Summary
Vi beskriver en metode for å generere glmS-basert betinget knockdown mutanter i Plasmodium falciparum bruker CRISPR/Cas9 genomet redigering.
Abstract
Malaria er en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Denne sykdommen, som hovedsakelig påvirker de som lever i tropiske og subtropiske områder, skyldes infeksjon med Plasmodium parasitter. Utvikling av mer effektiv narkotika for å bekjempe malaria kan akselereres ved å forbedre vår forståelse av biologi denne komplekse parasitten. Genetisk manipulering av disse parasittene er nøkkelen til å forstå deres biologi; men har historisk genomet av P. falciparum vært vanskelig å manipulere. Nylig har CRISPR/Cas9 genomet redigering blitt utnyttet under parasitten, noe som åpner for enklere protein merking, generasjon av betinget protein bokseren, og sletting av gener. CRISPR/Cas9 genomet redigering har vist seg for å være et kraftig verktøy for å fremme feltet malaria forskning. Her beskriver vi en CRISPR/Cas9-metoden for å generere glmS-basert betinget knockdown mutanter i P. falciparum. Denne metoden er svært tilpasningsdyktige til andre typer genetisk manipulasjon, inkludert protein merking og gene fortrenging.
Introduction
Malaria er en ødeleggende sykdom forårsaket av protozoan parasitter av slekten Plasmodium. P. falciparum, de fleste dødelig menneskelig malariaparasitten, forårsaker ca 445.000 dødsfall per år, hovedsakelig i barn under fem1. Plasmodium parasitter har en intrikat livssyklus som involverer en mygg vektor og en virveldyr vert. Mennesker bli først infisert når en infisert mygg tar en blod måltid. Deretter invaderer parasitten leveren hvor det vokser, utvikler og deler i ca en uke. Etter denne prosessen frigis parasitter i blodet, hvor de gjennomgå aseksuell replikering i røde blodceller (RBCs). Veksten av parasitter i RBCs er direkte ansvarlig for kliniske symptomer assosiert med malaria2.
Inntil nylig var produksjonen av transgene P. falciparum en arbeidskrevende prosess, som involverer flere runder med narkotika utvalg som tok mange måneder og hadde en høy strykprosent. Dette tidkrevende prosedyre relieson bryter generering av tilfeldige DNA i regionen rundt og endogene evnen av parasitten å reparere dens Genova skjønt homologe reparasjon3,4,5,6 . Nylig har gruppert regelmessig Interspaced Palindromic gjenta/Cas9 (CRISPR/Cas9) genomet redigering blitt vellykket utnyttet i P. falciparum7,8. Innføringen av denne nye teknologien i malaria forskning har vært avgjørende for fremme forståelse av biologi av disse dødelige Plasmodium parasitter. CRISPR/Cas9 gir spesifikke målretting av gener gjennom guide RNAs (gRNAs) som er homologe til genet av interesse. GRNA/Cas9 komplekse gjenkjenner genet gjennom gRNA, og Cas9 deretter introduserer en dobbel-strand pause, tvinge initiering av reparasjonsmekanismene i organismen9,10. Fordi P. falciparum mangler maskiner for å reparere DNA bryter gjennom ikke-homologe slutten å delta, det utnytter homologe rekombinasjon mekanismer og integrerer transfekterte homologe DNA maler for å reparere Cas9/gRNA-indusert dobbel-strand pause11,12.
Her presenterer vi en protokoll for generering av betinget knockdown mutanter i P. falciparum bruker CRISPR/Cas9 genomet redigering. Protokollen demonstrerer bruken av glmS ribozyme til betinget knockdown protein nivåer av PfHsp70x (PF3D7_0831700), en Anstandsdame eksporteres av P. falciparum til verten RBCs13,14. GlmS -ribozyme aktiveres ved behandling med glucosamine (som er konvertert til glucosamine-6-fosfat i celler) for å holde seg sin tilknyttede mRNA, fører til en reduksjon i protein14. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å utnytte andre betinget knockdown verktøy, for eksempel destabilisering domener eller RNA aptamers4,5,15. Våre protokollen detaljer generering av en reparasjon plasmider bestående av en hemagglutinin (HA) koden og glmS ribozyme koding sekvens flankert av sekvenser som er homologe til PfHsp70x åpent lesing rammen (ORF) og 3-UTR. Vi beskriver også generering av en andre plasmider til stasjonen uttrykk for gRNA. Disse to plasmider, samt en tredje som driver uttrykk for Cas9, er transfekterte i RBCs og brukes til å endre genomet av P. falciparum parasitter. Til slutt, beskriver vi en polymerasekjedereaksjons (PCR)-basert teknikk for å kontrollere integrering av koden og glmS ribozyme. Denne protokollen er svært tilpasningsdyktige for endring eller fullstendig knockout av noen P. falciparum gener, styrke vår evne til å generere ny innsikt i biologi av malariaparasitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kontinuerlig kultur P. falciparum krever bruk av menneskelige RBCs, og vi utnyttet kjøpt kommersielt enheter av blod som ble fratatt alle identifikatorer og anonymiseres. Institusjonelle gjennomgang styret og Office biosikkerhet ved University of Georgia anmelder våre protokoller og godkjent alle protokollene som brukes i vår lab.
