Summary
Nós descrevemos um método para gerar MLG-baseado condicionais "knockdown" mutantes do Plasmodium falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma.
Abstract
A malária é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Esta doença, que afeta principalmente aqueles que vivem em regiões tropicais e subtropicais, é causada pela infecção por parasitas Plasmodium . O desenvolvimento de drogas mais eficazes para combater malária pode ser acelerado por melhorar a nossa compreensão da biologia do parasita deste complexa. Manipulação genética destes parasitas é a chave para entender a biologia deles; no entanto, historicamente o genoma de p. falciparum tem sido difícil de manipular. Recentemente, a edição de genoma CRISPR/Cas9 tem sido utilizada em parasitas da malária, permitindo a proteína mais fácil tagging, geração de knockdowns proteína condicional e a supressão de genes. Edição de CRISPR/Cas9 genoma provou para ser uma ferramenta poderosa para fazer avançar o campo da investigação de malária. Aqui, descrevemos um método CRISPR/Cas9 para gerar MLG-baseado condicionais mutantes knockdown no p. falciparum. Este método é altamente adaptável a outros tipos de manipulações genéticas, incluindo a proteína de marcação e nocautes de gene.
Introduction
A malária é uma doença devastadora causada por protozoários parasitas do gênero Plasmodium. Por p. falciparum, parasita da malária humana mortal mais, faz com que aproximadamente 445.000 mortes por ano, principalmente em crianças menores de cinco1. Plasmodium parasitas têm um ciclo de vida intrincado envolvendo um vetor mosquito e um hospedeiro vertebrado. Os seres humanos primeiro tornar-se infectado quando um mosquito infectado leva uma refeição de sangue. Então, o parasita invade o fígado, onde cresce, se desenvolve e divide-se por aproximadamente uma semana. Após este processo, os parasitas são liberados na corrente sanguínea, onde passam a replicação assexuada em glóbulos vermelhos (hemácias). Crescimento dos parasitas dentro as hemácias são diretamente responsáveis pelos sintomas clínicos associados com malária2.
Até recentemente, a produção de transgênicos por p. falciparum era um processo trabalhoso, envolvendo várias rodadas de seleção de drogas que levou muitos meses e tinha uma taxa de falhas elevada. Este procedimento demorado relieson a geração de DNA aleatória quebra na região de interesse e a capacidade endógena do parasita para emendar o seu genoma no entanto reparo homólogo3,4,5,6 . Recentemente, agrupado regularmente intercaladas Palindromic Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) genoma edição tem sido com sucesso utilizada no p. falciparum7,8. A introdução desta nova tecnologia na investigação da malária tem sido fundamental para fazer avançar a compreensão da biologia desses parasitas Plasmodium mortal. CRISPR/Cas9 permite a segmentação específica de genes através de guia de RNAs (gRNAs) que são homólogas ao gene de interesse. O complexo de gRNA/Cas9 reconhece o gene através a gRNA e Cas9 então introduz uma ruptura da dobro-costa, forçando a iniciação dos mecanismos de reparação no organismo9,10. Porque por p. falciparum não possui a maquinaria para reparar quebras de DNA através de fim não-homóloga juntando, ele utiliza mecanismos de recombinação homóloga e integra modelos de DNA homólogos transfectados para reparar o Cas9/gRNA-induzido ruptura da dobro-Costa11,12.
Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de mutantes "knockdown" condicionais em p. falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma. O protocolo demonstra o uso da ribozima MLG para níveis da proteína condicionalmente knockdown de PfHsp70x (PF3D7_0831700), um acompanhante exportados pelo p. falciparum em host de hemácias13,14. A ribozima MLG é ativada pelo tratamento com glucosamina (que é convertido em glucosamina-6-fosfato nas células) para decompor seu mRNA associado, levando a uma redução na proteína14. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para utilizar outras ferramentas knockdown condicionais, como domínios de desestabilização ou RNA aptamers4,5,15. Nossos detalhes de protocolo a geração de um plasmídeo de reparo que consiste de uma ribozima hemaglutinina (HA) de marca e MLG sequência flanqueada por sequências de código que são homólogas ao frame de leitura aberto PfHsp70x (ORF) e 3'-UTR. Também descrevemos a geração de um plasmídeo segundo a expressão de unidade da gRNA. Estes dois plasmídeos, juntamente com um terceiro que impulsiona a expressão de Cas9, são transfectados em hemácias e usados para modificar o genoma de parasitas por p. falciparum . Finalmente, descrevemos uma reação em cadeia do polymerase (PCR)-com base técnica para verificar a integração da ribozima tag e MLG . Este protocolo é altamente adaptável para a modificação ou nocaute completo de quaisquer genes de p. falciparum , aumentando nossa capacidade de gerar novos insights sobre a biologia do parasita da malária.
