使用的所有议定书。
1. 选择 gRNA 序列
- 转到 CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) 并选择"Fasta 目标"。在"目标"下, 将200基对从基因的开放阅读框架 (ORF) 的 3 ' 末尾粘贴到200基对, 从基因的 3 '-UTR 开始。在"in" 下, 选择"恶性疟原虫" (3D7 v3.0), 并选择 "使用"下的 "CRISPR/Cas9" 。接下来, 单击"查找目标站点"。
- 从所提供的选项中选择一个 gRNA 序列, 并优先于最有效的 gRNA, 最接近修改地点, 并且具有最少的离目标站点。
注: 可能的 gRNA 序列被识别, 因为它们是直接 Protospacer 相邻的母题 (PAM) 的上游, 这是招募 Cas9 DNA 所必需的。克隆成 pMK-U6 的序列 (驱动 gRNA 表达式的向量) 是 PAM 的上游20个基元。化脓Cas9 的 PAM 是核苷酸序列 NGG, 不应包含在克隆到 pMK-U6 的序列中。
注意: CHOPCHOP 视觉上排列 gRNA 序列, 以绿色显示最佳选项, 在琥珀色中不太理想的选项, 以及红色中最坏的选项。CHOPCHOP 给出了每个 gRNA 序列的效率分数, 这是使用文献中发现的最新参数计算出来的, 他们预测了可以被 gRNA 识别的非目标站点。三 gRNA 序列可能需要试图找到最适合特定基因的 gRNA。 - 购买 gRNA 序列及其反补剂作为聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸。用于目标 PfHSP70x 的 gRNA 序列可以在图 1B中找到。
注: 该寡核苷酸应包括15基对同源的 gRNA 表达质粒, 这是必要的序列和结扎独立克隆 (SLIC) 到 pMK-U6 向量16。
2. 将 gRNA 序列克隆成 pMK-U6
-
用 BtgZI 消化 pMK-U6。
- 消化10微克的 pMK-U6 与 5 ul BtgZI 酶 (5000 单位/毫升) 3 h 在60摄氏度。遵循酶制造商的协议, 为反应条件。
- 在3小时的潜伏期后, 添加一个额外的 3 ul BtgZI 的反应, 以确保完全消化的质粒。补充3小时, 仍然遵循制造商的指示, 以确保正确的反应条件。
- 要从反应中纯化消化 pMK-U6, 请根据制造商的说明使用基于列的 PCR 清除套件。
- 用0.7% 琼脂糖凝胶分离被消化的 DNA, 提取4200基对带。
-
退火包含 gRNA 序列的寡核苷酸。
- 用无核酸酶水将页面纯化的寡核苷酸浓缩为100微米。
- 将每个寡核苷酸的 10 ul 与 2.2 ul 10x 缓冲 2 (见材料表) 结合在一起。确保总反应量为 22.2 ul。
- 在 thermocycler 中运行 gRNA 退火程序: 步骤 1:95 °c, 10 分钟;步骤 2:95 °c, 1 s, 温度降低0.6 °c/周期;步骤 3: 转到步骤 2, 16 次;步骤 4:85 °c, 1 分钟;步骤 5:85 °c, 1 秒, 0.6°C/循环温度降低;步骤 6: 转到步骤 5, 16 次;步骤 7:75 °c, 1 分钟;步骤 8:75 °c, 1 s, 温度降低0.6 °c/周期;步骤 9: 转到步骤 8, 16 次。步骤10至 21: 重复步骤4–9中使用的过程, 直到温度达到25摄氏度;步骤 22:25 °c, 1 分钟。
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将退火后的 gRNA 寡核苷酸插入 BtgZI 消化和凝胶纯化的 pMK-U6 质粒中。
- 结合100的消化 pMK-U6 与 1 ul 10x 缓冲2.1 和 3 ul 的退火 gRNA 寡核苷酸。增加容量到 9.5 ul 以无核酸酶水。
- 添加 0.5 ul 的 T4 聚合酶和孵育反应在室温下2.5 分钟。
- 将反应移动到冰上, 孵育10分钟。
- 根据细菌供应商的指示立即将反应的 5 ul 转化为合格的大肠杆菌。在含有100微克/毫升氨苄西林的溶源性汤 (LB) 琼脂板上印上细菌。
- 允许转化的细菌在一夜之间生长37摄氏度, 然后选择菌落并提取 DNA 与商业上可用的质粒 miniprep 试剂盒。
3. 设计修复模板的同源区域
-
在同源修复模板中设计屏蔽突变, 以防止重新切割集成到基因组中的 DNA。