1. velge en gRNA rekkefølge
- Gå til CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) og velg "Fasta mål". Under "Mål", lime 200 base parene fra 3 slutten av åpent lesing rammen (ORF) med et og 200 base-parene fra starten av genet 3-UTR. Velg 'P. falciparum' under 'I'(3D 7 v3.0), og velg "CRISPR/Cas9" under "Using". Klikk deretter "finne Target nettsteder".
- Velg en gRNA rekkefølge fra alternativene presentert, gi preferanse til den mest effektive gRNA som er nærmest til stedet for modifisering og som har færrest off-målet nettsteder.
Merk: Potensielle gRNA sekvenser identifiseres fordi de er umiddelbart oppstrøms av en Protospacer tilstøtende motiv (PAM), som er nødvendig for rekruttering av Cas9 DNA. Rekkefølgen som er klonet i pMK-U6, vektoren som driver gRNA uttrykk, er 20 baser umiddelbart oppstrøms av Pam. PAM spesifikke for S. pyogenes Cas9 er nukleotid rekkefølgen NGG og ikke skal tas med i rekkefølgen er klonet i pMK-U6.
Merk: CHOPCHOP visuelt rangerer gRNA sekvenser, viser de beste alternativene i grønn, mindre ideelle alternativene i rav og verste alternativene i rødt. CHOPCHOP gir hver gRNA rekkefølge en effektivitet score som beregnes med de mest oppdaterte parameterne funnet i litteraturen, og de forutse off-målet steder som kan gjenkjennes av gRNA. To eller tre gRNA sekvenser må være forsøk på å finne gRNA best egnet til et bestemt gen. - Kjøpe gRNA sekvensen og dens omvendt-supplement som polyakrylamid Gel geleelektroforese-renset oligos. GRNA-sekvens benyttet til målet PfHSP70x finnes i figur 1B.
Merk: Denne oligo bør inkludere 15 base parene homologe til gRNA-uttrykke plasmider, som er nødvendige for rekkefølge og hemorroider-uavhengig kloning (skive) i pMK-U6 vektor16.
2. kloning gRNA rekkefølge i pMK-U6
-
Fordøye pMK-U6 med BtgZI.
- Digest 10 μg av pMK-U6 med 5 μL av BtgZI enzym (5000 enheter/mL) for 3t på 60 ° C. Følg enzym produsentens protokoll for reaksjonen forhold.
- Etter 3 h vekst, legge til en ytterligere 3 μL BtgZI reaksjonen å sikre fullstendig fordøyelsen av plasmider. Fordøye for en ytterligere 3 h, fortsatt følge produsentens instruksjoner for å sikre riktig reaksjonen forhold.
- For å rense fordøyd pMK-U6 reaksjonen, bruker du en kolonne-baserte PCR opprydding kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Skille fordøyd DNA ved hjelp av en 0,7% agarose gel og ekstra 4200-base par bandet.
-
Anneal oligos som inneholder den gRNA sekvensen.
- Gjeninnføre den side-renset oligos til en konsentrasjon av 100 μM ved hjelp av nuclease-fritt vann.
- Kombiner 10 μL av hver oligo med 2,2 μL 10 x-buffer 2 (se Tabell for materiale). Kontroller at totalt reaksjon volumet er 22,2 μL.
