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Genetics

CRISPR/Cas9 जीन संपादन मानव मलेरिया परजीवी पी. फाल्सीपेरम की सशर्त म्यूटेंट बनाने के लिए

Published: September 18, 2018 doi: 10.3791/57747
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 1, 1,2
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

हम फाल्सीपेरम/CRISPR जीनोम संपादन का उपयोग प्लाज्मोडियम Cas9 में glmSआधारित सशर्त पछाड़ना म्यूटेंट पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन ।

Abstract

मलेरिया दुनिया भर में रुग्णता और मृत्युदर का एक महत्वपूर्ण कारण है. इस रोग है, जो मुख्य रूप से उष्णकटिबंधीय और उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में रहने वाले लोगों को प्रभावित करता है, प्लाज्मोडियम परजीवी के साथ संक्रमण के कारण होता है । मलेरिया से निपटने के लिए अधिक प्रभावी औषधियों के विकास से इस जटिल परजीवी के जीव-जंतु की हमारी समझ में सुधार लाकर त्वरित किया जा सकता है. इन परजीवियों के आनुवंशिक हेरफेर उनके जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि, ऐतिहासिक रूप से पी फाल्सीपेरम के जीनोम में हेरफेर मुश्किल हो गया है । हाल ही में, CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन मलेरिया परजीवी में उपयोग किया गया है, आसान प्रोटीन टैगिंग, सशर्त प्रोटीन knockdowns की पीढ़ी, और जीन के विलोपन के लिए अनुमति दी । CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन मलेरिया अनुसंधान के क्षेत्र में आगे बढ़ने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हो गया है । यहाँ, हम पी. म्यूटेंटमें glmS-आधारित सशर्त पछाड़ना फाल्सीपेरम पैदा करने के लिए एक CRISPR/Cas9 विधि का वर्णन करते हैं । इस विधि अत्यधिक प्रोटीन टैगिंग और जीन नॉकआउट सहित आनुवंशिक जोड़तोड़, के अंय प्रकार के लिए अनुकूलनीय है ।

Introduction

मलेरिया एक विनाशकारी जीनस प्लाज्मोडियमके प्रोटोजोआ परजीवी की वजह से बीमारी है । पी फाल्सीपेरम, सबसे घातक मानव मलेरिया परजीवी, प्रति वर्ष लगभग ४४५,००० मौतों का कारण बनता है, ज्यादातर पांच साल की उंर के तहतबच्चों में ज्यादातर । प्लाज्मोडियम परजीवी एक जटिल जीवन एक मच्छर वेक्टर और एक हड्डीवाला मेजबान शामिल चक्र है । मनुष्य पहले संक्रमित हो जाता है जब एक संक्रमित मच्छर एक रक्त भोजन लेता है । फिर, परजीवी जिगर पर हमला करता है, जहां यह बढ़ता है, विकसित करता है, और लगभग एक सप्ताह के लिए विभाजित । इस प्रक्रिया के बाद, परजीवी खून, जहां वे लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) में अलैंगिक प्रतिकृति से गुजरना में जारी कर रहे हैं । RBCs के भीतर परजीवी के विकास मलेरिया2के साथ जुड़े नैदानिक लक्षणों के लिए सीधे जिंमेदार हैं ।

हाल ही में जब तक, ट्रांसजेनिक पी फाल्सीपेरम का उत्पादन एक श्रमसाध्य प्रक्रिया थी, दवा चयन के कई दौर है कि कई महीने लग गए और एक उच्च विफलता की दर को शामिल किया गया । इस बार लेने वाली प्रक्रिया relieson ब्याज के क्षेत्र में यादृच्छिक डीएनए टूट जाता है की पीढ़ी और परजीवी की अंतर्जात क्षमता को अपने जीनोम ठीक हालांकि मुताबिक़ मरंमत3,4,5,6 . हाल ही में, संकुल नियमित रूप से अंतराल Palindromic दोहराने/Cas9 (CRISPR/Cas9) जीनोम संपादन सफलतापूर्वक पी फाल्सीपेरम7,8में उपयोग किया गया है । मलेरिया अनुसंधान में इस नई तकनीक की शुरूआत इन घातक प्लाज्मोडियम परजीवी के जीवविज्ञान की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रही है. CRISPR/Cas9 गाइड RNAs (gRNAs) के माध्यम से जीन के विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है कि ब्याज की जीन के लिए मुताबिक़ हैं । gRNA/Cas9 परिसर gRNA के माध्यम से जीन पहचानता है, और Cas9 तो एक डबल किनारा तोड़ परिचय, जीव9,10में मरंमत तंत्र की दीक्षा मजबूर । क्योंकि P. फाल्सीपेरम गैर के माध्यम से डीएनए टूट जाता है मुताबिक़ अंत में शामिल होने की मरंमत मशीनरी का अभाव है, यह मुताबिक़ पुनर्संयोजन तंत्र का इस्तेमाल करता है और transfected मुताबिक़ डीएनए को एकीकृत Cas9 की मरंमत के लिए टेंपलेट्स/gRNA-प्रेरित डबल-कतरा तोड़11,12।