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Protocol
Cultura contínua de p. falciparum requer o uso de hemácias humanas, e utilizamos o comercialmente adquiridas unidades de sangue que foi despojado de todos os identificadores e anónimos. O Conselho de revisão institucional e o escritório de Biossegurança da Universidade da Geórgia revistos nossos protocolos e aprovaram todos os protocolos utilizados em nosso laboratório.
1. escolher uma sequência de gRNA
- Vá para CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) e selecione ' Fasta destino '. Em 'Destino', Cole os 200 pares de base da extremidade 3' do quadro de leitura aberta (ORF) de um gene e 200 pares de base desde o início do 3'-UTR do gene. Em 'In', selecione 'P. falciparum' (3 a 7 v 3.0) e selecione ' CRISPR/Cas9 ' sob 'Using'. Em seguida, clique em ' encontrar Sites de destino '.
- Selecione uma sequência de gRNA as opções apresentadas, dando preferência para a gRNA mais eficiente, que está mais próximo do local da modificação e que tem os menor número locais fora do alvo.
Nota: Sequências de gRNA potenciais são identificadas porque eles são imediatamente rio acima de um Protospacer adjacentes Motif (PAM), que é necessário para o recrutamento de Cas9 ao DNA. A sequência que é clonada em pMK-U6, o vetor que impulsiona a gRNA expressão, é as 20 bases imediatamente a montante do PAM. O PAM específico para S. pyogenes Cas9 é a sequência de nucleotídeos NGG e não deve ser incluído na sequência que é clonada em pMK-U6.
Nota: CHOPCHOP visualmente classifica as sequências de gRNA, exibindo as melhores opções em verde, as opções menos ideais em âmbar e as piores opções em vermelho. CHOPCHOP dá cada sequência de gRNA um escore de eficiência que é calculado usando os parâmetros mais atualizados encontrados na literatura, e predizem sites fora do alvo que podem ser reconhecidos pela gRNA. Duas ou três sequências de gRNA podem precisar ser tentou encontrar a gRNA melhor adequado para um determinado gene. - Compra a sequência de gRNA e seu reverso-complemento como oligos purificado por eletroforese em Gel de poliacrilamida. A sequência de gRNA usada para alvo PfHSP70x pode ser encontrada na figura 1B.
Nota: Este oligo deve incluir 15 pares de bases homólogas para o plasmídeo expressando a gRNA, que são necessários para a sequência e independente de ligadura da clonagem (SLIC) para o vetor de pMK-U616.
2. clonagem a gRNA sequência em pMK-U6
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Digeri o pMK-U6 com BtgZI.
- Digest 10 μg de pMK-U6 com 5 μL de enzima BtgZI (5.000 unidades/mL) por 3 h a 60 ° C. Siga o protocolo do fabricante enzima para condições de reação.
- Após o período de incubação de 3 h, adicione um adicional 3 μL de BtgZI para a reação para garantir a digestão completa do plasmídeo. Digerir por um adicional 3 h, ainda seguindo as instruções do fabricante para garantir as condições de reação correta.
- Para purificar o pMK-U6 digerido da reação, use um kit de limpeza PCR baseados em colunas de acordo com as instruções do fabricante.
- Separar o DNA digerido usando um gel de agarose 0.7% e extrair a banda base de 4.200 par.
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Recoze a oligos contendo a sequência de gRNA.
- Reconstitua os oligos purificado de página para uma concentração de 100 μM usando água livre de nuclease.
- Combine 10 μL de cada oligo com 2.2 μL de tampão de x 10 2 (ver Tabela de materiais). Certifique-se de que o volume total da reação é 22,2 μL.
- Executar o programa em um thermocycler do recozimento gRNA: passo 1: 95 ° C, 10 min; Passo 2: 95 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 3: Vá para a etapa 2, 16 vezes; Passo 4: 85 ° C, 1 min; Passo 5: 85 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 6: Vá para o passo 5, 16 vezes; Passo 7: 75 ° C, 1 min; Passo 8: 75 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 9: Vá para o passo 8, 16 vezes. Etapas de 10 a 21: repita o procedimento usado nas etapas 4 a 9 até que a temperatura atinja 25 ° C; Passo 22:25 ° C, a 1 min.