- Kjøre gRNA annealing program i en thermocycler: trinn 1: 95 ° C, 10 min; Trinn 2: 95 ° C, 1 s, med en reduksjon i temperaturen på 0,6 ° C/syklus; Trinn 3: gå til trinn 2, 16 ganger; Trinn 4: 85 ° C, 1 min; Trinn 5: 85 ° C, 1 s, med en reduksjon i temperaturen på 0,6 ° C/syklus; Trinn 6: gå til trinn 5, 16 ganger; trinn 7: 75 ° C, 1 min; trinn 8: 75 ° C, 1 s, med en reduksjon i temperaturen på 0,6 ° C/syklus; Trinn 9: gå til trinn 8, 16 ganger. Trinn 10 til 21: Gjenta brukes i trinn 4-9 inntil temperaturen når 25 ° c. trinn 22:25 ° C, 1 min.
-
Sett inn glødet gRNA oligos i BtgZI-fordøyd og gel-renset pMK-U6 plasmider.
- Kombiner 100 ng av fordøyd pMK-U6 med 1 μL 10 x buffer 2.1 og 3 μL glødet gRNA oligos. Øk volumet til 9,5 μL med nuclease-fritt vann.
- Legg til 0,5 μL T4 utvalg og ruge reaksjonen ved romtemperatur for 2,5 min.
- Flytte reaksjonen til is og ruge i 10 min.
- Umiddelbart omforme 5 μL reaksjonen til kompetent E. coli ifølge bakterier leverandørens instrukser. Plate bakterier på Lysogeny kjøttkraft (LB) agar plater som inneholder 100 μg/mL Ampicillin.
- Tillate transformert bakterier vokse på 37 ° C over natten, så velge kolonier og pakke DNA med en kommersielt tilgjengelig plasmider miniprep kit.
3. design homologi regioner av malen reparasjon
-
Design skjold mutasjoner i homologi reparasjon malen for å forhindre re kutting av DNA som er integrert i genomet.
Merk: En skjold mutasjon består vanligvis av å innføre en stille mutasjon for å endre PAM slik at Cas9 ikke vil få en pause i malen reparasjon. PAM kreves for Cas9 brukes i denne protokollen er nukleotid sekvensen "NGG", der "N" er alle nukleotid. Hvis mulig, endre en av G nukleotider til en A, C eller T.- Hvis PAM ikke kan være stille muterte, innføre minst 2 stille mutasjoner i 6 base parene direkte tilstøtende til PAM7,8.
Merk: Disse mutasjonene vil forhindre anerkjennelse av malen reparasjon av gRNA og forhindre re kutting av reparerte locus av Cas9/gRNA kompleks. Skjerme mutasjoner kan bli introdusert i regionen homologi med forsterke DNA med primer som inneholder mutasjon.
- Hvis PAM ikke kan være stille muterte, innføre minst 2 stille mutasjoner i 6 base parene direkte tilstøtende til PAM7,8.
-
Forsterke ORF homologi regionen for malen reparasjon.
- Bruker PCR, forsterke 800 base-parene fra 3 slutten av målet genet ORF. Utforme primerne som brukes til å ekskludere stopp codon fra denne amplicon.
- Utforme primere for innsetting av denne amplicon i de pHA -glmS som har vært fordøyd med SacII og AfeI gjennom en DNA ligation reaksjon eller skive16.
-
Forsterke 3-UTR homologi regionen for malen reparasjon.
- Bruker PCR, forsterke 800 base parene umiddelbart etter stopp codon av målet genet. Utforme primere for innsetting av denne amplicon i de pHA -glmS som har vært fordøyd med HindIII og NheI gjennom en DNA ligation reaksjon eller skive16.
Merk: Høy på innhold av P. falciparum genomet kan gjøre forsterkningen av regioner som UTRs vanskelig. En alternativ tilnærming til bruker PCR er syntetisere homologi regionene.
- Bruker PCR, forsterke 800 base parene umiddelbart etter stopp codon av målet genet. Utforme primere for innsetting av denne amplicon i de pHA -glmS som har vært fordøyd med HindIII og NheI gjennom en DNA ligation reaksjon eller skive16.
4. kloning homologi regioner i reparasjon plasmider
-
Sett inn ORF homologi regionen i de pHA -glmS.
- Fordøye de pHA -glmS med SacII og AfeI, ifølge enzym produsentens instruksjoner. Inn den fordøyde plasmider med SKIVE16ORF homologi regionen PCR produktet.
- Forvandle kompetent E. coli som utført i trinn 2.3.4 og 2.3.5.
-
3-UTR homologi regionen inn en pHA-glmS plasmider som allerede inneholder ORF homologi regionen (se trinn 4.1).