注: 盾构突变通常包括引入无声突变来改变 PAM, 使 Cas9 不会导致修复模板中断。该协议中使用的 Cas9 所需的 PAM 是核苷酸序列 "NGG", 其中 "N" 是任何核苷酸。如果可能, 将 G 核苷酸中的一个转换为 A、C 或 T。- 如果 pam 不能被悄悄地突变, 那么至少要将2个无声突变引入6基对, 直接与 PAM7,8相邻。
注意: 这些突变将防止 gRNA 对修复模板的识别, 防止 Cas9/gRNA 复合体重新切割修复的轨迹。通过放大含有突变的引物的 DNA, 可以将盾构突变引入同源区。
- 如果 pam 不能被悄悄地突变, 那么至少要将2个无声突变引入6基对, 直接与 PAM7,8相邻。
-
放大修复模板的 ORF 同源区域。
- 使用 PCR, 放大800基对从 3 ' 末端的目标基因的 ORF。设计的引物, 将用于排除停止密码从这个扩增子。
- 通过 DNA 结扎反应或 SLIC16, 设计将此扩增子插入glmS的底漆, 经 SacII 和 AfeI 消化。
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放大修复模板的 3 '-UTR 同源区域。
- 使用 PCR, 放大800基对紧跟在目标基因的停止密码子。通过 DNA 结扎反应或 SLIC16, 将此扩增子插入glmS的设计底漆, 经 HindIII 和 NheI 消化。
注:恶性疟原虫基因组的高含量可以使 UTRs 等地区的扩增困难。使用 PCR 的另一种方法是合成同源区域。
- 使用 PCR, 放大800基对紧跟在目标基因的停止密码子。通过 DNA 结扎反应或 SLIC16, 将此扩增子插入glmS的设计底漆, 经 HindIII 和 NheI 消化。
4. 将同源区克隆成修复质粒
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将 ORF 同源区插入glmS。
- 根据酵素制造商的指示, 消化glmS与 SacII 和 AfeI。用 SLIC16将 ORF 同源区 PCR 产物插入消化质粒中。
- 在步骤2.3.4 和2.3.5 中转化为合格的大肠杆菌。
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将 3 '-UTR 同源区插入到已包含 ORF 同源区的 glmS 质粒中 (见步骤 4.1)。
- 根据酶制剂制造商的指示, 用 HindIII 和 NheI 消化质粒。用 SLIC16将 3 '-UTR 同源区扩增子入消化质粒。
- 转化成有能力的大肠杆菌, 提取质粒 DNA (步骤2.3.4 和 2.3.5)。
5. 沉淀 DNA 进行转染
- 添加40微克每 pMK-U6, pUF1-Cas9 和glmS dna (总共120微克的 dna) 成无菌1.5 毫升离心管。
- 添加 1/第十在水中的3米醋酸钠的 DNA 体积 (pH 5.2) 到管, 并混合使用涡 (例如,如果步骤5.1 的体积是 100 ul, 添加 10 ul 乙酸钠)。
- 添加2.5 倍的100% 乙醇的体积管, 并混合使用一个漩涡至少三十年代 (例如,如果体积在5.1 是 100 ul, 添加 250 ul 的100% 乙醇)。
- 将管放在冰上或在-20 摄氏度处放置30分钟。
- 离心管在 18300 x g 30 分钟在4摄氏度。
- 小心地从试管中取出上清液。不要扰乱球团。
- 添加3倍的70% 乙醇的体积到管, 并简单地混合使用涡 (e., 如果体积在5.1 是 100 ul, 添加 300 ul 的70% 乙醇)。
- 离心管在 18300 x g 30 分钟在4摄氏度。
注: 本步骤应在生物安全柜无菌条件下进行。 - 小心地从试管中取出上清液。不要扰乱球团。把管子打开, 让球团风干15分钟。
- 将沉淀的 DNA 储存在-20 摄氏度, 直到需要转染。
6. 将人红细胞从全血中分离, 准备转染
- 整除新鲜血液进入无菌50毫升圆锥管 (大约25毫升每管)。
- 离心机管在 1088 x g 12 分钟, 离心制动器设置为4。
- 吸取上清和巴菲大衣。并用重悬的红细胞颗粒与不完全 RPMI 的体积相等。
注: 不完全 RPMI 是通过补充 RPMI 1640 与10.32 微米胸苷, 110.2 微米嘌呤, 1 毫米丙酮酸钠, 30 毫米碳酸氢钠, 5 毫米 HEPES, 11.1 毫米葡萄糖, 0.02% (v/v) 庆大霉素制备。 - 重复步骤6.2–6.3 两次。在最后一次洗涤之后, 并用重悬红细胞在相等的容量不完全 RPMI 并且存放管子在4°c。