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Insira os oligos recozido gRNA o plasmídeo pMK-U6 BtgZI-digerido e gel-purificado.
- Combinam 100 ng de pMK-U6 digerido com 1 μL de 10x buffer 2.1 e 3 μL de oligos gRNA recozido. Aumente o volume para 9,5 μL com água livre de nuclease.
- Adicionar 0,5 μL de T4 polimerase e incubar a reação na temperatura de quarto para 2,5 min.
- Mova a reação ao gelo e incubar durante 10 min.
- Imediatamente transforme 5 μL da reação em competentes de Escherichia coli de acordo com as instruções do fornecedor de bactérias. Placa de bactérias em placas de ágar caldo lisogenia (LB), contendo 100 μg/mL ampicilina.
- Permitir que as bactérias transformadas para crescer a 37 ° C durante a noite, em seguida, selecionar colônias e extrair DNA com um kit de miniprep plasmídeo comercialmente disponível.
3. criação de regiões de homologia do modelo de reparação
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Projeto escudo mutações dentro do modelo de reparação de homologia para evitar re-corte do DNA que é integrado no genoma.
Nota: Uma mutação de escudo normalmente consiste em introduzir uma mutação silenciosa para alterar o PAM para que Cas9 não induzirá uma ruptura no modelo de reparação. O PAM necessários para o Cas9 usado neste protocolo é a sequência de nucleotídeos "NGG", onde "N" é qualquer nucleotídeo. Se possível, mudar um dos nucleotídeos G para um A, C ou T.- Se o PAM não pode ser mutated silenciosamente, apresente pelo menos 2 mutações silenciosas para os 6 pares de base diretamente adjacentes ao PAM7,8.
Nota: Estas mutações poderá impedir o reconhecimento do modelo de reparação pela gRNA e evitar a re-corte do locus reparado pelo Cas9/gRNA complexo. As mutações do escudo podem ser introduzidas na região de homologia amplificando o DNA com primers que contêm a mutação.
- Se o PAM não pode ser mutated silenciosamente, apresente pelo menos 2 mutações silenciosas para os 6 pares de base diretamente adjacentes ao PAM7,8.
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Amplifica a região de homologia ORF para o modelo de reparação.
- Usando o PCR, amplifica 800 pares de base da extremidade 3' da ORF do gene do alvo. Desenha os primers que serão usados para excluir o codão stop esta amplicon.
- Desenha os primers para a inserção deste amplicon na pHA -MLG tem sido digerido com SacII e AfeI através de uma reação de ligadura do ADN ou SLIC16.
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Amplifica a região 3'-UTR de homologia para o modelo de reparação.
- Usando o PCR, amplifica as 800 pares de bases, imediatamente após o stop códon do gene do alvo. Desenho de primers para inserção deste amplicon na pHA -MLG tem sido digerido com HindIII e NheI através de uma reação de ligadura do ADN ou SLIC16.
Nota: O alto no conteúdo do genoma de p. falciparum pode dificultar a amplificação de regiões como UTRs. Uma abordagem alternativa ao uso de PCR está sintetizando as regiões de homologia.
- Usando o PCR, amplifica as 800 pares de bases, imediatamente após o stop códon do gene do alvo. Desenho de primers para inserção deste amplicon na pHA -MLG tem sido digerido com HindIII e NheI através de uma reação de ligadura do ADN ou SLIC16.
4. clonagem de regiões de homologia no plasmídeo de reparação
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Inserir a pHA -MLG, região de homologia ORF.
- Digeri a pHA -MLG com SacII e AfeI, de acordo com as instruções do fabricante da enzima. Insira o produto PCR de região de homologia ORF o plasmídeo digerido usando SLIC16.
- Transforme em competentes de Escherichia coli como realizado em etapas 2.3.4 e 2.3.5.
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Inserir a região 3'-UTR de homologia em um plasmídeo de pHA-MLG que já contém a região de homologia ORF (consulte a etapa 4.1).
- Digeri o plasmídeo com HindIII e NheI de acordo com as instruções do fabricante da enzima. Inserir o plasmídeo digerido usando SLIC16o 3'-UTR homologia região amplicon.
- Transformar em competentes de Escherichia coli e extrair o plasmídeo (etapas 2.3.4 e 2.3.5).
5. precipitação de DNA para transfeccao
- Adicione 40 μg de pMK-U6, pUF1-Cas9 e pHA -MLG DNA (para um total de 120 μg de DNA) em um tubo de microcentrifuga estéril 1,5 mL.