यहां, हम CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग पी फाल्सीपेरम में सशर्त पछाड़ना म्यूटेंट की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल glmS ribozyme के उपयोग को सशर्त पछाड़ना PfHsp70x (PF3D7_0831700) के प्रोटीन स्तर को दर्शाता है, निगरानी13,14फाल्सीपेरम की मेजबानी में पी RBCs द्वारा निर्यात किया जाता है । glmS ribozyme glucosamine के साथ उपचार द्वारा सक्रिय है (जो कोशिकाओं में glucosamine-6-फॉस्फेट में परिवर्तित कर दिया जाता है) अपने संबद्ध mRNA सट करने के लिए, प्रोटीन14में कमी करने के लिए अग्रणी. इस प्रोटोकॉल को आसानी से स्थिरीकरण डोमेन या आरएनए aptamers4,5,15के रूप में अन्य सशर्त पछाड़ना उपकरण, का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हमारे प्रोटोकॉल विवरण एक hemagglutinin (हा) टैग और glmS ribozyme कोडन अनुक्रम है कि मुताबिक़ खुले पढ़ने के फ्रेम (ओआरएफ) और 3 '-PfHsp70x के लिए कर रहे है के साथ मिलकर प्लाज्मिड की मरंमत की पीढ़ी का ब्यौरा । हम भी gRNA की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए एक दूसरे प्लाज्मिड की पीढ़ी का वर्णन । इन दो plasmids, एक तिहाई है कि Cas9 की अभिव्यक्ति ड्राइव के साथ, RBCs में transfected और पी फाल्सीपेरम परजीवी के जीनोम को संशोधित किया जाता है । अंत में, हम एक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) आधारित तकनीक का वर्णन टैग और glmS ribozyme के एकीकरण की पुष्टि करने के लिए । इस प्रोटोकॉल संशोधन या किसी भी पी फाल्सीपेरम जीन के पूर्ण नॉकआउट के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है, हमारे मलेरिया परजीवी के जीवविज्ञान में नई अंतर्दृष्टि उत्पंन करने की क्षमता को बढ़ाने ।

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Protocol

फाल्सीपेरम की निरंतर संस्कृति मानव RBCs के उपयोग की आवश्यकता है, और हम सभी पहचानकर्ता और गुमनामी से छीन लिया गया है कि खून की व्यावसायिक रूप से खरीदी इकाइयों का उपयोग किया । संस्थागत समीक्षा बोर्ड और जॉर्जिया के विश्वविद्यालय में सुरक्षा के कार्यालय हमारे प्रोटोकॉल की समीक्षा की और हमारे प्रयोगशाला में इस्तेमाल सभी प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी ।

1. एक gRNA अनुक्रम का चयन

  1. CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) पर जाएँ और ' फसता लक्ष्य 'का चयन करें. ' लक्ष्य 'के तहत ' जीन के 3 '-UTR के शुरू होने से एक जीन और २०० आधार जोड़े की ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) के 3 ' छोर ' से २०० आधार जोड़े पेस्ट करें । ' In' के अंतर्गत, ' P. फाल्सीपेरम ' (3D7 v 3.0) का चयन करें, और ' CRISPR/Cas9 ' के अंतर्गत ' का उपयोगकरें ' चुनें । इसके बाद, ' लक्ष्य साइटें खोजें 'क्लिक करें ।
  2. प्रस्तुत विकल्पों में से एक gRNA अनुक्रम का चयन करें, सबसे कुशल gRNA है कि संशोधन की साइट के निकटतम है और उस के लिए प्राथमिकता दे रही है कि बंद-लक्ष्य साइटों कटेंगे ।
    नोट: संभावित gRNA अनुक्रम की पहचान की जाती है क्योंकि वे तुरंत एक Protospacer आसंन आकृति (पाम) के ऊपर है, जो डीएनए के लिए Cas9 की भर्ती के लिए आवश्यक है । अनुक्रम है कि पीएमके में क्लोन है-U6, वेक्टर कि gRNA अभिव्यक्ति ड्राइव, 20 कुर्सियां तुरंत पाम के ऊपर है । एस pyogenes Cas9 के लिए पाम विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम NGG है और अनुक्रम है कि पीएमके में क्लोन है-U6 में शामिल नहीं किया जाना चाहिए ।
    नोट: CHOPCHOP नेत्रहीन gRNA दृश्यों रैंकों, हरे रंग में सबसे अच्छा विकल्प प्रदर्शित, एंबर में कम आदर्श विकल्प, और लाल रंग में सबसे खराब विकल्प । CHOPCHOP प्रत्येक gRNA अनुक्रम एक दक्षता स्कोर है कि सबसे अप करने की तारीख साहित्य में पाया मापदंडों का उपयोग कर की गणना की है देता है, और वे बंद लक्ष्य साइटों है कि gRNA द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है की भविष्यवाणी । दो या तीन gRNA अनुक्रम एक विशेष जीन के लिए सबसे उपयुक्त gRNA खोजने के लिए प्रयास करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  3. खरीद gRNA अनुक्रम और इसके रिवर्स Polyacrylamide जेल ट्रो-शुद्ध ओलिगोस्पर्मिया के रूप में पूरक । PfHSP70x लक्ष्य करने के लिए इस्तेमाल किया gRNA अनुक्रम चित्रा 1bमें पाया जा सकता है ।
    नोट: इस oligo में gRNA-व्यक्त प्लाज्मिड के लिए मुताबिक़ 15 आधार जोड़े शामिल होने चाहिए, जो पीएमके-बंधाव वेक्टर16में अनुक्रम और SLIC-स्वतंत्र क्लोनिंग (U6) के लिए आवश्यक हैं ।