- Fordøye plasmider med HindIII og NheI etter enzym produsentens instruksjoner. Inn 3-UTR homologi regionen amplicon den fordøyde plasmider med SKIVE16.
- Forvandle kompetent E. coli og ekstra plasmider DNA (trinn 2.3.4 og 2.3.5).
5. fremskynde DNA for hva
- Legge til 40 μg hver av pMK-U6, pUF1-Cas9 og pHA -glmS DNA (for totalt 120 μg DNA) inn i et sterilt 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Legg 1/10th volumet av DNA av 3 M natrium acetate på vann (pH 5.2) til røret og bland det godt med en vortex (f.eks Hvis volumet i trinn 5.1 var 100 μL, tilsett 10 μL av natrium acetate).
- Legg 2,5 ganger volumet av 100% etanol til røret og bland det godt med en vortex minst 30 s (f.eks Hvis volumet i 5.1 var 100 μL, tilsett 250 μL av 100% etanol).
- Sett røret på isen eller på 20 ° C i 30 min.
- Sentrifuge røret 18,300 x g i 30 min på 4 ° C.
- Fjern forsiktig nedbryting fra røret. Ikke forstyrr pellet.
- Legg 3 ganger volumet av 70% etanol til røret og bland kort med en vortex (f.eks., hvis volumet i 5.1 var 100 μL, legger 300 μL 70% etanol).
- Sentrifuge røret 18,300 x g i 30 min på 4 ° C.
Merk: Dette trinnet skal utføres under sterile forhold i en biologisk sikkerhet regjering. - Fjern forsiktig nedbryting fra røret. Ikke forstyrr pellet. La røret åpne og la pellets til air-dry i 15 min.
- Lagre utfelt DNA på 20 ° C før det er nødvendig for hva.
6. isolere menneskelige RBCs fra hele blod i forberedelse til Transfection
- Aliquot friskt blod inn i sterilt 50 mL konisk rør (ca 25 mL per rør).
- Sentrifuge rør 1,088 x g i 12 minutter, med sentrifuge bremser satt til 4.
- Sug opp av supernatant og buffy pelsen. Resuspend RBC pellets med en lik mengde ufullstendig RPMI.
Merk: Ufullstendig RPMI er utarbeidet av supplere RPMI 1640 med 10.32 μM thymidine, 110.2 μM hypoxanthine, 1 mM natrium pyruvate, 30 mM natriumbikarbonat, 5 mM HEPES, 11,1 mM glukose og 0.02% (v/v) gentamicin. - Gjenta trinn 6.2-6.3 to ganger. Etter siste vask, resuspend RBCs i en lik mengde ufullstendig RPMI og lagre rørene på 4 ° C.
7. transfecting RBCs med CRISPR/Cas9 plasmider (må gjøres tas aseptisk)
Merk: P. falciparum kulturer vedlikeholdes som beskrevet i andre rapporter17. Opprettholde alle kulturer på 37 ° C under 3% O2, 3% CO2og 94% N2 ikke annet er angitt. Når blodet brukes i denne protokollen, henviser det til de rene røde blodlegemene i trinn 6. Blodet brukes bør ikke være eldre enn 6 uker, som det er vanligvis en nedgang i parasitten spredning i eldre blod. Trinnene nedenfor beskriver pre lasting RBCs med DNA og legge til en parasitten kultur transfekterte cellene. Andre etablerte transfection protokoller er kompatible med transfecting disse konstruksjoner18,19.
- Forberede en 1 x cytomix buffer i vann (120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7.6). Filter-sterilisere bufferen bruke filtere 0.22 μm.
- Legge til 380 μL 1 x-cytomix til DNA igangsatte i trinn 5, og vortex å oppløse. At DNA å oppløse i 1 x-cytomix i 10 minutter, vortexing hver 3 minutter for 10 s.
- I et sterilt 15 mL konisk rør, kombinere 300 μL RBCs (50% hematokrit, fra trinn 6) i den ufullstendige RPMI med 4 mL 1 x cytomix.
- Sentrifuge RBCs fra trinn 7.3 870 x g i 3 minutter, og deretter fjerne nedbryting fra RBC pellets.
- Resuspend RBC pellets med DNA/cytomix blanding fra trinn 6.2 og overføring til 0,2 cm electroporation søppel.
- Electroporate RBCs bruker følgende: 0,32 kV, 925 μF, kapasitans satt til "Høy Cap" og motstand satt til "Uendelig".