- Adicionar 1/10th do volume de DNA de 3 M de acetato de sódio em água (pH 5.2) para o tubo e misture bem, usando um vórtice (por exemplo, se o volume na etapa 5.1 foi 100 μL, adicionar 10 μL de acetato de sódio).
- Adicionar 2,5 vezes o volume de 100% de etanol ao tubo e misture bem, usando um vórtice pelo menos 30 s (por exemplo, se o volume em 5.1 foi 100 μL, adicionar 250 μL de 100% de etanol).
- Coloca o tubo no gelo ou a-20 ° C por 30 min.
- Centrifugar o tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Não perturbe a pelota.
- Adicionar 3 vezes o volume de etanol a 70% para o tubo e misture rapidamente, usando um vórtice (ex., se o volume em 5.1 foi 100 μL, adicionar 300 μL de etanol a 70%).
- Centrifugar o tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
Nota: Esta etapa deve ser realizada em condições estéreis em uma câmara de segurança biológica. - Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Não perturbe a pelota. Deixar o tubo aberto e permitir a pelota secar ao ar durante 15 minutos.
- Armazene o DNA precipitado a-20 ° C até que ela é necessária para transfeccao.
6. isolamento humanos glóbulos vermelhos do sangue inteiro em preparação para transfeccao
- Alíquota sangue fresco em tubos cônicos de estéril 50 mL (aproximadamente 25 mL por tubo).
- Centrifuga os tubos a 1.088 x g durante 12 min, com freios de centrífuga definidos como 4.
- Aspire pelo casaco o sobrenadante e buffy. Ressuspender o RBC com um volume igual de RPMI incompleta.
Nota: RPMI incompleta é preparado completando RPMI 1640 com 10.32 timidina μM, 110.2 hipoxantina μM, piruvato de sódio 1 mM, 30 mM de bicarbonato de sódio, 5 mM HEPES, glicose 11,1 mM e gentamicina 0,02% (v/v). - Repita as etapas de 6.2 – 6.3 duas vezes. Após a última lavagem, Ressuspender as hemácias em um volume igual de RPMI incompleta e armazenar os tubos a 4 ° C.
7. transfecting hemácias com o plasmídeo CRISPR/Cas9 (para ser feito em condições assépticas)
Nota: P. falciparum culturas são mantidas conforme descrito em outros relatórios de17. Manter todas as culturas a 37 ° C em 3% O2, 3% de CO2e 94% N2 , salvo indicação em contrário. Sempre que o sangue é usado no presente protocolo, ele está se referindo as células vermelhas do sangue puras preparadas no passo 6. O sangue utilizado não deve ser mais de 6 semanas, como normalmente há uma diminuição da proliferação do parasita no sangue mais velho. As etapas a seguir descrevem hemácias pre-carregamento com DNA e adicionando uma cultura parasita as células transfectadas. Outros protocolos de transfeccao estabelecidos são compatíveis com transfecting estas construções18,19.
- Prepare um 1 buffer de x cytomix na água (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2mm EGTA, 5 mM MgCl2, 10mm K2HPO4, 25mm HEPES, pH 7,6). Filtro-esterilize o buffer usando um filtro de 0,22 μm.
- Adicione 380 μL do cytomix 1x para o DNA precipitado na etapa 5 e o vórtice para dissolver. Permitir que o DNA se dissolva no cytomix 1 x por 10 minutos, num Vortex cada 3 min para 10 s.
- Em um tubo cônico estéril 15ml, combinar 300 μL de glóbulos vermelhos (hematócrito de 50%, da etapa 6) no RPMI incompleto com 4 mL de 1x cytomix.
- Centrifugar as hemácias de passo 7.3 a 870 x g durante 3 min e em seguida retire o sobrenadante a pelota de RBC.
- Resuspenda o pellet de RBC com a mistura de DNA/cytomix da etapa 6.2 e transferência para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm.
- Electroporate as hemácias usando as seguintes condições: 0.32 kV, 925 μF, capacitância, definida como "Alta Cap" e a resistência definida como "Infinito".
- Seguindo electroporation, transferi o conteúdo da cubeta para um 15ml cónico contendo 5 mL de RPMI completa (cRPMI). Centrifugar o tubo a 870 x g durante 3 minutos a 20 ° C e em seguida decante o sobrenadante.