2. पीएमके-U6 में gRNA अनुक्रम का क्लोनिंग

  1. BtgZI के साथ पीएमके-U6 को पचा.
    1. BtgZI एंजाइम (५,००० यूनिटों/एमएल) के 5 μL के साथ पीएमके-U6 के 10 μg को ६० डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए पचा । प्रतिक्रिया शर्तों के लिए एंजाइम निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    2. 3 एच मशीन अवधि के बाद, प्लाज्मिड के पूर्ण पाचन सुनिश्चित करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए BtgZI के एक अतिरिक्त 3 μL जोड़ें । एक अतिरिक्त 3 एच के लिए डाइजेस्ट, अभी भी सही प्रतिक्रिया की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन ।
    3. इस प्रतिक्रिया से पचता पीएमके-U6 को शुद्ध करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक कॉलम-आधारित पीसीआर क्लीनअप किट का उपयोग करें ।
    4. एक ०.७% agarose जेल का उपयोग पचा डीएनए अलग और ४,२००-आधार जोड़ी बैंड निकालने ।
  2. gRNA अनुक्रम युक्त ओलिगोस्पर्मिया ।
    1. nuclease-मुक्त पानी का उपयोग कर १०० माइक्रोन की एकाग्रता के लिए पृष्ठ शुद्ध ओलिगोस्पर्मिया का पुनर्गठन ।
    2. २.२ के साथ प्रत्येक oligo के 10 μL का मिश्रण 10x बफर 2 का μL ( सामग्री की तालिकादेखें) । सुनिश्चित करें कि कुल प्रतिक्रिया की मात्रा २२.२ μL है ।
    3. gRNA एनीलिंग प्रोग्राम को एक thermocycler में चलाएं: चरण 1:95 ° c, 10 min; चरण 2:95 ° c, 1 s, ०.६ ° c/चक्र के तापमान में कमी के साथ; चरण 3: चरण 2, 16 बार पर जाएं; चरण 4:85 ° c, 1 min; चरण 5:85 ° c, 1 एस, 0.6 ° c/चक्र के तापमान में कमी के साथ; चरण 6: चरण 5, 16 बार पर जाएं; चरण 7:75 ° c, 1 min; चरण 8:75 ° c, 1 s, ०.६ ° c/चक्र के तापमान में कमी के साथ; चरण 9:8, 16 बार चरण पर जाएं । चरण 10 से 21: चरण 4 – 9 में उपयोग किया गया प्रक्रिया दोहराएँ जब तक कि तापमान 25 ° c तक पहुँच जाता है; चरण 22:25 ° c, 1 min.
  3. annealed gRNA ओलिगोस्पर्मिया को BtgZI-पच और जेल-शुद्धि में डालें पीएमके-U6 प्लाज्मिड.
    1. १०० के एनजी को पचा पीएमके-U6 के 1 μL के साथ 10x बफर २.१ और 3 μL के annealed gRNA ओलिगोस्पर्मिया का मिश्रण । nuclease-फ्री वॉटर के साथ ९.५ μL तक वॉल्यूम बढ़ाएं ।
    2. टी-4 पोलीमरेज़ के ०.५ μL जोड़ें और २.५ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया की मशीन ।
    3. बर्फ के लिए प्रतिक्रिया हटो और 10 मिनट के लिए मशीन ।
    4. तुरंत बैक्टीरिया आपूर्तिकर्ता के निर्देश के अनुसार सक्षम ई. कोलाई में प्रतिक्रिया के 5 μL बदल जाते हैं । प्लेट Lysogeny शोरबा पर बैक्टीरिया (पौंड) १०० μg/एमएल एम्पीसिलीन युक्त प्लेटें आगर ।
    5. बदल बैक्टीरिया को रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने की अनुमति दें, फिर कालोनियों का चयन करें और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड miniprep किट के साथ डीएनए निकालें ।

3. मरंमत टेंपलेट के समरूपता क्षेत्रों डिजाइनिंग

  1. डिजाइन ढाल उत्परिवर्तनों के भीतर समरूपता मरंमत पुनः रोकने के लिए डीएनए है कि जीनोम में एकीकृत है के काटने खाके ।
    नोट: एक ढाल उत्परिवर्तन आमतौर पर एक मूक उत्परिवर्तन शुरू करने के लिए पाम बदल इतना है कि Cas9 मरंमत टेंपलेट में एक तोड़ प्रेरित नहीं होगा होते हैं । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल Cas9 के लिए आवश्यक पाम न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम "NGG" है, जहां "N" किसी भी न्यूक्लियोटाइड है । यदि संभव हो, तो G न्यूक्लियोटाइड में से एक को A, C, या T में परिवर्तित करें ।
    1. यदि पाम चुपचाप नहीं किया जा सकता है, 6 बेस जोड़े में कम 2 मूक उत्परिवर्तनों परिचय सीधे पाम7,8के निकट ।
      नोट: इन उत्परिवर्तनों gRNA द्वारा मरंमत टेंपलेट की मांयता को रोकने और फिर से रोकने के Cas9/gRNA परिसर द्वारा लोकस मरंमत के काटने होगा । शील्ड उत्परिवर्तनों कि उत्परिवर्तन शामिल प्राइमरों के साथ डीएनए बढ़ाना द्वारा समरूपता क्षेत्र में पेश किया जा सकता है ।
  2. मरंमत के लिए ओआरएफ समरूपता क्षेत्र बढ़ाना टेंपलेट ।
    1. पीसीआर का प्रयोग, लक्ष्य है जीन ओआरएफ के 3 ' अंत से ८०० आधार जोड़े बढ़ाना । डिजाइन प्राइमरों कि इस amplicon से रोक codon बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    2. इस amplicon की प्रविष्टि के लिए प्राइमरों के ्ह् डिजाइन-glmS कि SacII और AfeI के साथ या तो एक डीएनए बंधाव प्रतिक्रिया या16SLIC के माध्यम से पच गया है ।
  3. मरंमत टेंपलेट के लिए 3 '-UTR समरूपता क्षेत्र बढ़ाना ।
    1. पीसीआर का प्रयोग, लक्ष्य जीन के stop codon के तुरंत बाद ८०० आधार जोड़े को बढ़ाना. इस amplicon की प्रविष्टि के लिए डिजाइन प्राइमर के ्ह्-glmS कि HindIII और NheI के साथ या तो एक डीएनए बंधाव प्रतिक्रिया या SLIC16के माध्यम से पचा दिया गया है ।
      नोट: P फाल्सीपेरम जीनोम की सामग्री पर उच्च ऐसे UTRs के रूप में मुश्किल क्षेत्रों के प्रवर्धन कर सकते हैं । पीसीआर का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण समरूपता क्षेत्रों synthesizing है ।