7. 转染红细胞与 CRISPR/Cas9 质粒 (要做灌装)
注: P. 恶性疟原虫的文化如其他报告17所述保持不变。保持所有的文化在37摄氏度以下 3% O2, 3% CO2, 94% N2 , 除非另有说明。无论何时使用血液在本议定书中, 它指的是在步骤6中制备的纯红细胞。使用的血液不应超过6周, 因为在老年血液中寄生虫的增殖通常会减少。以下步骤描述了预加载红细胞与 DNA, 并添加了寄生虫文化的转染细胞。其他已建立的转染协议与转染这些构造18,19兼容。
- 准备一个 1x cytomix 缓冲水 (120 毫米氯化钾, 0.15 毫米 CaCl2, 2 毫米 EGTA, 5 毫米氯化镁2, 10 毫米 K2HPO4, 25 毫米 HEPES, pH 7.6)。过滤器-使用0.22 微米过滤器消毒缓冲器。
- 添加 380 ul 的 1x cytomix 的 DNA 沉淀在步骤 5, 和漩涡溶解。允许 DNA 溶解在 1x cytomix 10 分钟, 涡流每3分钟十年代。
- 在不育的15毫升圆锥管, 结合 300 ul 的红细胞 (50% 红细胞压积, 从步骤 6) 在不完全 RPMI 与4毫升 1x cytomix。
- 离心红细胞从步骤7.3 在 870 x g 3 分钟, 然后从红细胞颗粒中取出上清。
- 并用重悬的红细胞颗粒与 DNA/cytomix 混合物从步骤6.2 和转移到一个0.2 厘米电穿孔试管。
- Electroporate 红细胞使用以下条件: 0.32 伏, 925 μF, 电容设置为 "高帽", 电阻设置为 "无限"。
- 电穿孔后, 将内容从试管转移到含有5毫升完整 RPMI (cRPMI) 的15毫升圆锥。离心管在 870 x g 3 分钟在20摄氏度, 然后醒酒上清。
注: cRPMI 是通过与不完全 RPMI 相同的方法制备的, 添加 0.25% (w/v) 富含脂质的牛血清白蛋白。 - 并用重悬4毫升 cRPMI 中的颗粒, 在6井组织培养板中转移至一井。添加 400 ul 的高裂殖体文化 (7–10% 裂殖体 parasitemia 是理想的) 转染红细胞。
注: Parasitemia 被定义为寄生虫感染红细胞的百分比。 - 第二天, 用4毫升的 cRPMI 洗涤文化。离心的文化在 870 x g 3 分钟, 并吸入上清。并用重悬4毫升 cRPMI 的培养。
- 48小时完成步骤7.6 后, 用4毫升的 cRPMI 洗涤养殖。然后并用重悬 cRPMI 中含有1微米 DSM1 的培养基, 选择 Cas9 质粒。
-
每天继续用 cRPMI 洗涤这些文化, 直到寄生虫不再被血液涂片看到。在这一点之后, 用新鲜的 cRPMI 和1微米 DSM1 的培养基替换每48小时。
- 为了使血液涂片, 吸管 150 ul 的文化变成一个0.6 毫升离心管。三十年代以 1700 x g离心法将细胞颗粒状。
- 从上清中吸取。使用吸管将颗粒细胞转移到玻璃滑梯上。使用第二个玻璃幻灯片在45°角举行的第一张幻灯片, 涂抹血滴。根据制造商的协议, 使用商业上可用的染色套件来着色幻灯片。
- 使用100X 油浸泡目标查看寄生虫。
- 开始5天后转染 (步骤 7.6), 删除2毫升的文化与红细胞悬浮在培养基中。加回2毫升新鲜培养基 (cRPMI 加1微米 DSM1) 和血液2% 红细胞压积。每周以这种方式添加新鲜血液, 直到寄生虫再次出现, 由薄薄的血液涂片决定 (步骤 7.11)。
注: 如果整合成功, 寄生虫通常会在文化中重新出现一个月后转染。 - 一旦寄生虫再次, 去除 DSM1 的药物压力。另外, 在克隆出寄生虫后, 清除药物压力。
8. 检查寄生虫以整合修复模板
- 当寄生虫通过薄薄的血液涂片再次可见时, 用适当的试剂盒将 DNA 从文化中分离出来。
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利用 PCR 技术放大基因组的改良区域, 以确定目标轨迹是否已成功改变, 如果未修改的野生型 (指示野生型寄生虫) 是可检测的。
- 要检测已集成修复模板的寄生虫, 请使用位于 ORF 起始处的正向底漆, 在克隆的同源区域之外。使用一个反向底漆, 坐在 3 '-UTR。
注: 由于这种放大包括 HA 标记和glmS核酶的序列, amplicons 从综合寄生虫将长于同一地区扩大野生型寄生虫。
