Summary
Les auteurs décrivent une méthode pour générer des MLG-base conditionnelles mutants knockdown de Plasmodium falciparum à l’aide de CRISPR/Cas9 génome édition.
Abstract
Le paludisme est une cause importante de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Cette maladie, qui touche principalement les personnes qui vivent dans les régions tropicales et subtropicales, est causée par une infection par les parasites Plasmodium . Le développement de médicaments plus efficaces pour lutter contre le paludisme peut être accéléré en améliorant notre compréhension de la biologie de ce parasite complexe. La manipulation génétique de ces parasites est essentielle pour comprendre leur biologie ; Toutefois, historiquement le génome de P. falciparum est difficile à manipuler. Récemment, CRISPR/Cas9 génome édition a été utilisé dans les parasites du paludisme, permettant une protéine plus facile étiquetant, génération de passes rabattues protéine conditionnelle et délétion de gènes. CRISPR/Cas9 génome édition s’est avéré pour être un outil puissant pour faire progresser le domaine de la recherche sur le paludisme. Nous décrivons ici une méthode CRISPR/Cas9 pour générer des MLG-base conditionnelles knockdown mutants chez P. falciparum. Cette méthode est très adaptable à d’autres types de manipulations génétiques, y compris le marquage de protéines et les masquages de gène.
Introduction
Le paludisme est une maladie dévastatrice causée par des protozoaires parasites du genre Plasmodium. P. falciparum, le parasite du paludisme humain mortel la plupart, provoque environ 445 000 décès par an, principalement chez les enfants âgés de moins de cinq1. Les parasites Plasmodium ont un cycle de vie complexe impliquant un moustique vecteur et un hôte vertébré. Tout d’abord, les humains sont infectent lorsqu’un moustique infecté prend un repas de sang. Ensuite, le parasite envahit le foie où il grandit, se développe et se divise pour environ une semaine. Après ce processus, les parasites sont libérées dans la circulation sanguine, où ils subissent la réplication asexuée en globules rouges (hématies). La croissance des parasites dans les globules rouges sont directement responsables des symptômes cliniques associés à paludisme2.
Jusqu'à récemment, la production de transgéniques à P. falciparum était un processus laborieux, impliquant plusieurs cycles de sélection de médicaments qui a pris plusieurs mois et avait un taux d’échec élevé. Cette procédure longue relieson la génération de l’ADN au hasard brise dans la région d’intérêt et la capacité endogène du parasite pour réparer son génome mais réparation homologue3,4,5,6 . Récemment, groupés régulièrement entrecoupées palindromique Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) édition de génome a été avec succès utilisé à P. falciparum7,8. L’introduction de cette nouvelle technologie en recherche sur le paludisme a été essentielle pour faire progresser la compréhension de la biologie de ces parasites Plasmodium mortelles. CRISPR/Cas9 permet un ciblage spécifique des gènes via guide ARN (gRNAs) qui sont homologues au gène d’intérêt. Le complexe gRNA/Cas9 reconnaît le gène par l’intermédiaire de la gRNA et Cas9 introduit ensuite une pause bicaténaires, forçant le déclenchement des mécanismes de réparation de l’organisme9,10. Parce que P. falciparum n’a pas le matériel pour réparer les cassures de l’ADN par jonction fin non homologue, elle utilise des mécanismes de recombinaison homologue et intègre les matrices d’ADN homologues transfectées pour réparer la Cas9/gRNA-induite cassure double brin11,12.
Nous présentons ici un protocole pour la génération de mutants knockdown conditionnelles à P. falciparum en utilisant CRISPR/Cas9 génome édition. Le protocole montre l’utilisation de la ribozyme MLG à des niveaux de protéine conditionnellement knockdown de PfHsp70x (PF3D7_0831700), un chaperon exportés par P. falciparum dans hôte RBCs13,14. Le ribozyme MLG est activé par un traitement avec la glucosamine (qui est converti en glucosamine-6-phosphate dans les cellules) pour s’attacher son ARNm associé, conduisant à une réduction de la protéine14. Ce protocole peut être facilement adapté pour utiliser les autres outils knockdown conditionnelles, comme domaines de déstabilisation ou RNA aptamères4,5,15. Les détails de notre protocole la génération d’un plasmide de réparation consistant en une hémagglutinine (HA) balise et MLG ribozyme séquence flanqué par des séquences de codage qui sont homologues à la PfHsp70x cadre de lecture ouvert (ORF) et 3'-UTR. Nous décrivons également la génération d’un deuxième plasmide à l’expression de la promenade de la gRNA. Ces deux plasmides, ainsi qu’un troisième qui anime l’expression de Cas9, sont transfectés dans des globules rouges et permet de modifier le génome des parasites P. falciparum . Enfin, nous décrivons une réaction en chaîne par polymérase (PCR)-fondée technique pour vérifier l’intégration de la balise et MLG ribozyme. Ce protocole est hautement adaptable pour la modification ou la complète élimination directe de gènes à P. falciparum , améliorer notre capacité à générer de nouvelles connaissances sur la biologie du parasite de la malaria.