Nota: cRPMI é preparado por meio do mesmo método como RPMI incompleta com a adição de 0,25% (p/v) rica em lipídios albumina de soro bovino. - Resuspenda o pellet em 4 mL de cRPMI e a transferência de um bem em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços. Adicionar 400 μL de uma cultura de alta-schizont (7 – 10% schizont parasitemia é ideal) para as hemácias transfectadas.
Nota: Parasitemia é definida como a porcentagem de hemácias infectadas por parasita. - No dia seguinte, lave a cultura com 4 mL de cRPMI. Centrifugar a cultura a 870 x g por 3 min e aspirar o sobrenadante. Resuspenda a cultura em 4 mL de cRPMI.
- 48 h após completar o passo 7,6, lave a cultura com 4 mL de cRPMI. Resuspenda então a cultura em cRPMI contendo 1 μM DSM1 para selecionar para o plasmídeo Cas9.
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Continue lavando as culturas cada dia com cRPMI até parasitas não são mais visíveis por esfregaço de sangue. Após este ponto, substitua o meio de cultura fresco cRPMI mais 1 μM DSM1 cada 48 h.
- Para fazer um sangue manchar, pipetar 150 μL da cultura para um tubo de centrífuga de 0,6 mL. As células de pelotas por centrifugação a 1.700 x g durante 30 s.
- Aspire o sobrenadante. Utilize uma pipeta para transferir as células peletizadas para uma lâmina de vidro. Usar uma lâmina de vidro a segunda realizada em um ângulo de 45° para o primeiro slide, manchar a gota de sangue. Mancha o slide usando um kit de coloração comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.
- Ver os parasitas usando um 100 X objetivo de imersão de óleo.
- Começando a 5 dias pós-transfecção (etapa 7,6), remover 2 mL da cultura com hemácias resuspended em meio de cultura. Adicionar fundos a 2 mL de meio fresco (cRPMI e mais 1 μM DSM1) e sangue em 2% do hematócrito. Adicione sangue fresco desta forma uma vez por semana até parasitas reaparecem, conforme determinado pelo esfregaço de sangue fino (etapa 7.11).
Nota: Se a integração for bem-sucedida, parasitas geralmente reaparecem na cultura por transfecção pós um mês. - Uma vez que os parasitas ressurgir, remova DSM1 pressão de drogas. Como alternativa, remova a pressão de drogas depois de parasitas foram clonadas para fora.
8. verificação de parasitas para a integração do modelo de reparação
- Quando os parasitas são visíveis novamente por esfregaço de sangue fino, isole o DNA da cultura através do kit apropriado.
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Use PCR para amplificar a região modificada do genoma para determinar se o locus de destino foi alterado com êxito e se o locus do selvagem-tipo não modificado (indicativo de parasitas do tipo selvagem) é detectável.
- Para detectar parasitas que integraram o modelo de reparação, use um primer para a frente que fica no início da ORF, fora da região de homologia clonado. Use um primer reverso que senta-se no 3'-UTR.
Nota: Como esta amplificação inclui as sequências das etiquetas HA e MLG ribozima, amplicons de parasitas integradas será maior do que a mesma região amplificada no selvagem-tipo parasitas.
- Para detectar parasitas que integraram o modelo de reparação, use um primer para a frente que fica no início da ORF, fora da região de homologia clonado. Use um primer reverso que senta-se no 3'-UTR.
9. clonagem parasitas limitando a diluição
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Realize diluições em série da cultura parasita da etapa 7.13 a obter uma concentração final de 0,5 μL de parasitas/200. Adicione 200 μL da cultura diluída para os poços de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.
Nota: Porque a parasitemia é definida como a porcentagem de hemácias infectadas e o hematócrito é também um número definido (2%), o número de parasitas por unidade de volume é inferido facilmente.- Prepare-se 1 mL da cultura em cRPMI em 5% parasitemia e 2% de hematócrito (a estes níveis de parasitemia e hematócrito, a cultura contém 1 x 107 parasitas/mL).
- Dilua esta cultura 1: 100 com cRPMI. Dilua novamente 1: 100 com cRPMI.
- Dilua 1: 400. Execute esta diluição adicionando 62,5 μL da cultura de 25 mL de cRPMI e 1 mL de sangue. Esta diluição resulta na concentração desejada de 0,5 μL de parasitas/200.
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Manter a placa de clonagem até parasitas são detectáveis em poços.
- Todos os 48 h, substitua o meio da placa de 96 poços de meio fresco.