- 要检测已集成修复模板的寄生虫, 请使用位于 ORF 起始处的正向底漆, 在克隆的同源区域之外。使用一个反向底漆, 坐在 3 '-UTR。
9. 通过限制稀释来克隆寄生虫
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执行步骤7.13 中的寄生虫培养序列稀释, 以达到 0.5 parasites/200 ul 的最终浓度。将稀释后的培养的 200 ul 添加到96井组织培养板的水井中。
注意: 由于 parasitemia 被定义为受感染的红细胞的百分比, 红细胞压积也是一个定义的数字 (2%), 所以可以很容易地推断出每单位体积的寄生虫数量。- 在 cRPMI 5% parasitemia 和2% 红细胞压积中准备1毫升的培养基 (在这些 parasitemia 和红细胞压积水平上, 培养中含有 1 x 107的寄生虫/毫升)。
- 稀释这个文化1:100 与 cRPMI。再稀释1:100 与 cRPMI。
- 稀释1:400。通过添加 62.5 ul 的文化, 以25毫升的 cRPMI 和1毫升的血液进行稀释。这稀释结果在期望集中 0.5 parasites/200 ul。
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保持克隆板, 直到在水井中检测到寄生虫。
- 每48小时, 用新鲜培养基取代96井板中的培养基。
- 每周一次, 开始5天后开始克隆板 (步骤 9.1), 删除 100 ul 从每个井, 并添加回 100 ul 的新鲜培养基 + 血液 (2% 红细胞压积)。
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识别任何含有寄生虫的水井。
- 将96井板放在45°角上大约20分钟, 使血液在盘子内的角度沉淀。
- 将96井板放在灯箱上。请注意, 含有寄生虫的水井含有黄色的培养基, 与无寄生虫水井的粉红色培养基相比, 是由于寄生虫对培养基的酸化。
- 使用血清学吸管, 将含有寄生虫的水井的内容移到24井组织培养板上, 以允许 parasitemia 的扩张。
- 使用 PCR 分析, 如步骤8所述, 检查这些克隆寄生虫线, 以正确的整合。
10. 用氨基葡萄糖治疗寄生虫对蛋白质的击倒和通过西方印迹分析确认
- 准备一个0.5 米 GlcN (氨基葡萄糖) 库存解决方案, 可以储存在-在
- 将 GlcN 添加到glmS寄生虫培养中, 并允许它们在 GlcN 存在的情况下生长。
注意: GlcN 治疗的最终浓度和时间取决于实验和寄生虫系。GlcN 可以影响寄生虫的生长, 因此, 父母寄生菌株应暴露在一系列的 GlcN 浓度, 以确定其对化合物的敏感性。通常, 浓度为 2.0-7.5 毫米 GlcN 使用13,14,20。 - 从 GlcN 处理的寄生虫中分离出蛋白质样本13。
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使用蛋白质样本进行西方印迹分析, 以检测蛋白质13的减少。
- 根据制造商的指示, 使用抗 ha 抗体检测 ha glmS 标记的蛋白质。将 HA 带与加载控件 (如 PfEF1α) 进行比较。
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Representative Results
图 1显示了这种方法中使用的质粒示意图以及盾构突变的例子。如图 2所示, 在转染后如何识别突变体寄生虫, PCRs 对 HA-glmS结构集成的检查结果。图 3显示了克隆板的一个代表性图像, 以证明在寄生虫存在时培养基的颜色变化。在图 4中显示了免疫荧光检测和西方印迹实验的结果, 以证明 HA 标记和基于glmS的蛋白质在寄生虫中的减少的功能。图 5显示了在 PCR 产品上不能用短同源武器来修改寄生虫基因组并获得可行的突变体。