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Protocol
La culture continue de P. falciparum nécessite l’utilisation de globules rouges humains, et nous avons utilisé des unités achetées dans le commerce du sang qui ont été dépouillés de tous les identificateurs et rendues anonymes. L’Institutional Review Board et le Bureau de la biosécurité à l’Université de Georgia revu nos protocoles et approuvé tous les protocoles utilisés dans notre laboratoire.
1. choisir un gRNA séquence
- Allez dans CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) et sélectionnez « Fasta cible ». En vertu de la « Cible », collez les 200 paires de bases de l’extrémité 3' du cadre ouvert de lecture (ORF) d’un gène et 200 paires de bases du début de 3'-UTR de la gène. Sous « In », sélectionnez « P. falciparum » (3 7 v3.0), puis sélectionnez « CRISPR/Cas9 » sous « Using ». Ensuite, cliquez sur « trouver des Sites de cible ».
- Sélectionnez une séquence gRNA dans les options présentées, donnant la préférence à la gRNA plus efficace qui est plus proche de vous sur le site de modification et qui a les moins sites hors cible.
NOTE : Potentiel gRNA séquences sont identifiés car ils sont immédiatement en amont d’un Motif Adjacent Protospacer (PAM), qui est requis pour le recrutement de Cas9 à l’ADN. La séquence qui est clonée en PCM-U6, le vecteur qui anime gRNA expression, est les 20 bases immédiatement en amont de la PAM. La PAM spécifique pour S. pyogenes Cas9 est la séquence de nucléotides NGG et ne devrait pas figurer dans la séquence qui est clonée en PCM-U6.
Remarque : CHOPCHOP classe visuellement les séquences gRNA, affichant les meilleures options en vert, les options moins idéales dans l’ambre et les pires options en rouge. CHOPCHOP donne chaque séquence gRNA un score d’efficacité qui est calculé en utilisant les paramètres à jour trouvées dans la littérature, et ils prédisent des sites hors-cible qui pourraient être reconnues par le gRNA. Deux ou trois séquences gRNA devrez peut-être être tenté de trouver le gRNA mieux adapté à un gène particulier. - Achetez la séquence gRNA et son inverse-complément comme oligos purifiés par électrophorèse sur Gel de Polyacrylamide. On trouvera à la Figure 1 bla séquence gRNA utilisée pour la cible PfHSP70x.
Remarque : Cet oligo devrait inclure 15 paires de bases homologues pour le plasmide exprimant gRNA, qui sont nécessaires à la séquence et la ligature indépendante clonage (SLIC) dans le vecteur de pMK-U616.
2. le clonage le gRNA séquence dans pMK-U6
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Digérer le pMK-U6 avec BtgZI.
- Digest 10 μg de pMK-U6 avec 5 μl d’enzyme BtgZI (5 000 unités/mL) pendant 3 h à 60 ° C. Suivre le protocole du fabricant de l’enzyme pour les conditions de la réaction.
- Après la période d’incubation de 3 h, ajouter une supplémentaire μL 3 de BtgZI dans la réaction d’assurer la digestion complète du plasmide. Digérer pendant 3 h supplémentaires, toujours en suivant les instructions du fabricant pour assurer les conditions de réaction correcte.
- Pour purifier le pMK-U6 digérées par la réaction, utiliser un kit de nettoyage PCR basée sur les colonnes selon les instructions du fabricant.
- Séparer l’ADN digéré à l’aide d’un gel d’agarose de 0,7 % et l’extrait de la bande de 4 200-nucléotide.
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Recuire les oligos contenant la séquence gRNA.
- Reconstituer les oligos purifiés par PAGE à une concentration de 100 μM à l’aide de l’eau exempte de nucléase.
- Mélanger 10 μL de chaque oligo avec 2,2 μL de tampon de x 10 2 (voir la Table des matières). Assurez-vous que le volume total de réaction est de 22,2 μL.
- Exécutez le gRNA recuit programme dans un thermocycleur : Etape 1 : 95 ° C, 10 min ; étape 2 : 95 ° C, 1 s, avec une réduction de température de 0,6 ° C/cycle ; Etape 3 : passez à l’étape 2, 16 fois ; étape 4 : 85 ° C, 1 min ; étape 5 : 85 ° C, 1 s, avec une réduction de température de 0,6 ° C/cycle ; étape 6 : passez à l’étape 5, 16 fois ; étape 7 : 75 ° C, 1 min ; étape 8 : 75 ° C, 1 s, avec une réduction de température de 0,6 ° C/cycle ; étape 9 : passez à l’étape 8, 16 fois. Étapes de 10 à 21 : répéter la procédure utilisée aux étapes 4 à 9 jusqu'à ce que la température atteigne 25 ° C ; étape 22:25 ° C, 1 min.