4. मरंमत प्लाज्मिड में समरूपता क्षेत्रों क्लोनिंग

  1. संमिलित करें ओआरएफ समरूपता क्षेत्र के ्ह्-glmSमें ।
    1. SacII और AfeI के साथ के ्ह्-glmS को पचा, एंजाइम निर्माता के निर्देशों के अनुसार. SLIC16का उपयोग कर पच प्लाज्मिड में ओआरएफ समरूपता क्षेत्र पीसीआर उत्पाद डालें ।
    2. सक्षम ई. कोलाई में बदलने के रूप में कदम 2.3.4 और -6 में प्रदर्शन किया ।
  2. डालें 3 '-UTR समरूपता क्षेत्र में एक के ्ह्-glmS प्लाज्मिड कि पहले से ही ओआरएफ समरूपता क्षेत्र शामिल है (४.१ कदम देखें) ।
    1. एंजाइम निर्माता के निर्देशों के अनुसार HindIII और NheI के साथ प्लाज्मिड को पचाने में । संमिलित करें 3 '-UTR समरूपता क्षेत्र amplicon16SLIC का उपयोग कर पच प्लाज्मिड ।
    2. सक्षम ई. कोलाई में बदलना और प्लाज्मिड डीएनए (कदम 2.3.4 और -6) निकालने.

5. अभिकर्मक के लिए शुष्कीकरण डीएनए

  1. जोड़ें ४० μg प्रत्येक पीएमके-U6, pUF1-Cas9, और के ्ह्-glmS डीएनए (डीएनए के कुल १२० μg के लिए) एक बाँझ में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब.
  2. 1/10वीं पास पानी में 3 एम सोडियम एसीटेट के डीएनए की मात्रा (pH ५.२) को ट्यूब पर डालें और इसे अच्छी तरह से एक भंवर का उपयोग करके मिक्स करें (उदा., यदि चरण ५.१ में वॉल्यूम १०० μL था, तो 10 μL सोडियम एसीटेट) जोड़ें ।
  3. २.५ बार ट्यूब करने के लिए १००% इथेनॉल की मात्रा जोड़ें और यह अच्छी तरह से मिश्रण के लिए एक भंवर का उपयोग कर (उदाहरण के लिए, अगर ५.१ में मात्रा १०० μL था, २५०% इथेनॉल के १०० μL जोड़ें) ।
  4. बर्फ पर या 30 मिनट के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब प्लेस ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १८,३०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
  6. ध्यान से supernatant को ट्यूब से हटा दें । गोली परेशान मत करो ।
  7. जोड़ें 3 बार ट्यूब के लिए ७०% इथेनॉल की मात्रा और मिश्रण यह संक्षेप में एक भंवर का उपयोग कर (उदाहरणके लिए, यदि ५.१ में मात्रा १०० μL था, ७०% इथेनॉल के ३०० μL जोड़ें) ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १८,३०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
    नोट: यह कदम एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए ।
  9. ध्यान से supernatant को ट्यूब से हटा दें । गोली परेशान मत करो । खुली ट्यूब छोड़ दो और हवा के लिए गोली की अनुमति 15 मिनट के लिए सूखी ।
  10. अभिकर्मक के लिए आवश्यक है जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर उपजी डीएनए की दुकान.