图 1: 我们对 CRISPR/Cas9 的三质粒方法的总结和 gRNA 寡糖和盾构突变的例子.(A) 空 glmS 和 pMK-U6 的示意图与用于克隆的限制酶站点一起显示。在同源臂和 gRNA 序列分别被克隆后, glmS 和 pMK-U6 也被显示出来。最后, pUF1-Cas9 显示。yDHOD = 酵母二氢叶酸还原酶, 抵抗标记对 DSM1。(B) 显示用于将 PfHsp70x gRNA 序列克隆到 pMK-U6 中的正寡聚体, 其中以大写字母的 gRNA 序列和用小写字母 (top) 进行克隆所必需的 pMK-U6 同源臂。PfHsp70x gRNA 的基因组靶显示为下游 PAM, 红色 (中间)。PfHsp70x gRNA PAM 中的盾构突变以红色 (底部) 显示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用 glmS 的 CRISPR/Cas9 基因组修饰示意图和确认整合的策略.(a) Cas9, 由 gRNA 引导到基因组的轨迹, 诱导 DNA 中的双链断裂。寄生虫通过双交叉同源修复来修复损伤, 以 glmS 质粒为模板, 将 HA glmS 序列引入基因组。(B) PCR 测试, 以确定 glmS 序列的正确整合。利用引物 P1 和 P2, 野生型 PfHsp70x 和 PfHsp70xglmS突变体的 3 ' ORF 被放大13。由于插入 HA-glmS 序列, PfHsp70x-glmS 的扩增子比野生型长。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 在96井克隆板中识别含有寄生虫的水井.(a) 96 井板设置在45°角度约20分钟, 以允许血液以某一角度在板块中沉淀。(B) 左边的井含有一种寄生文化, 用培养基的黄色颜色表示, 与右侧的无寄生虫井的粉红色培养基比较。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 免疫荧光检测显示, PfHsp70x 和西方印迹的正确 HA 标记显示, 在氨基葡萄糖治疗过程中 PfHsp70x 蛋白水平的降低.(a) PfHsp70x-glmS寄生虫是固定和染色 DAPI (细胞核标记) 和抗体的 HA 和 MAHRP1 (膜相关的组氨酸富蛋白 1, 一个标志蛋白质出口到宿主红细胞)13。(B) PfHsp70x-glmS寄生虫用7.5 毫米氨基葡萄糖治疗, 全寄生虫裂解物用于西方印迹分析13。以 HA 和 PfEF1α抗体为荷载控制13, 对膜进行了探讨。如预期, 氨基葡萄糖治疗导致蛋白质的减少。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 使用短的同源序列进行修复.(A) 图示显示 B7 寄生虫中 GFP 的挖空21。B7 寄生虫是3D7 的衍生物, Plasmepsin II 已被荧光蛋白标记。PCR 产品含有50、75或100基对的 GFP 同源区域, blasticidin 的电阻盒 (标记为 "标记"), 连同 pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, 表达 Cas9 和 GFP gRNA 的质粒, 被转染为 B7 寄生虫。每次转染都进行了两次。DSM1 药物压力在转染后2天应用。(B) 这里所示的是在转染后的5天内, 再转染后2月的 DNA PCR 测试。用于测试 BSD 电阻盒集成的引物将产生一个584基对产品, 用于 B7 的父母寄生虫和2020基对产品的寄生虫, 已经集成了标记。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
CRISPR/Cas9 在恶性疟原虫中的实施, 与以往的遗传操作方法相比, 提高了对寄生虫基因组进行修改所需的时间和效率。该综合协议概述了在恶性疟原虫中使用 CRISPR/Cas9 生成条件突变体所需的步骤。虽然这里的方法专门针对glmS突变体的生成, 但这种策略可以适应各种需求, 包括基因标记、基因挖空和点突变的引入。
此协议中的一个关键的早期步骤是选择一个 gRNA 序列。在选择 gRNA 时, 有几个要点需要考虑, 例如 gRNA 的位置, 它的效率如何, 以及它是否有潜在的非目标效果。gRNA 序列应尽可能接近修改地点, 最好在200基对。这减少了寄生虫使用修复模板修复其基因组而不集成标记的可能性。这里用来定位 gRNA 的工具是免费的在线服务, 叫做 CHOPCHOP22。另一种在线工具, 真核病原体 CRISPR 导 RNA/DNA 设计工具 (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/), 也可使用23。EuPaGDT 提供了 gRNA 序列的附加特性, 包括预测离靶命中和可能阻止 gRNA 转录的潜在问题。EuPaGDT 还有用于 gRNAs 的批量处理的工具, 目的是针对多个基因或整个基因组。选定的 gRNA 应该是最接近修改地点的一个, 效率最高, 目标最小。CRISPR/Cas9 基因编辑的一个重要限制可能是无法设计合适的 gRNA 来靶向感兴趣的基因。在这种情况下, 可能需要一个尝试错误的方法, 使用多个子优化 gRNA 序列, 直到找到最佳的选择, 并成功的基因编辑已经发生。