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Insérez les oligos gRNA recuit dans le plasmide BtgZI-digérés et gel purifié pMK-U6.
- Mélanger 100 ng de pMK-U6 digérée avec 1 μL de 10 x μL de tampon 2.1 et 3 de recuit gRNA oligos. Augmentez le volume à 9,5 μL d’eau exempte de nucléase.
- Ajouter 0,5 μL de T4 polymérase et incuber la réaction à température ambiante pendant 2,5 min.
- Déplacer la réaction de glace et incuber pendant 10 min.
- Immédiatement transformer 5 μL de la réaction en compétent e. coli conformément aux instructions du fournisseur de la bactérie. Plaque de la bactérie sur la lysogénie bouillon (LB) boîtes de gélose contenant 100 μg/mL d’ampicilline.
- Permettent aux bactéries transformées pour se développer à 37 ° C pendant la nuit, puis sélectionner les colonies et extraire l’ADN avec un kit de miniprep plasmide disponibles dans le commerce.
3. conception d’homologie régions du modèle réparation
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Conception bouclier des mutations au sein du modèle homologie de réparation afin d’éviter la re-découpage de l’ADN qui s’intègre dans le génome.
Remarque : Une mutation bouclier généralement consiste à introduire une mutation silencieuse pour modifier la PAM afin que Cas9 n’induira pas une pause dans le modèle de la réparation. La PAM requis pour le Cas9 utilisés dans le présent protocole est la séquence de nucléotides « NGG », où « N » est un nucléotide. Si possible, l’un des nucléotides G changer pour un A, C ou T.- Si la PAM ne peut pas être l’objet d’une mutation en silence, introduire au moins 2 mutations silencieuses dans les 6 paires de base directement adjacents à la PAM7,8.
Remarque : Ces mutations vont empêcher la reconnaissance du modèle de réparation par le gRNA et prévenir re-découpage du locus réparé par le Cas9/gRNA complexe. Les mutations de bouclier peuvent être introduites dans la région d’homologie par amplification de l’ADN avec des amorces qui contiennent de la mutation.
- Si la PAM ne peut pas être l’objet d’une mutation en silence, introduire au moins 2 mutations silencieuses dans les 6 paires de base directement adjacents à la PAM7,8.
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Amplifier la région d’homologie ORF pour le modèle de la réparation.
- Par PCR, amplifier 800 paires de bases de l’extrémité 3' du gène ciblé ORF. Concevoir les amorces qui serviront d’exclure le codon stop cette amplicon.
- Concevoir les amorces pour l’insertion de cette amplicon dans le pHA -MLG a été digéré avec SacII et AfeI via une réaction de ligature d’ADN ou SLIC16.
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Amplifier la région 3'-UTR de l’homologie pour le modèle de la réparation.
- Par PCR, amplifier les 800 paires de bases qui suit immédiatement le codon du gène cible. Conception des amorces pour l’insertion de cette amplicon dans le pHA -MLG a été digéré avec HindIII et NheI via une réaction de ligature d’ADN ou SLIC16.
Remarque : La haute teneur du génome P. falciparum risquent de compliquer l’amplification des régions telles que RTNS. Une approche alternative à l’utilisation de PCR est synthétisant les régions d’homologie.
- Par PCR, amplifier les 800 paires de bases qui suit immédiatement le codon du gène cible. Conception des amorces pour l’insertion de cette amplicon dans le pHA -MLG a été digéré avec HindIII et NheI via une réaction de ligature d’ADN ou SLIC16.
4. clonage d’homologie régions dans le plasmide de réparation
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Insérer la région d’homologie ORF dans le pHA -MLG.
- Digérer les pHA -MLG avec SacII et AfeI, conformément aux instructions du fabricant de l’enzyme. Insérer le produit de PCR de région d’homologie ORF dans le plasmide digéré à l’aide de SLIC,16.
- Transformer en compétent e. coli interprété aux étapes 2.3.4 et 2.3.5.
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Insérer la région d’homologie de 3'-UTR dans un plasmide de pHA-MLG qui contient déjà la région d’homologie ORF (voir point 4.1).
- Digérer le plasmide avec HindIII et NheI conformément aux instructions du fabricant de l’enzyme. Insérez l’amplicon de région 3'-UTR homologie dans le plasmide digéré à l’aide de SLIC,16.
- Transformer en compétent e. coli et extraire l’ADN (étapes 2.3.4 et 2.3.5) de plasmide.