- Uma vez por semana, a partir de 5 dias após o início da placa de clonagem (passo 9.1), remover 100 μL de cada poço e adicionar de volta 100 μL de meio fresco + sangue (2% do hematócrito).
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Identifica qualquer poços contendo parasitas.
- Coloque a placa de 96 poços em um ângulo de 45°, por aproximadamente 20 min, permitindo que o sangue ao acordo em um ângulo dentro da placa.
- Coloque a placa de 96 poços em uma caixa de luz. Observe que os poços contendo parasitas contenham a mídia que é amarela na cor, em comparação com os meios de comunicação-de-rosa de poços livre de parasita, devido à acidificação do meio por parasitas.
- Usando uma pipeta sorológica, mover o conteúdo dos poços contendo parasita para uma placa de cultura de tecidos de 24-bem para permitir a expansão da parasitemia.
- Usando a análise PCR conforme descrito na etapa 8, verifique estas linhas parasita clonal para integração correta.
10. knockdown da proteína por tratar parasitas com glucosamina e confirmação via análise ocidental do borrão
- Prepare uma 0,5 M GlcN (glucosamina) solução stock, que pode ser armazenada a-20 ° C.
- Adicionar GlcN para as culturas de parasita MLG e permitir-lhes a crescer na presença de GlcN.
Nota: A concentração final e o tempo de tratamento GlcN depende da linha de experimento e parasita. GlcN podem afetar o crescimento do parasita, então a tensão parasita parental deve ser exposta a uma gama de GlcN concentrações para determinar sua sensibilidade ao composto. Muitas vezes, uma concentração de 2,0-7.5 mM GlcN é usado13,14,20. - Isole amostras da proteína do GlcN-Tratado parasitas13.
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Utilize amostras de proteínas para análise ocidental do borrão para detectar reduções na proteína13.
- Use um anticorpo anti-HA, de acordo com as instruções do fabricante para detectar a proteína HA-MLG-marcados. Compare a banda HA para um controle de carregamento, como PfEF1α.
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Representative Results
Um esquema do plasmídeo utilizado este método, bem como um exemplo de uma mutação do escudo são mostrados na Figura 1. Como um exemplo de como identificar parasitas mutantes depois de transfeccao, resultados de PCRs para verificar a integração da construção deMLG HA - são mostrados na Figura 2. Uma imagem representativa de uma placa de clonagem é mostrada na Figura 3 , para demonstrar a mudança de cor do meio na presença de parasitas. Resultados de um ensaio de imunofluorescência e experimentos de mancha ocidentais são mostrados na Figura 4 para demonstrar a funcionalidade da marca HA e MLG-com base em reduções de proteínas com os parasitas. A Figura 5 demonstra a incapacidade de braços curtos homologia nos produtos PCR para modificar a genoma do parasita e obter mutantes viáveis.
Figura 1: Resumo de nossa abordagem três-plasmídeo CRISPR/Cas9 e exemplos de uma mutação de oligo e escudo de gRNA. (A) esquemas de pHA-MLG vazio e pMK-U6 são mostrados com os enzima de restrição sites usados para clonagem. Também mostrados são pHA-MLG e pMK-U6 após os braços de homologia e gRNA sequências foram clonadas neles, respectivamente. Finalmente, pUF1-Cas9 é mostrado. yDHOD = fermento dihidrofolato reductase, o marcador de resistência a DSM1. (B) encaminhar oligo usado para clonagem a sequência de gRNA PfHsp70x em pMK-U6 é mostrado, com a sequência de gRNA em letras maiusculas e os braços de homologia de pMK-U6 necessários para clonagem em letras minúsculas (em cima). O alvo genômico de gRNA o PfHsp70x é mostrado como o PAM a jusante, em vermelho (médio). A mutação do escudo em gRNA o PfHsp70x PAM é mostrada em vermelho (parte inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: esquema de modificação de genoma CRISPR/Cas9 usando pHA-MLG e uma estratégia para confirmando a integração. (A) Cas9, guiado para um locus genômico por uma gRNA, induz uma dupla vertente de pausa no DNA. O parasita repara os danos através da dupla crossover homólogas reparação, utilizando como o plasmídeo de pHA-MLG e introduzindo a HA-MLG sequência no genoma da. (B), A PCR teste para identificar a integração correta da sequência HA-MLG. Usando as primeiras demão P1 e P2, a 3' ORF de mutantes deMLG de PfHsp70x e PfHsp70x - selvagem-tipo são amplificadas13. O amplicon de PfHsp70x-MLG é mais de tipo