在使用 CRISPR/Cas9 生成恶性疟原虫突变体时需要考虑的另一个重要因素是修复模板中使用的同源区域的长度。该协议建议同源区域各有大约800个基对, 但我们也成功地使用了500基对3的较小区域。用 CRISPR/Cas9 和短同源武器对 PCR 产品进行基因组修饰的方法也被用于其他原虫寄生虫, 如弓形体和阴道毛滴虫24,25.我们测试了在 PCR 产品 (50, 75, 或100基对) 使用较小的同源武器的可行性, 试图通过 blasticidin 电阻盒21在 B7 寄生虫中挖空 GFP。在转染后5天, 我们看到了 blasticidin 电阻盒的一些集成;然而, 这些寄生虫从未从转染中恢复。对于这些 transfections, 我们选择了 Cas9-expressing 质粒使用 DSM1。不同的选择方法, 如治疗转染的文化与 blasticidin S 单独或与 DSM1 结合, 可以提高寄生虫重现的机会时, 使用较短的同源区修复 Cas9/gRNA-induced 断裂。在这种情况下, 我们没有选择 blasticidin S, 因为我们想测试是否可以使用短同源武器的情况下, 药物耐药盒没有纳入基因组, 如蛋白质被标记。
CRISPR/Cas9 基因编辑的核心成分是 Cas9 限制性、gRNA 和修复模板。我们描述了一个三质粒的方法, 把这些成分引入到寄生虫中, 其中 Cas9, gRNA, 和修复模板发现在不同的质粒。除了这种方法, 我们的实验室已经成功地使用了两种质粒的方法, 其中 Cas9 和 gRNA 表达由单一质粒驱动, 修复模板发现在第二质粒3。其他实验室也成功地采用了类似的两种质粒方法来产生突变体7、8、26、27、28、29。此外, 几个实验室使用的疟原虫(NF54attB) 的菌株, 组成性表达 Cas9 和 T7 RNA 聚合酶驱动表达 gRNAs30。在这种情况下, 一个含有修复模板和 gRNA 的单一质粒被转染成 NF54attB寄生虫31,32。最后, 利用纯化的 Cas9-gRNA ribonucleoprotein 复合物的无质粒的方法已经被用来插入基因组中的突变, 以及33。这些不同方法的成功证明了研究人员可以在寄生虫中引入 Cas9/gRNA 成分的方法的灵活性。
最后, 根据所使用的构造, 可以改变适用于转染寄生虫的药物压力的选择。在这里, 我们通过瞬时选择 Cas9-expressing 质粒来显示成功的突变体, 使用 DSM1 直到寄生虫重现。为了生成 PfHsp70x 的剔除寄生虫, PfHsp70x被人类二氢叶酸还原酶基因所取代, 然后使用 WR9921013选择了寄生虫。最近描述的 TetR-PfDOZI 击倒系统依赖于含有 blasticidin 的抗性基因的质粒的整合, 允许使用 blasticidin S15,31选择寄生虫。
总的来说,恶性疟原虫的 CRISPR/Cas9 基因编辑已被证明是疟疾研究的有力工具, 这里的协议详述了产生条件击倒突变体3、7、8的方法。,13,20,28. 本议定书高度适应个人研究兴趣。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢格鲁吉亚大学的 Muthugapatti Kandasamy (UGA) 生物医学显微镜核心技术援助和何塞-胡安洛佩兹-卢比奥分享 pUF1-Cas9 和 pL6 质粒。这项工作得到了弧形基金会奖项的支持, D.W.C. 和 H.M.K., UGA 启动资金 V.M., 赠款从3月的硬币基金会 (罗勒 O ' 康纳启动学者研究奖) V.M., 和美国国立卫生研究院 (R00AI099156 和R01AI130139) V.M. 和 (T32AI060546) H.M.K。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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