- Etter electroporation, overføre innholdet fra cuvette til en 15 mL konisk inneholder 5 mL komplett RPMI (cRPMI). Sentrifuge røret 870 x g for 3 min ved 20 ° C, og deretter Dekanter nedbryting.
Merk: cRPMI er forberedt gjennom samme metode som ufullstendig RPMI med tillegg av 0,25% (w/v) lipid-rik bovin serum albumin. - Resuspend pellet i 4 mL av cRPMI og overføre til en brønn i en 6-og vev kultur plate. Tilsett 400 μL av en høy-schizont kultur (7-10% schizont parasitemia er ideelle) til de transfekterte RBCs.
Merk: Parasitemia er definert som en prosentandel av parasitten-infiserte RBCs. - Neste dag, vask kulturen med 4 mL av cRPMI. Sentrifuge kulturen 870 x g for 3 min og Sug opp nedbryting. Resuspend kulturen i 4 mL av cRPMI.
- 48 timer etter å ha fullført trinn 7.6, vask kulturen med 4 mL av cRPMI. Deretter resuspend kulturen i cRPMI som inneholder 1 μM DSM1 velge for Cas9 plasmider.
-
Fortsette vaske kulturer hver dag med cRPMI til parasitter er ikke lenger synlig for blodutstryk. Etter dette punktet, erstatte kultur medium med fersk cRPMI pluss 1 μM DSM1 hver 48 timer.
- Gjøre en blod smøre, Pipetter 150 μL av kultur i en 0,6 mL sentrifuge rør. Pellets cellene med sentrifugering 1700 x g for 30 s.
- Sug opp av nedbryting. Bruk en pipette for å overføre pelleted cellene til et glass lysbilde. Bruker en andre objektglass holdt i 45° vinkel til det første lysbildet, smøre blod slippverktøyet. Stain lysbilde ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig flekker kit i henhold til produsentens protokollen.
- Vis parasitter med en 100 X oljeobjektiv nedsenking.
- Starter 5 dager etter transfection (trinn 7.6), fjerne 2 mL kulturen med RBCs resuspended i kultur medium. Legge tilbake 2 mL av fersk medium (cRPMI pluss 1 μM DSM1) og blod på 2% hematokrit. Legge friskt blod på denne måten når en uke før parasitter igjen, som bestemmes av tynne blodutstryk (trinn 7.11).
Merk: Hvis integrering er vellykket, parasitter generelt vises i kulturen av én måned etter hva. - Når parasitter reemerge, fjerne DSM1 narkotika press. Eventuelt fjerne stoffet press etter parasitter ha blitt Klon ut.
8. sjekke parasitter for integrering av malen reparasjon
- Når parasitter vises igjen av tynne blodutstryk, isolere DNA fra kulturen med en passende pakke.
-
Bruk PCR for å forsterke endret regionen genomet å avgjøre hvis målrettet locus er endret og uforandret vill-type locus (indikativ av vill-type parasitter) er synlig.
- For å oppdage parasitter som har integrert malen reparasjon, kan du bruke en frem primer som sitter i begynnelsen av ORF, utenfor regionen klonet homologi. Bruke en omvendt primer som sitter i 3-UTR.
Merk: Denne forsterkning omfatter sekvenser av HA kodene og glmS ribozyme, amplicons fra integrert parasitter vil være lengre enn den samme regionen i vill-type parasitter.
- For å oppdage parasitter som har integrert malen reparasjon, kan du bruke en frem primer som sitter i begynnelsen av ORF, utenfor regionen klonet homologi. Bruke en omvendt primer som sitter i 3-UTR.
9. kloning parasitter ved å begrense fortynning
-
Utføre føljetong fortynninger av parasitten kultur fra trinn 7.13 å oppnå en siste konsentrasjon på 0,5 parasitter/200 μL. Legge til 200 μL av utvannet kultur brønnene av en 96-brønns vev kultur plate.
Merk: Fordi parasitemia er definert som en prosentandel av infiserte RBCs og hematokrit er også et definert antall (2%), antall parasitter per volum lett utledes.- Forberede 1 mL av kulturen i cRPMI på 5% parasitemia og 2% hematokrit (på disse parasitemia og hematokrit nivåer, kultur inneholder 1 x 107 parasitter/mL).
- Fortynne denne kultur 1: 100 med cRPMI. Fortynne igjen 1: 100 med cRPMI.