6. अभिकर्मक के लिए तैयारी में पूरे रक्त से मानव RBCs को अलग करना

  1. Aliquot ताजा रक्त बाँझ में ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों (लगभग 25 मिलीलीटर प्रति ट्यूब) ।
  2. 12 मिनट के लिए १,०८८ x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक, 4 के लिए सेट ब्रेक के साथ ।
  3. supernatant और buffy कोट से महाप्राण । अपूर्ण RPMI की एक बराबर मात्रा के साथ आरबीसी गोली resuspend ।
    नोट: अपूर्ण RPMI १०.३२ माइक्रोन thymidine, ११०.२ माइक्रोन hypoxanthine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 30 मिमी सोडियम बिकारबोनिट, 5 मिमी HEPES, ११.१ मिमी ग्लूकोज, और ०.०२% (वी/वी) gentamicin के साथ RPMI १६४० सप्लीमेंट द्वारा तैयार किया गया है ।
  4. दोहराएं चरण 6.2 – 6.3 दो बार । पिछले धोने के बाद, अपूर्ण RPMI की एक बराबर मात्रा में RBCs resuspend और 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों की दुकान ।

7. CRISPR/Cas9 Plasmids के साथ Transfecting RBCs (Aseptically किया जाना)

नोट: P. फाल्सीपेरम संस्कृतियों अन्य रिपोर्ट17में वर्णित के रूप में बनाए रखे जाते हैं । ३७ ° c पर सभी संस्कृतियों को बनाए रखने के तहत 3% हे2, 3% CO2, और ९४% N2 जब तक अंयथा कहा । जब भी इस प्रोटोकॉल में रक्त का प्रयोग किया जाता है तो यह चरण 6 में तैयार शुद्ध लाल रक्त कोशिकाओं का जिक्र होता है । रक्त का इस्तेमाल 6 सप्ताह से अधिक पुराना नहीं होना चाहिए, क्योंकि आम तौर पर बड़े रक्त में परजीवी प्रसार में कमी आती है । निंनलिखित चरणों का वर्णन पूर्व लोड हो रहा है RBCs डीएनए के साथ और transfected कोशिकाओं को एक परजीवी संस्कृति जोड़ने । अंय स्थापित अभिकर्मक प्रोटोकॉल transfecting के साथ संगत कर रहे है इन निर्माण18,19।

  1. पानी में एक 1x cytomix बफर तैयार (१२० mm KCl, ०.१५ mm CaCl2, 2 mm EGTA, 5 mm MgCl2, 10 mm K2HPO4, 25 mm HEPES, पीएच ७.६) । फ़िल्टर-एक ०.२२ माइक्रोन फिल्टर का उपयोग बफर निष्फल ।
  2. जोड़ने के डीएनए के लिए 1x cytomix के ३८० μL चरण 5 में उपजी है, और भंवर को भंग करने के लिए । 10 मिनट के लिए 1x cytomix में भंग करने के लिए डीएनए की अनुमति दें, 10 एस के लिए हर 3 मिनट भंवर
  3. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में, RBCs के ३०० μL (५०% हेमाटोक्रिट, 6 कदम से) में अधूरा RPMI 1x cytomix के 4 मिलीलीटर के साथ गठबंधन ।
  4. RBCs ७.३ कदम से ८७० एक्स जी में 3 मिनट के लिए, और फिर आरबीसी गोली से supernatant हटाने के केंद्रापसारक ।
  5. डीएनए के साथ आरबीसी गोली resuspend/६.२ कदम से cytomix मिश्रण और एक ०.२ सेमी electroporation cuvette के लिए स्थानांतरण ।
  6. Electroporate निंन स्थितियों का उपयोग कर RBCs: ०.३२ केवी, ९२५ μF, के लिए सेट समाई "उच्च कैप", और प्रतिरोध करने के लिए सेट "अनंत" ।
  7. electroporation के बाद, cuvette से सामग्री को एक 15 मिलीलीटर शंकु में स्थानांतरित करें जिसमें 5 मिलीलीटर पूर्ण RPMI (cRPMI) है । 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ८७० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक, और फिर supernatant ।
    नोट: cRPMI ०.२५% (डब्ल्यू/वी) लिपिड अमीर गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के अलावा के साथ अधूरा RPMI के रूप में एक ही विधि के माध्यम से तैयार किया जाता है ।
  8. cRPMI के 4 मिलीलीटर और एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली में एक अच्छी तरह से हस्तांतरण में गोली resuspend । एक उच्च schizont संस्कृति के ४०० μL जोड़ें (7-10% schizont parasitemia आदर्श है) को transfected RBCs ।
    नोट: Parasitemia परजीवी संक्रमित RBCs के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया गया है ।
  9. अगले दिन, cRPMI के 4 मिलीलीटर के साथ संस्कृति को धो लें । 3 मिनट के लिए ८७० x जी में संस्कृति केंद्रापसारक और महाप्राण supernatant । cRPMI के 4 मिलीलीटर में संस्कृति resuspend ।
  10. ४८ ज चरण ७.६ को पूरा करने के बाद, cRPMI के 4 मिलीलीटर के साथ संस्कृति धो लो । फिर resuspend 1 माइक्रोन DSM1 युक्त cRPMI में संस्कृति Cas9 प्लाज्मिड के लिए चयन करने के लिए ।
  11. cRPMI के साथ एक दिन संस्कृतियों धोने जारी रखें जब तक परजीवी रक्त धब्बा द्वारा दिखाई नहीं रह रहे हैं । इस बिंदु के बाद, नए cRPMI प्लस के साथ संस्कृति माध्यम की जगह 1 माइक्रोन DSM1 हर ४८ एच ।
    1. एक खून धब्बा बनाने के लिए, पिपेट १५० μL संस्कृति के एक ०.६ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में । 30 एस के लिए १,७०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली ।
    2. महाप्राण बंद supernatant. किसी पिपेट का उपयोग किसी ग्लास स्लाइड पर छर्रों वाले कक्षों को स्थानांतरित करने के लिए करें. पहली स्लाइड के लिए एक ४५ ° कोण पर आयोजित एक दूसरे गिलास स्लाइड का उपयोग करना, रक्त छोटी बूंद धब्बा. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दाग किट का उपयोग कर स्लाइड दाग ।
    3. एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर परजीवी देखें ।
  12. शुरुआत 5 दिनों के बाद-अभिकर्मक (चरण ७.६), संस्कृति माध्यम में resuspend RBCs के साथ संस्कृति के 2 मिलीलीटर निकालें । 2% हेमाटोक्रिट में ताजा मध्यम (cRPMI प्लस 1 माइक्रोन DSM1) और रक्त के 2 मिलीलीटर वापस जोड़ें । इस तरह से ताजा रक्त जोड़ें एक सप्ताह में एक बार जब तक परजीवी फिर से प्रकट होता है, के रूप में पतले रक्त धब्बा द्वारा निर्धारित (७.११ कदम) ।
    नोट: एकीकरण सफल होता है, परजीवी आम तौर पर एक महीने के बाद अभिकर्मक द्वारा संस्कृति में फिर से दिखाई देते हैं ।
  13. एक बार परजीवी फिर से उभरने, DSM1 दवा दबाव को दूर । वैकल्पिक रूप से, परजीवी बाहर क्लोन किया गया है के बाद दवा के दबाव को दूर ।