5. précipiter l’ADN pour la Transfection
- Ajouter 40 μg de chaque de pMK-U6, pUF1-Cas9 et pHA -MLG ADN (pour un total de 120 μg d’ADN) dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL.
- Ajouter 1/10ème le volume de l’ADN d’acétate de sodium 3M dans l’eau (pH 5,2) au tube et mélanger bien à l’aide d’un vortex (par exemple, si le volume à l’étape 5.1 était 100 μL, ajouter 10 μL d’acétate de sodium).
- Ajouter 2,5 fois le volume d’éthanol à 100 % dans le tube et mélanger bien à l’aide d’un vortex pendant au moins 30 s (par exemple, si le volume en 5.1 a été de 100 μL, ajouter 250 μL d’éthanol à 100 %).
- Placer le tube sur la glace ou à-20 ° C pendant 30 min.
- Centrifuger le tube à 18 300 x g pendant 30 min à 4 ° C.
- Retirer délicatement le surnageant du tube. Ne pas déranger le culot.
- Ajouter 3 fois le volume d’éthanol à 70 % dans le tube et mélanger brièvement à l’aide d’un vortex (e.g., si le volume en 5.1 a été de 100 μL, ajouter 300 μl d’éthanol à 70 %).
- Centrifuger le tube à 18 300 x g pendant 30 min à 4 ° C.
Remarque : Cette étape doit être effectuée dans des conditions stériles sous une hotte de sécurité biologique. - Retirer délicatement le surnageant du tube. Ne pas déranger le culot. Laissez le tube ouvert et permettre le culot à sécher à l’air pendant 15 min.
- Stocker l’ADN précipité à-20 ° C jusqu'à ce qu’il est nécessaire pour la transfection.
6. isoler humaines globules rouges du sang total en préparation pour la Transfection
- Sang frais aliquot dans des tubes conique stérile de 50 mL (environ 25 mL par tube).
- Centrifuger les tubes à 1 088 x g pendant 12 min, avec frein centrifuge la valeur 4.
- Aspirer au large de la couche surnageante et buffy. Resuspendre le culot de RBC à un volume égal de RPMI incomplète.
Remarque : RPMI incomplète est préparé en complétant le RPMI 1640 avec 10,32 thymidine μM, 110,2 hypoxanthine μM, pyruvate de sodium 1 mM, bicarbonate de sodium de 30 mM, 5 mM HEPES, 11,1 mM de glucose et gentamicine 0,02 % (v/v). - Répétez les étapes 6.2-6.3 deux fois. Après le dernier lavage, remettre en suspension les globules rouges dans un volume égal de RPMI incomplète et stockez les tubes à 4 ° C.
7. transfectant globules rouges avec les plasmides CRISPR/Cas9 (à faire de façon aseptique)
NOTE : Cultures P. falciparum sont maintenues comme décrit dans d’autres rapports17. Maintenir toutes les cultures à 37 ° C sous les 3 % O2, 3 % de CO2et 94 % N2 sauf indication contraire. Chaque fois que le sang est utilisé dans le présent protocole, il se réfère aux pures hématies préparées à l’étape 6. Le sang utilisé ne doit pas être plu de 6 semaines, car il y a généralement une diminution de la prolifération de parasites dans le sang plus âgé. Les étapes suivantes décrivent RBCs pré chargement avec l’ADN et l’ajout d’une culture de parasite pour les cellules transfectées. Autres protocoles de transfection établies sont compatibles avec transfectants ces constructions18,19.
- Préparer un tampon de x cytomix 1 dans l’eau (120 mM de KCl, 0. 15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6). Filtre-stériliser le tampon à l’aide d’un filtre de 0,22 µm.
- Ajouter 380 μL de la cytomix de 1 x à l’ADN précipité à l’étape 5 et vortex pour dissoudre. Permettre à l’ADN à se dissoudre dans la cytomix 1 x pendant 10 minutes, Vortex toutes les 3 minutes pour 10 s.
- Dans un tube conique stérile de 15 mL, mélanger 300 μL de globules rouges (hématocrite de 50 %, de l’étape 6) dans le RPMI incomplète avec 4 mL de 1 x cytomix.
- Centrifuger les globules rouges de l’étape 7.3 à 870 x g pendant 3 min et puis retirer le surnageant et le culot de RBC.
- Resuspendre le culot de RBC avec le mélange de l’ADN/cytomix de l’étape 6.2 et transfert dans une cuvette d’électroporation de 0,2 cm.
- Electroporate les globules rouges en utilisant les conditions suivantes : 0,32 kV, 925 μF, capacité égale à « High Cap » et résistance la valeur « Infinite ».