- Fortynn 1:400. Utføre dette fortynning legger til 62.5 μL kultur i 25 mL av cRPMI og 1 mL blod. Dette fortynning resulterer i ønsket konsentrasjonen av 0,5 parasitter/200 μL.
-
Opprettholde kloning platen til parasitter er synlig i brønnene.
- Hver 48 h, erstatte mediet i 96-brønnen platen med fersk medium.
- En gang i uken, starter 5 dager etter kloning platen (trinn 9.1), fjerne 100 μL fra hver brønn og legge tilbake 100 μL frisk medium + blod (2% hematokrit).
-
Identifisere noen brønner som inneholder parasitter.
- Plass platen 96-brønnen i 45° vinkel for ca 20 min, slik at blodet å bosette seg i vinkel i platen.
- Plass 96-brønns platen på en lyskasse. Legg merke til at brønnene som inneholder parasitter inneholder medier gul i fargen, sammenlignet med rosa media parasitten uten brønner, på grunn av forsuring av mediet av parasitter.
- Bruker en serologisk pipette, flytte innholdet av parasitten inneholder en 24-og vev kultur plate å tillate utvidelse av parasitemia.
- Bruker PCR analyse som beskrevet i trinn 8, Sjekk disse klonal parasitten linjer for riktig integrering.
10. Nedslaging knockdown av Protein ved å behandle parasitter med glukosamin og bekreftelse via Western Blot analyse
- Forberede en 0,5 M GlcN (glukosamin) lager løsning, som kan lagres på 20 ° C.
- Legge til GlcN i glmS parasitten kulturer og tillate dem å vokse i nærvær av GlcN.
Merk: Den siste konsentrasjon og timing av GlcN behandling avhenger eksperiment og parasitt linjen. GlcN kan påvirke parasitten vekst, så foreldre parasitten belastning må utsettes til et utvalg av GlcN konsentrasjoner å bestemme sin følsomhet til sammensatt. En konsentrasjon av 2.0-7.5 mM GlcN er ofte brukte13,14,20. - Isolere protein prøver fra GlcN-behandlet parasitter13.
-
Bruke protein prøver for western blot analyse for å oppdage reduksjoner i protein13.
- Bruke et anti-HA antistoff i henhold til produsentens instruksjoner for å oppdage HA-glmS-merket protein. Sammenligne HA bandet en lasting kontroll, for eksempel PfEF1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk av plasmider brukes i denne metoden som et eksempel på en skjold mutasjon er vist i figur 1. Som et eksempel på hvordan å identifisere mutant parasitter etter transfection, vises resultatene fra PCRene for å sjekke integrering av HA -glmS Konstruer i figur 2. Et representativt bilde av en kloning plate er vist i Figur 3 å vise fargeendring av mediet i nærvær av parasitter. Resultater fra en immunofluorescence analysen og vestlige blotting eksperimenter er vist i Figur 4 å demonstrere funksjonaliteten til HA tag og glmS-basert reduksjoner av proteiner i parasitter. Figur 5 viser manglende evne til kort homologi armene på PCR produkter å endre parasitten genomer og få levedyktig mutanter.