8. मरंमत टेम्पलेट के एकीकरण के लिए परजीवी की जाँच

  1. जब परजीवी पतले रक्त धब्बा द्वारा फिर से दिखाई दे रहे हैं, एक उपयुक्त किट का उपयोग कर संस्कृति से डीएनए को अलग ।
  2. पीसीआर का प्रयोग करें जीनोम के संशोधित क्षेत्र बढ़ाना निर्धारित करने के लिए अगर लक्षित लोकस सफलतापूर्वक बदल दिया गया है और यदि संशोधित जंगली प्रकार लोकस (जंगली प्रकार के परजीवी का संकेत) detectable है ।
    1. परजीवी है कि मरंमत टेंपलेट एकीकृत है का पता लगाने के लिए, एक आगे प्राइमर कि ओआरएफ, क्लोन समरूपता क्षेत्र के बाहर की शुरुआत में बैठता है का उपयोग करें । एक रिवर्स प्राइमर है कि 3 ' में बैठता है-UTR का प्रयोग करें ।
      नोट: के रूप में इस प्रवर्धन शामिल है हा टैग और glmS ribozyme, एकीकृत परजीवी से amplicons एक ही जंगली प्रकार परजीवी में परिवर्धित क्षेत्र की तुलना में लंबा हो जाएगा के दृश्यों ।

9. कमजोर पड़ने को सीमित करके परजीवी क्लोनिंग

  1. ७.१३ कदम से परजीवी संस्कृति के धारावाहिक कमजोरियां प्रदर्शन ०.५ परजीवी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए/200 μL । एक ९६-well टिशू कल्चर प्लेट के कुओं के लिए पतला संस्कृति के २०० μL जोड़ें ।
    नोट: क्योंकि parasitemia संक्रमित RBCs के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया गया है और हेमाटोक्रिट भी एक निर्धारित संख्या (2%), प्रति यूनिट मात्रा परजीवी की संख्या आसानी से आस्थगित है ।
    1. cRPMI में 5% parasitemia और 2% हेमाटोक्रिट पर संस्कृति के 1 मिलीलीटर तैयार (इन parasitemia और हेमाटोक्रिट स्तर पर, संस्कृति में 1 x 107 परजीवी/
    2. cRPMI के साथ इस संस्कृति 1:100 पतला । cRPMI के साथ फिर से पतला 1:100 ।
    3. पतला 1:400 । cRPMI के 25 मिलीलीटर और रक्त की 1 मिलीलीटर के लिए संस्कृति के ६२.५ μL जोड़कर इस कमजोर पड़ने प्रदर्शन । ०.५ परजीवी की वांछित एकाग्रता में इस कमजोर पड़ने परिणाम 200 μL/
  2. क्लोनिंग प्लेट को बनाए रखें जब तक कि परजीवी कुएँ में detectable न हों.
    1. हर ४८ एच, ताजा माध्यम के साथ ९६ अच्छी तरह से थाली में मध्यम की जगह ।
    2. एक बार एक सप्ताह, शुरू करने के बाद 5 दिन क्लोनिंग प्लेट (चरण ९.१) शुरुआत, एक अच्छी तरह से १०० μL निकालें और वापस जोड़ें १०० ताजा मध्यम के μL + रक्त (2% हेमाटोक्रिट).
  3. परजीवी युक्त किसी भी कुओं की पहचान करें ।
    1. लगभग 20 मिनट के लिए एक ४५ ° कोण पर ९६-अच्छी तरह से थाली प्लेस, रक्त थाली के भीतर एक कोण पर बसने के लिए अनुमति देता है ।
    2. एक प्रकाश बॉक्स पर ९६-well थाली प्लेस । सूचना है कि परजीवी युक्त कुओं मीडिया है कि रंग में पीला है, परजीवी मुक्त कुओं के गुलाबी मीडिया की तुलना में, परजीवी द्वारा माध्यम की अंलीकरण के कारण होते हैं ।
    3. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, parasitemia के विस्तार की अनुमति देने के लिए एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली के लिए परजीवी युक्त कुओं की सामग्री ले जाएँ.
    4. चरण 8 में वर्णित के रूप में पीसीआर विश्लेषण का उपयोग करना, सही एकीकरण के लिए इन क्लोनल परजीवी लाइनों की जांच करें ।