- Suite d’électroporation, transférer le contenu de la cuve dans un 15 mL conique contenant 5 mL de RPMI complet (cRPMI). Centrifuger le tube à 870 x g pendant 3 min à 20 ° C et ensuite éliminer le surnageant.
NOTE : cRPMI est établi par la même méthode que RPMI incomplète avec l’addition d’albumine sérique bovine de 0,25 % (p/v) riches en lipides. - Resuspendre le culot dans 4 mL de cRPMI et de la transférer dans un puits dans une plaque de culture de tissu de 6 puits. Ajouter 400 ml d’une culture de haute-schizonte (7 à 10 % schizonte parasitémie est idéal) pour les hématies transfectées.
NOTE : Parasitémie est définie comme le pourcentage de globules rouges infectés par le parasite. - Le lendemain, lavez la culture avec 4 mL de cRPMI. Centrifuger la culture à 870 x g pendant 3 min et aspirer le surnageant. Remettre en suspension de la culture dans 4 mL de cRPMI.
- 48 h après la fin de l’étape 7.6, laver la culture avec 4 mL de cRPMI. Puis remettre en suspension de la culture en cRPMI contenant 1 μM DSM1 sélectionner pour le plasmide Cas9.
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Continuer le lavage les cultures chaque jour avec cRPMI jusqu'à ce que les parasites ne sont plus visibles par le frottis sanguin. Après ce point, remplacer le milieu de culture avec cRPMI frais plus 1 μM DSM1 toutes les 48 h.
- Pour réserver un sang frottis, distribuer 150 μL de la culture dans un tube à centrifuger 0,6 mL. Les cellules de granule par centrifugation à 1 700 x g pendant 30 s.
- Aspirer hors le surnageant. Utiliser une pipette pour transférer les cellules granulés à une lame de verre. À l’aide d’une deuxième lame de verre qui s’est tenue à un angle de 45° à la première diapositive, enduire la goutte de sang. Tache de la diapositive à l’aide d’un kit de coloration commercialement disponible selon le protocole du fabricant.
- Découvre les parasites à l’aide d’un 100 X objectif à immersion d’huile.
- Compter 5 jours après la transfection (étape 7,6), enlever 2 mL de la culture avec RBCs remis en suspension dans le milieu de culture. Ajouter arrière 2 mL de milieu frais (cRPMI et 1 μM DSM1) et à 2 % hématocrite du sang. Ajouter du sang frais de cette manière une fois par semaine jusqu'à ce que les parasites réapparaissent, tel que déterminé par frottis sanguins minces (étape 7.11).
Remarque : Si l’intégration est réussie, parasites généralement réapparaissent dans la culture d’un mois après transfection. - Une fois les parasites réapparaître, supprimer la pression de drogue DSM1. Vous pouvez également supprimer la pression de drogue après que parasites ont été clonés à.
8. contrôle des Parasites pour l’intégration du modèle de réparation
- Lorsque les parasites sont visibles à nouveau par frottis sanguin mince, isoler l’ADN de la culture à l’aide d’un kit approprié.
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Utilisent la PCR pour amplifier la région modifiée du génome pour déterminer si le locus ciblé a été modifié avec succès et si le locus sauvage non modifié (indicatif de parasites de type sauvage) est détectable.
- Pour détecter les parasites qui ont intégré le modèle de la réparation, utiliser un apprêt avant qui se trouve au début de l’ORF, en dehors de la région d’homologie clonés. Utiliser un apprêt inverse qui se trouve dans la 3'-UTR.
Remarque : Comme cette amplification comprend les séquences des tags HA et MLG ribozyme, amplicons de parasites intégrés sera plus longue que la région même amplifiée dans les parasites de type sauvage.
- Pour détecter les parasites qui ont intégré le modèle de la réparation, utiliser un apprêt avant qui se trouve au début de l’ORF, en dehors de la région d’homologie clonés. Utiliser un apprêt inverse qui se trouve dans la 3'-UTR.
9. clonage Parasites en limitant la Dilution
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Effectuer des dilutions successives de la culture du parasite de l’étape 7.13 pour obtenir une concentration finale de 0,5 parasites/200 μL. Ajouter 200 μl de la culture diluée dans les puits d’une plaque 96 puits vitroplants.
NOTE : Parce que parasitémie est définie comme le pourcentage de globules rouges infectés et l’hématocrite est aussi un nombre défini (2 %), le nombre de parasites par unité de volume est déduit facilement.- Préparer 1 mL de culture en cRPMI à hématocrite de parasitémie et 2 % 5 % (à ces niveaux de parasitémie et de l’hématocrite, la culture contient 1 x 107 parasites/mL).
- Diluer cette culture au 1/100 avec cRPMI. Diluer à nouveau 1/100 avec cRPMI.