Figur 1: oppsummering av våre tre-plasmider tilnærming til CRISPR/Cas9 og eksempler på en gRNA oligo og skjold mutasjon. (A) skjematisk av Tom pHA-glmS og pMK-U6 vises med begrensning enzym områder brukes for kloning. Også vist er pHA-glmS og pMK-U6 etter homologi armene og gRNA sekvenser ha blitt Klon inn i dem, henholdsvis. Endelig vises pUF1-Cas9. yDHOD = gjær dihydrofolatreduktase reduktase, motstand markøren til DSM1. (B) det frem oligo brukes for kloning PfHsp70x gRNA sekvensen i pMK-U6 vises, med den gRNA sekvensen i store bokstaver og pMK-U6 homologi armene nødvendig for kloning med små bokstaver (øverst). Genomic målet for PfHsp70x gRNA vises som den nedstrøms PAM, i rødt (midten). Shield mutasjonen i PfHsp70x gRNA PAM vises i rødt (nederst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk av CRISPR/Cas9 genomet modifisering benytter pHA-glmS og en strategi for å bekrefte integrasjon. (A) Cas9, guidet til et genomisk locus av en gRNA, induserer en dobbel strand pause i DNA. Parasitten reparerer skaden gjennom doble crossover homologe reparasjon, bruke de pHA-glmS plasmider som mal og innføre HA-glmS sekvensen i genomet. (B) en PCR prøve for å identifisere riktig integrering av HA-glmS sekvensen. Bruke primere P1 og P2, er den 3-' ORF i vill-type PfHsp70x og PfHsp70x -glmS mutanter forsterket13. Amplicon fra PfHsp70x-glmS er lengre enn vill-type fordi den HA-glmS sekvensen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Identifikasjon av brønner som inneholder parasitter i en 96-brønns kloning plate. (A) 96-brønns platen er satt til en vinkel på 45 grader for ca 20 min å la blodet å bosette seg i vinkel i platen. (B) brønnen til venstre inneholder en parasitten kultur, angitt av den gule fargen av mediet i forhold til rosa mediet av parasitten-fri på høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: immunofluorescence analysen viser den riktige HA merking av PfHsp70x og vestlige blotting reduksjon av PfHsp70x protein nivå under behandling med glukosamin. (A) PfHsp70x -glmS parasitter var fast og farget med DAPI (kjernen markør) og antistoffer mot HA og MAHRP1 (membran forbundet histidin rik Protein 1, en markør av protein eksport til verten RBC)13. (B) PfHsp70x -glmS parasitter ble behandlet med 7,5 mM glucosamine, og hele-parasitten lysates ble brukt for Western blotting analyse13. Membranen undersøkt med antistoffer for HA og PfEF1α en lasting kontrollere13. Som forventet, resulterte glucosamine behandlingen i en reduksjon av protein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bruke kort homologi sekvenser for reparasjon. (A) skjematisk fremstilling viser knockout av GFP i B7 parasitter21. B7 parasitter er et derivat av 3D 7 som Plasmepsin II har vært merket med GFP. PCR produkter som inneholder 50, 75 eller 100 base parene GFP homologi regioner flankerer en blasticidin S motstand kassett (merket "markør"), sammen med pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, en plasmider uttrykke Cas9 og en GFP gRNA, ble transfekterte til B7 parasitter. Hver transfection ble gjennomført to ganger. DSM1 narkotika Press var anvendt 2 dager etter hva. (B) vises her er PCR tester på DNA isolert fra transfekterte parasitter 5 dager etter transfection og 2 måneder etter hva. Primere brukt til test integrasjon av BSD motstand kassetten vil gi en 584-base par produkt for B7 foreldrenes parasitter og en 2020-base par for parasitter som har integrert markøren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gjennomføringen av CRISPR/Cas9 i P. falciparum har både for og redusert mengden tid for å endre det parasite genom, sammenlignet med tidligere metoder for genetisk manipulasjon. Denne omfattende protokollen beskriver trinnene nødvendig for å generere betinget mutanter bruker CRISPR/Cas9 i P. falciparum. Mens metoden her er rettet spesielt for generering av HA -glmS mutanter, kan denne strategien tilpasses for ulike behov, inkludert merking av gener, gene fortrenging og innføring av punkt mutasjoner.
En kritisk tidlig skritt i denne protokollen er valget av en gRNA sekvens. Når du velger en gRNA, finnes det flere punkter å vurdere som hvor gRNA sitter hvor effektivt det er og hvorvidt den har potensial for off-målet effekter. Den gRNA sekvensen skal være så nær som mulig til området av endring, ideelt i 200 base parene. Dette reduserer sannsynligheten for parasitter ved hjelp av malen repair for å fikse genom deres uten å integrere koden. Verktøyet brukes her til å finne gRNA var en gratis, nettbasert tjeneste kalt CHOPCHOP22. En annen online verktøyet, eukaryote patogen CRISPR guide RNA/DNA designverktøy (EuPaGDT, http://grna.ctegd.uga.edu/), kan også være brukt23. EuPaGDT gir ekstra karakterisering av gRNA sekvenser, inkludert prediksjon av off-målet treff og potensielle problemer som kan forhindre transkripsjon av gRNA. EuPaGDT har også verktøy for satsvis behandling av gRNAs å målrette flere gener eller hele genomer. Den valgte gRNA bør være som sitter nærmest til området av endringen med høyest effektivitet og minimale off-målet treff. En viktig begrensning av CRISPR/Cas9 genet som kan oppstå er manglende evne til å utforme en passende gRNA mot genet av interesse. I slike tilfeller en prøving og feiling tilnærming kan være nødvendig, med flere sub-optimale gRNA sekvenser til det beste alternativet er funnet, og vellykket genet redigering har oppstått.