10. पश्चिमी दाग विश्लेषण के जरिए Glucosamine और पुष्टिकरण के साथ परजीवी के इलाज से प्रोटीन की पछाड़ना

  1. एक ०.५ मीटर GlcN (glucosamine) स्टॉक समाधान तैयार करें, जो-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. glmS परजीवी संस्कृतियों में GlcN जोड़ें और उंहें GlcN की उपस्थिति में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: अंतिम एकाग्रता और GlcN उपचार के समय प्रयोग और परजीवी लाइन पर निर्भर करता है । GlcN परजीवी विकास को प्रभावित कर सकते हैं, तो पैतृक परजीवी तनाव GlcN सांद्रता की एक सीमा को उजागर किया जाना चाहिए यौगिक के लिए अपनी संवेदनशीलता का निर्धारण । अक्सर, 2.0-7.5 mM GlcN की एकाग्रता13,14,20का उपयोग किया जाता है ।
  3. GlcN-इलाज परजीवी13से प्रोटीन के नमूनों को अलग ।
  4. प्रोटीन13में कटौती का पता लगाने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए प्रोटीन के नमूनों का प्रयोग करें ।
    1. हा-glmS-tagged प्रोटीन का पता लगाने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक एंटी-हा एंटीबॉडी का प्रयोग करें । एक लोडिंग नियंत्रण, जैसे PfEF1α के लिए हा बैंड की तुलना करें ।

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Representative Results

plasmids के एक योजनाबद्ध इस विधि में इस्तेमाल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक ढाल उत्परिवर्तन का एक उदाहरण चित्रा 1में दिखाया गया है । कैसे अभिकर्मक के बाद उत्परिवर्ती परजीवी की पहचान करने के लिए का एक उदाहरण के रूप में, हा के एकीकरण की जांच के लिए पीसीआर से परिणाम-glmS निर्माण चित्रा 2में दिखाया गया है । एक क्लोनिंग प्लेट की एक प्रतिनिधि छवि परजीवी की उपस्थिति में माध्यम के रंग परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए चित्रा 3 में दिखाया गया है. एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख से परिणाम और पश्चिमी सोख्ता प्रयोगों चित्रा 4 में दिखाया गया है के लिए हा टैग की कार्यक्षमता और परजीवी में प्रोटीन की glmSआधारित कटौती का प्रदर्शन । चित्रा 5 परजीवी जीनोम को संशोधित करने और व्यवहार्य म्यूटेंट प्राप्त करने के लिए पीसीआर उत्पादों पर कम समरूपता हथियारों की अक्षमता को दर्शाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: CRISPR/Cas9 और एक gRNA oligo और ढाल उत्परिवर्तन के उदाहरण के लिए हमारे तीन-प्लाज्मिड दृष्टिकोण का सारांश । (क) खाली ्ह्-glmS और पीएमके-U6 के योजनाबद्ध ढंग से क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किए गए प्रतिबंध एंजाइम साइटों के साथ दिखाए गए हैं. यह भी दिखाया गया है के ्ह्-glmS और पीएमके-U6 के बाद समरूपता हथियार और gRNA अनुक्रम में उंहें क्लोन किया गया है, क्रमशः । अंत में, pUF1-Cas9 दिखाया गया है । yDHOD = खमीर dihydrofolate रिडक्टेस, प्रतिरोध मार्कर को DSM1 । (ख) पीएमके-U6 में PfHsp70x gRNA अनुक्रम की क्लोनिंग के लिए प्रयुक्त फॉरवर्ड oligo को दिखाया गया है, जिसे कैपिटल अक्षरों में gRNA अनुक्रम के साथ और पीएमके-U6 समरूपता को लोअरकेस अक्षरों (ऊपर) में क्लोनिंग के लिए आवश्यक हथियार. PfHsp70x gRNA के जीनोमिक लक्ष्य बहाव पाम के रूप में, लाल (मध्य) में दिखाया गया है । PfHsp70x gRNA पाम में ढाल उत्परिवर्तन लाल (नीचे) में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: CRISPR/Cas9 जीनोम के ्ह्-glmS और एकीकरण की पुष्टि के लिए एक रणनीति का उपयोग कर संशोधन के योजनाबद्ध । (क) Cas9, एक gRNA द्वारा एक जीनोमिक लोकस के लिए निर्देशित, डीएनए में एक डबल किनारा तोड़ लाती है । परजीवी डबल क्रॉसओवर मुताबिक़ मरम्मत के माध्यम से नुकसान की मरंमत, एक टेम्पलेट के रूप में ्ह्-glmS प्लाज्मिड का उपयोग और जीनोम में हा glmS अनुक्रम शुरू. (ख) हा-glmS अनुक्रम के सही एकीकरण की पहचान करने के लिए एक पीसीआर परीक्षण । प्राइमर P1 और P2, 3 ' वंय-प्रकार PfHsp70x और PfHsp70x-glmS म्यूटेंट के ओआरएफ का प्रयोग13परिवर्धित कर रहे हैं । PfHsp70x-glmS से amplicon के लिए हा-glmS अनुक्रम की प्रविष्टि के कारण वन्य-प्रकार से अधिक लंबा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक ९६-अच्छी तरह से क्लोनिंग प्लेट में परजीवी युक्त कुओं की पहचान । (क) ९६-खैर थाली लगभग 20 मिनट के लिए एक ४५ ° कोण पर सेट करने के लिए रक्त थाली में एक कोण पर बसने की अनुमति है । (ख) बाईं ओर अच्छी तरह से एक परजीवी संस्कृति है, सही पर परजीवी मुक्त अच्छी तरह से गुलाबी माध्यम की तुलना में माध्यम के पीले रंग से संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख PfHsp70x और पश्चिमी सोख्ता के सही हा-टैगिंग से पता चलता है glucosamine के साथ उपचार के दौरान PfHsp70x प्रोटीन के स्तर की कमी से पता चलता है । (क) PfHsp70x-glmS परजीवी तय किए गए और DAPI (नाभिक मार्कर) और एंटीबॉडी के साथ हा और MAHRP1 (झिल्ली से जुड़े Histidine रिच प्रोटीन 1, मेजबान आरबीसी को प्रोटीन निर्यात का एक मार्कर)13। (ख) PfHsp70x-glmS परजीवी ७.५ मिमी glucosamine के साथ इलाज किया गया था, और पूरे-परजीवी lysates पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए13. झिल्ली एक लोडिंग नियंत्रण13के रूप में हा और PfEF1α के लिए एंटीबॉडी के साथ जांच की थी । जैसा कि उंमीद थी, glucosamine उपचार प्रोटीन की कमी के परिणामस्वरूप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: मरंमत के लिए लघु समरूपता दृश्यों का उपयोग करना । (एक) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व GFP के नॉकआउट में दिखा B7 परजीवी21। B7 परजीवी 3D7 के व्युत्पंन है जिसमें Plasmepsin द्वितीय GFP के साथ टैग किया गया है । पीसीआर उत्पादों ५०, ७५, या १०० GFP समरूपता क्षेत्रों के आधार जोड़े एक blasticidin प्रतिरोध कैसेट पार्श्व (लेबल "मार्कर"), साथ pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, एक प्लाज्मिड व्यक्त Cas9 और एक GFP gRNA, transfected परजीवी में B7 थे । प्रत्येक अभिकर्मक को दो बार बाहर किया जाता था । DSM1 दवा दबाव 2 दिन पोस्ट अभिकर्मक लागू किया गया था । (ख) यहां दिखाए गए डीएनए पर पीसीआर परीक्षण transfected परजीवी से अलग कर रहे है 5 दिनों के बाद अभिकर्मक और 2 महीने के बाद अभिकर्मक । प्राइमरों बीएसडी प्रतिरोध कैसेट के एकीकरण परीक्षण के लिए एक ५८४-B7 पैतृक परजीवी के लिए आधार जोड़ी उत्पाद और परजीवी है कि मार्कर एकीकृत है के लिए एक २०२० आधार जोड़ी उत्पाद उपज होगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