- Diluer 1 : 400. Effectuer cette dilution en ajoutant 62,5 μL de la culture à 25 mL de cRPMI et 1 mL de sang. Cette dilution entraîne la concentration désirée de 0,5 parasites/200 μL.
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Maintenir la plaque de clonage jusqu'à ce que les parasites sont détectables dans les puits.
- Toutes les 48 h, remplacer le milieu de la plaque de 96 puits avec un milieu frais.
- Une fois par semaine, à partir de 5 jours après le début de la plaque de clonage (étape 9.1), enlever 100 μL de chaque puits et ajoutez dos 100 μl de milieu frais + sang (hématocrite de 2 %).
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Identifier tout puits contenant des parasites.
- Placer la plaque 96 puits à un angle de 45° pendant environ 20 min, permettant au sang de s’installer dans un angle au sein de la plaque.
- Placer la plaque à 96 puits sur une boîte à lumière. Notez que les puits contenant des parasites contiennent des médias qui sont jaunes dans la couleur, par rapport aux médias roses de puits exempt de parasites, en raison de l’acidification du milieu par les parasites.
- À l’aide d’une pipette sérologique, déplacer le contenu des puits contenant du parasite sur une plaque de culture de tissus de 24 puits pour permettre l’expansion de la parasitémie.
- En utilisant l’analyse PCR comme décrit à l’étape 8, vérifiez ces lignes clonale parasite pour une intégration correcte.
10. la précipitation de la protéine en traitant les Parasites avec Glucosamine et Confirmation par analyse par Western Blot
- Préparer une solution-mère 0,5 M GlcN (glucosamine), qui peut être conservée à-20 ° C.
- Ajouter GlcN aux cultures parasite MLG et laissez-les croître en présence de GlcN.
Remarque : La concentration finale et le calendrier de traitement GlcN dépend de l’expérience et parasite de la ligne. GlcN peut impacter la croissance du parasite, donc la souche parentale parasite doit être exposée à un éventail de GlcN des concentrations de déterminer sa sensibilité au composé. Souvent, une concentration de 2.0 à 7,5 mM GlcN est utilisé13,14,20. - Isoler des échantillons de protéine du parasites traités GlcN13.
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Utiliser des échantillons de protéine pour analyse par western blot pour détecter des réductions dans la protéine13.
- Utilisez un anticorps anti-HA selon les instructions du fabricant pour détecter la protéine HA-MLG-tag. Comparer la bande HA à un contrôle de chargement, par exemple PfEF1α.
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Representative Results
Figure 1montre une représentation schématique des plasmides utilisés dans cette méthode, mais aussi un exemple d’une mutation de bouclier. Comme un exemple de comment identifier les parasites mutants après la transfection, résultats de PCR pour vérifier l’intégration de la construction deMLG HA - sont indiquées à la Figure 2. Une image représentative d’une plaque de clonage est montrée à la Figure 3 pour démontrer le changement de couleur du milieu en présence de parasites. Résultats d’un test d’immunofluorescence et western blot expériences sont indiquées à la Figure 4 pour illustrer la fonctionnalité de l’étiquette de HA et la MLG-fonction réduction des protéines dans les parasites. La figure 5 illustre l’incapacité du bras court d’homologie sur les produits PCR à modifier les génomes de parasite et d’obtenir des mutants viables.
Figure 1 : Résumé de notre approche de trois-plasmide CRISPR/Cas9 et les exemples d’une mutation d’oligo et bouclier gRNA. (A) schémas de pHA-MLG vide et pMK-U6 sont affichés avec les sites de restriction enzyme utilisées pour le clonage. Également montré sont pHA-MLG et pMK-U6 après les bras de l’homologie et gRNA séquences ont été clonés en eux, respectivement. Enfin, pUF1-Cas9 est montré. yDHOD = levure dihydrofolate réductase, le marqueur de résistance aux DSM1. (B) les oligo avant utilisée pour le clonage de la séquence de gRNA PfHsp70x en PCM-U6 est affichée avec la séquence gRNA en lettres capitales et les bras d’homologie de pMK-U6 nécessaires pour le clonage en minuscules (en haut). L’objectif de génomique de la gRNA PfHsp70x est présenté comme la PAM en aval, en rouge (au milieu). La mutation de bouclier dans la PfHsp70x gRNA PAM est indiquée en rouge (en bas). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : schéma de modification du génome CRISPR/Cas9 à l’aide de pHA-MLG et une stratégie afin de confirmer l’intégration. (A) Cas9, guidé à un locus génomique par un gRNA, induit une rupture de double brin de l’ADN. Le parasite répare les dommages par le biais de double liaison homologue réparation, en utilisant comme modèle le plasmide de pHA-MLG et introduire la séquence HA-MLG dans le génome. (B), un test par PCR pour identifier la bonne intégration de la séquence de HA-MLG. En utilisant des amorces P1 et P2, le 3' ORF des mutants sur le sauvage PfHsp70x et PfHsp70x - laMLG sont amplifiés13. L’amplicon de PfHsp70x-MLG est plu sauvage en raison de l’insertion de la séquence de HA-MLG. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Identification des puits contenant des parasites dans une plaque à 96 puits clonage. (A) la plaque 96 puits est fixée à un angle de 45 ° pour environ 20 min pour permettre au sang de s’établir à un angle de la plaque. (B) le puits à gauche contient une culture de parasite, indiquée par la couleur jaune du milieu en comparaison avec le milieu rose des parasites sans bien sur la droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : un test d’immunofluorescence montre la bon HA-marquage des PfHsp70x et éponger occidental montre la réduction du taux de protéines de PfHsp70x pendant le traitement par glucosamine. (A) PfHsp70x -MLG parasites ont été fixées et colorées au DAPI (marqueur de noyau) et les anticorps anti-HA et MAHRP1 (Membrane associés Histidine Rich Protein 1, un marqueur de l’exportation de protéines vers l’hôte RBC)13. (B) PfHsp70x -MLG parasites ont été traités avec 7,5 mM glucosamine et lysats ensemble-parasite ont été utilisés pour Western blotting analyse13. La membrane a été sondée avec des anticorps pour HA et PfEF1α comme un chargement de contrôle13. Comme prévu, traitement glucosamine a entraîné une réduction de la protéine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : à l’aide de séquences courtes homologie pour réparation. (A) Représentation schématique montrant knockout de GFP en B7 parasites21. B7 parasites sont un dérivé de 3 7 dans lequel Plasmepsin II a été étiqueté avec GFP. Produits PCR contenant 50, 75 ou 100 paires de bases des régions de l’homologie GFP flanquant une cassette de résistance blasticidine S (étiquetée « marqueur »), ainsi que pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, un plasmide exprimant Cas9 et un gRNA GFP, ont été transfectés dans des parasites B7. Chaque transfection a été réalisée deux fois. DSM1 drogue pression était appliquée 2 jours après la transfection. (B) montré ici sont les tests PCR sur l’ADN isolé de parasites transfectées 5 jours après la transfection et transfection après 2 mois. Les amorces utilisées pour tester l’intégration de la cassette de résistance BSD donnera un produit 584-nucléotide parasitoses parental B7 et 2020-nucléotide, produit contre les parasites qui ont intégré le marqueur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La mise en œuvre de CRISPR/Cas9 à P. falciparum a augmenté l’efficacité des et diminution de la quantité de temps nécessaire pour modifier le génome du parasite, par rapport aux précédentes méthodes de manipulation génétique. Ce protocole complet décrit les étapes nécessaires pour générer des mutants conditionnels à l’aide de CRISPR/Cas9 à P. falciparum. Alors que la méthode ici est conçue spécifiquement pour la génération de HA -MLG mutants, cette stratégie peut être adaptée pour un large éventail de besoins, y compris le marquage des gènes, les débouchures de gène et l’introduction de mutations ponctuelles.
Une étape précoce dans le présent protocole est la sélection d’une séquence gRNA. Lorsque vous sélectionnez un gRNA, il y a plusieurs points à considérer comme où siège le gRNA, il est comment efficace et si oui ou non elle a le potentiel pour des effets hors cible. La séquence gRNA devrait être aussi proche que possible sur le site de modification, idéalement au sein de 200 paires de bases. Cela diminue la probabilité des parasites en utilisant le modèle de la réparation de fixer leur génome sans intégrer la balise. L’outil utilisé ici pour localiser le gRNA était un service gratuit, en ligne, appelé CHOPCHOP,22. Un autre outil en ligne, eucaryotes pathogène CRISPR guide ARN/ADN Design Tool (EuPaGDT ; http://grna.ctegd.uga.edu/), peut également être utilisé23. EuPaGDT fournit une caractérisation plus poussée des séquences gRNA, y compris la prévision de visites hors cible et les problèmes potentiels qui peuvent empêcher la transcription de la gRNA. EuPaGDT a également des outils pour le traitement par lots de gRNAs pour cibler plusieurs gènes ou génomes entiers. Le gRNA sélectionné devrait être celui qui se trouve plus proche du site de modification avec le rendement le plus élevé et un minimum hors cible hits. Une limitation importante de l’édition de gène CRISPR/Cas9 pouvant survenir est l’incapacité de concevoir un gRNA adapté pour cibler le gène d’intérêt. Dans ce cas, une approche essais-erreurs peut-être être nécessaires, à l’aide de multiples séquences sous-optimal gRNA jusqu'à ce que la meilleure solution est trouvée, et édition réussie gène s’est produite.