En annen viktig faktor å vurdere når du genererer P. falciparum mutanter bruker CRISPR/Cas9 er lengden på regionene homologi reparasjon malen. Denne protokollen anbefaler at homologi regionene skal være ca 800 base parene hver, men vi har også vært vellykket i å bruke mindre regioner nummerering 500 base parene3. Vellykket genomet modifisering benytter CRISPR/Cas9 og kort homologi armene på PCR-produkter har også blitt brukt i andre protozoan parasitter som Toxoplasma gondii og Trichomonas vaginalis24,25. Vi testet muligheten for å bruke mindre homologi armene på PCR produkter (50, 75 eller 100 base parene) ved å forsøke å knockout GFP i B7 parasitter med blasticidin motstand kassett21. Vi så noen integrering av blasticidin motstand kassetten på 5 dager innlegg hva; men disse parasittene aldri utvinnes fra transfection. For disse transfections valgte vi for Cas9-uttrykke plasmider bruker DSM1. Et annet valg-metoden, som behandler transfekterte kulturer med blasticidin S alene eller i kombinasjon med DSM1, kan forbedre sjansene for parasitter reappearing ved kortere homologi regioner for å reparere Cas9/gRNA-indusert pausene. I dette tilfellet valgte vi ikke med blasticidin S siden vi ønsket å teste om kort homologi armene kan brukes i tilfeller der en narkotika motstand kassett ikke er blir integrert i genomet, som når et protein er blir merket.
CRISPR/Cas9 gene redigering-kjernekomponentene er diskutert Cas9 endonuclease, gRNA og malen reparasjon. Vi beskriver en tre-plasmider tilnærming for å innføre disse komponentene i parasitter, hvor Cas9, gRNA og reparasjon malen finnes i separate plasmider. I tillegg til denne har vår lab vært vellykket i å bruke en to-plasmider tilnærming som Cas9 og gRNA er drevet av en enkelt plasmider og reparasjon malen finnes i en andre plasmider3. Lignende to-plasmider tilnærminger har også vært vellykket ansatt av andre labs generere mutanter7,8,26,27,28,29. Videre bruker flere labs en stamme av Plasmodium (NF54attB) som constitutively uttrykker Cas9 og en T7 RNA polymerase stasjonen uttrykket gRNAs30. I dette tilfellet en enkelt plasmider som inneholder malen reparasjon og gRNA er transfekterte i NF54attB parasitter31,32. Endelig er en plasmider-fri tilnærming benytte en renset Cas9-gRNA ribonucleoprotein kompleks brukt til å sette inn mutasjoner i genomet, som godt33. Suksessen til disse ulike tilnærminger demonstrerer fleksibilitet av metodene der forskere kan innføre Cas9/gRNA komponenter i parasitten.
Endelig kan valg av narkotika press gjelder for transfekterte parasitter endres, avhengig av konstruksjoner brukes. Her viser vi generasjon vellykket mutanter ved transiently å velge for den Cas9-uttrykke plasmider med DSM1 til parasitter igjen. Vil generere PfHsp70x knockout parasitter, pfhsp70x ble erstattet med menneskelige dihydrofolatreduktase reduktase genet og parasitter ble så valgt bruker WR9921013. Nylig beskrevet TetR-PfDOZI knockdown systemet er avhengig av integrering av en plasmider som inneholder en blasticidin S motstand genet, gir for utvalg av parasitter med blasticidin S15,31.
Samlet CRISPR/Cas9 gene redigering av P. falciparum har vist seg for å være et kraftig verktøy i malaria forskning, og protokollen her detaljer metodene for å generere betinget knockdown mutanter3,7,8 , 13 , 20 , 28. denne protokollen er svært tilpasses personlige forskningsinteresser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Muthugapatti Kandasamy ved University of Georgia (UGA) biomedisinsk mikroskopi kjernen for kundestøtte og Juan Jose-Lopez-Rubio for deling plasmider pUF1-Cas9 og pL6. Dette arbeidet ble støttet av BUER Foundation priser D.W.C. og H.M.K., UGA oppstart midler til V.M., tilskudd fra mars Dimes Foundation (basilikum O'Connor Starter Scholar forskning Award) V.M. og oss National Institutes of Health gir (R00AI099156 og R01AI130139) til V.M. og (T32AI060546) til H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