selvagem devido à inserção da sequência HA-MLG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: identificação de poços contendo parasitas em uma placa de 96 poços clonagem. (A) a placa de 96 poços é definida em um ângulo de 45 °, por aproximadamente 20 min permitir que o sangue ao acordo em um ângulo da placa. (B) o poço da esquerda contém uma cultura de parasita, indicada pela cor amarela do meio em comparação com o meio-de-rosa do parasita-livre bem à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: um ensaio de imunofluorescência mostra o correto HA-marcação de PfHsp70x e mancha ocidental mostra a redução dos níveis de proteína de PfHsp70x durante o tratamento com glucosamina. (A) PfHsp70x -MLG parasitas foram fixadas e coradas com DAPI (marcador de núcleo) e anticorpos para HA e MAHRP1 (membrana associados Histidine Rich proteína 1, um marcador de proteína de exportação para o host RBC)13. (B) PfHsp70x -MLG parasitas foram tratadas com glucosamina 7,5 mM, e todo-parasita lisados foram utilizados para análise13de mancha ocidental. A membrana foi sondada com anticorpos para HA e PfEF1α como um carregamento de controle13. Como esperado, a glucosamina tratamento resultou em uma redução da proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: usando sequências curtas de homologia para reparo. (A) representação esquemática mostrando nocaute de GFP B7 parasitas21. B7 parasitas são derivadas de 3 7 em que Plasmepsin II tem sido marcado com GFP. Produtos PCR contendo 50, 75 ou 100 pares de base de regiões de homologia GFP flanqueando um estojo de resistência de blasticidin S (rotulado "marcador"), juntamente com pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, um plasmídeo expressando Cas9 e uma gRNA GFP, foram transfectadas em B7 parasitas. Cada transfeccao foi realizado duas vezes. DSM1 drogas pressão foi aplicada 2 dias pós-transfecção. (B) mostrado aqui são testes PCR em DNA isolado de parasitas transfectadas 5 dias pós-transfection e pós-transfecção 2 meses. Primers usados para testar a integração da fita BSD resistência irão produzir um produto de 584-base par parental parasitas B7 e um produto de pares de base 2020 para parasitas que integraram o marcador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A implementação de CRISPR/Cas9 em p. falciparum tanto aumentou a eficiência de e diminuiu a quantidade de tempo necessária para modificar o genoma do parasita, em comparação com os métodos anteriores de manipulação genética. Este protocolo abrangente descreve as etapas necessárias para a geração de mutantes condicionais usando CRISPR/Cas9 em p. falciparum. Enquanto o método aqui é voltado especificamente para a geração de HA -MLG mutantes, esta estratégia pode ser adaptada para uma variedade de necessidades, incluindo a identificação de genes, gene nocautes e a introdução de mutações pontuais.
Um passo crítico precoce neste protocolo é a seleção de uma sequência de gRNA. Ao selecionar uma gRNA, existem vários pontos a serem considerados como onde fica a gRNA e quão eficiente é ou não tem o potencial para efeitos fora do alvo. A sequência de gRNA deveria ser tão próxima quanto possível ao site da modificação, idealmente dentro de 200 pares de bases. Isto diminui a probabilidade dos parasitas usando o modelo de reparação para corrigir seu genoma sem integrar a tag. A ferramenta usada aqui para localizar a gRNA era um serviço gratuito on-line chamado CHOPCHOP22. Outra ferramenta on-line, Eukaryotic patógeno CRISPR guia ferramenta de Design de RNA/DNA (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/), também pode ser usado23. EuPaGDT fornece a caracterização adicional de gRNA sequências, incluindo previsão de possíveis problemas que podem impedir a transcrição da gRNA e hits de fora do alvo. EuPaGDT também possui ferramentas para processamento em lote de gRNAs alvo vários genes ou genomas toda. A gRNA selecionado deve ser aquele que fica mais próximo ao site da modificação com a máxima eficiência e mínimos sucessos fora do alvo. Uma limitação importante da edição de gene CRISPR/Cas9 que pode surgir é a incapacidade de projetar uma gRNA adequado para atingir o gene de interesse. Em tais casos, pode ser necessária uma abordagem de tentativa e erro, usando várias sequências de sub-ótimo gRNA até que seja encontrada a melhor opção, e bem sucedida gene edição ocorreu.