Un autre facteur important à considérer lors de la génération de mutants P. falciparum à l’aide de CRISPR/Cas9 est la longueur des régions d’homologie utilisé dans le modèle de la réparation. Ce protocole recommande que les régions d’homologie devraient être environ 800 paires de base chaque, mais nous avons également réussi en utilisant de plus petites régions 500 paires de bases3de numérotation. Modification de génome avec succès en utilisant CRISPR/Cas9 et armes d’homologie court sur les produits PCR ont également été utilisés dans les autres parasites protozoaires tels que Toxoplasma gondii et Trichomonas vaginalis24,25. Nous avons testé la faisabilité d’utiliser des petits bras d’homologie sur des produits PCR (50, 75 ou 100 paires de bases) en tentant de knockout GFP en B7 parasites à l’aide d’une cassette de résistance blasticidine21. Nous avons vu une intégration de la cassette de résistance blasticidine à 5 jours après la transfection ; Toutefois, ces parasites jamais retrouvé de transfection. Pour ces transfections, nous avons choisi pour le plasmide exprimant Cas9 utilisant DSM1. Une méthode de sélection différente, comme traitement des cultures transfectées avec blasticidine S seuls ou en combinaison avec DSM1, peut-être améliorer les chances de réapparaître lors de l’utilisation de courtes régions homologie pour réparer les sauts de Cas9/gRNA-induite de parasites. Dans ce cas, nous n’avez pas sélectionné avec blasticidine S étant donné que nous avons voulu vérifier si bras court d’homologie pourraient être utilisées dans les cas où une cassette de résistance de drogue n’est pas intégrée dans le génome, par exemple lorsqu’une protéine est être étiquetée.
Les composants principaux de l’édition de gène CRISPR/Cas9 examinés sont l’endonucléase Cas9, le gRNA et le modèle de la réparation. Les auteurs décrivent une approche de trois-plasmide pour introduire ces composants dans les parasites, où Cas9, le gRNA et le modèle de réparation sont trouvent dans les plasmides distincts. En plus de cette approche, notre laboratoire a réussi en utilisant une approche de deux plasmide où expression Cas9 et gRNA sont conduits par un plasmide et le modèle de réparation se trouve dans un deuxième plasmide3. Des approches similaires de deux-plasmide ont également été utilisés avec succès par d’autres laboratoires pour générer des mutants7,8,26,27,28,29. En outre, plusieurs laboratoires sont en utilisant une souche de Plasmodium (NF54attB) qui exprime constitutivement Cas9 et une ARN polymérase T7 à l’expression de la promenade de gRNAs30. Dans ce cas, un plasmide contenant le modèle de la réparation et la gRNA transfected dans NF54attB parasites31,32. Enfin, une approche sans plasmide utilisant une ribonucléoprotéine Cas9-gRNA purifiée complexe a été utilisée pour insérer des mutations dans le génome, comme bien33. Le succès de ces différentes approches montre la souplesse des méthodes dans lequel les chercheurs peuvent introduire Cas9/gRNA composants dans le parasite.
Enfin, le choix de la pression de la drogue à appliquer aux parasites transfectées peut être modifié, selon les constructions utilisées. Ici, nous montrons génération réussie de mutants en sélectionnant transitoirement pour le plasmide exprimant Cas9 avec DSM1 jusqu'à ce que les parasites réapparaissent. Pour générer des parasites knockout PfHsp70x, pfhsp70x a été remplacé avec le gène de réductase de dihydrofolate humaine et parasites ont ensuite été sélectionnées à l’aide de WR9921013. Le système de knockdown de Tite-PfDOZI récemment décrit repose sur l’intégration d’un plasmide contenant un gène de résistance de blasticidine S, permettant la sélection des parasites à l’aide de blasticidine S15,31.
Dans l’ensemble, CRISPR/Cas9 gène édition de P. falciparum s’est avéré pour être un outil puissant pour la recherche sur le paludisme, et le protocole ici détaille les méthodes pour générer des mutants knockdown conditionnelle3,7,8 , 13 , 20 , 28. le présent protocole est hautement adaptable aux intérêts individuels de recherche.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Muthugapatti Kandasamy au cœur microscopie biomédicale Université de Georgie (UGA) pour l’assistance technique et Jose-Juan Lopez-Rubio pour partager les plasmides pUF1-Cas9 et pL6. Ce travail a été soutenu par ARCS Foundation awards à D.W.C. et à H.M.K., accorde des fonds de démarrage UGA à V.M., subventions de la March of Dimes Foundation (Bourse de recherche universitaire Basil o ' Connor Starter) V.M. et US National Institutes of Health (R00AI099156 et R01AI130139) à V.M. et (T32AI060546) à H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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