Outro fator importante a considerar ao gerar mutantes de p. falciparum usando CRISPR/Cas9 é o comprimento das regiões de homologia, usado no modelo de reparação. Este protocolo recomenda que as regiões de homologia devem ser aproximadamente 800 pares de bases cada, mas também fomos bem sucedidos no uso de pequenas regiões numeração 500 pares de base3. Modificação do genoma bem sucedida usando CRISPR/Cas9 e braços curtos homologia em produtos do PCR também têm sido utilizados em outras protozoários parasitas como o Toxoplasma gondii e Trichomonas vaginalis24,25. Nós testamos a viabilidade do uso de armas de homologia menores sobre os produtos PCR (50, 75 ou 100 pares de bases) tentando nocaute GFP em B7 parasitas usando uma blasticidin resistência gaveta21. Vimos alguns integração da fita blasticidin resistência a transfeccao de postagem de 5 dias; no entanto, estes parasitas nunca se recuperou do transfection. Para estes transfections, selecionada para o plasmídeo Cas9-expressando usando DSM1. Um método de seleção diferentes, tais como tratamento de culturas transfectadas com blasticidin S sozinho ou em combinação com DSM1, pode melhorar as chances de parasitas, reaparecendo quando usando regiões de homologia mais curtas para reparar as quebras Cas9/gRNA-induzida. Neste caso, nós não selecionou com blasticidin S desde que queríamos testar se braços curtos homologia poderiam ser usados em casos onde uma gaveta de resistência de droga não está sendo integrada no genoma, tais como quando uma proteína está sendo marcada.
Os principais componentes de edição de gene CRISPR/Cas9 discutidas são a endonuclease Cas9, a gRNA e o modelo de reparação. Nós descrevemos uma abordagem de três-plasmídeo para introduzir estes componentes os parasitas, onde o modelo de reparação, a gRNA e Cas9 são encontrados em plasmídeos separados. Além desta abordagem, nosso laboratório tem sido bem sucedido em usar uma abordagem de dois-plasmídeo no qual expressão Cas9 e gRNA são conduzidos por um único plasmídeo e o modelo de reparação é encontrado numa segunda plasmídeo3. Abordagens similares do dois-plasmídeo tem também foi empregadas com sucesso por outros laboratórios para gerar mutantes7,8,26,,27,28,29. Além disso, vários laboratórios estão usando uma estirpe de Plasmodium (NF54attB) que constitutivamente expressa Cas9 e uma T7 RNA polimerase a expressão de unidade de gRNAs30. Neste caso, um único plasmídeo contendo o modelo de reparação e a gRNA são transfectadas em NF54attB parasitas31,32. Finalmente, uma abordagem livre de plasmídeo utilizando um purificado Cas9-gRNA ribonucleoprotein complexo serviu para introduzir mutações no genoma, como bem33. O sucesso dessas diferentes abordagens demonstra flexibilidade dos métodos em que pesquisadores podem apresentar componentes Cas9/gRNA no parasita.
Finalmente, a escolha da pressão de drogas para aplicar a transfectadas parasitas pode ser alterada, dependendo construções usadas. Aqui, nós mostramos bem sucedida geração de mutantes, transitoriamente, selecionando para o plasmídeo Cas9-expressando usando DSM1 até reaparecem parasitas. Para gerar PfHsp70x parasitas de nocaute, pfhsp70x foi substituído pelo gene humano dihidrofolato redutase, e parasitas foram então selecionadas usando WR9921013. O sistema de "knockdown" juntos-PfDOZI recentemente descrito baseia-se na integração de um plasmídeo que contém um gene de resistência de blasticidin S, permitindo a seleção de parasitas usando blasticidin S15,31.
Em geral, CRISPR/Cas9 gene edição de p. falciparum tem provado para ser uma ferramenta poderosa na pesquisa de malária, e o protocolo aqui detalha os métodos para a geração de mutantes "knockdown" condicional3,7,8 , 13 , 20 , 28. o presente protocolo é altamente adaptável aos interesses individuais de pesquisa.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Muthugapatti Kandasamy no núcleo microscopia biomédicas Universidade da Geórgia (UGA) para assistência técnica e Jose-Juan Lopez-Rubio por compartilhar o plasmídeo pUF1-Cas9 e pL6. Este trabalho foi financiado pelo prêmio Fundação arcos D.W.C. e H.M.K., concede fundos de inicialização UGA de V.M., bolsas da Fundação de março das moedas de dez centavos (Basil o ' Connor Starter estudioso Research Award) para V.M. e nos institutos nacionais de saúde (R00AI099156 e R01AI130139) para o V.M. e (T32AI060546) para H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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