CRISPR/Cas9 के कार्यांवयन फाल्सीपेरम में दोनों की क्षमता में वृद्धि हुई है और परजीवी जीनोम को संशोधित करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा में कमी आई, आनुवंशिक हेरफेर के पिछले तरीकों की तुलना में । इस व्यापक प्रोटोकॉल CRISPR/Cas9 का उपयोग कर फाल्सीपेरममें सशर्त म्यूटेंट पैदा करने के लिए आवश्यक कदम की रूपरेखा । जबकि विधि यहां विशेष रूप से हा-glmS म्यूटेंट की पीढ़ी के लिए तैयार है, इस रणनीति की जरूरतों की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जीन की टैगिंग सहित, जीन नॉकआउट, और बिंदु उत्परिवर्तनों का परिचय ।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम एक gRNA अनुक्रम का चयन है । जब एक gRNA का चयन, वहां कई बिंदुओं पर विचार कर रहे है जैसे जहां gRNA बैठता है, कैसे कुशल है, और चाहे या नहीं यह बंद लक्ष्य प्रभाव के लिए क्षमता है । gRNA अनुक्रम के रूप में संशोधन की साइट के लिए संभव के रूप में बंद होना चाहिए, आदर्श रूप में २०० आधार जोड़े के भीतर । इस परजीवी की मरंमत का उपयोग करने के लिए टैग को एकीकृत करने के बिना उनके जीनोम तय खाके की संभावना कम हो जाती है । gRNA का पता लगाने के लिए यहां प्रयोग किया जाने वाला उपकरण,22CHOPCHOP नामक एक निःशुल्क, ऑनलाइन सेवा थी । एक अंय ऑनलाइन उपकरण, Eukaryotic रोगज़नक़ CRISPR गाइड आरएनए/डीएनए डिजाइन उपकरण (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/), भी23इस्तेमाल किया जा सकता है । EuPaGDT gRNA दृश्यों के अतिरिक्त लक्षण वर्णन प्रदान करता है, बंद लक्ष्य हिट और संभावित मुद्दों है कि gRNA के प्रतिलेखन को रोकने सकता है की भविष्यवाणी भी शामिल है । EuPaGDT भी कई जीन या पूरे जीनोम को लक्षित करने के लिए gRNAs के बैच प्रसंस्करण के लिए उपकरण है । चयनित gRNA एक है कि उच्चतम दक्षता और ंयूनतम बंद लक्ष्य हिट के साथ संशोधन की साइट के निकटतम बैठता होना चाहिए । CRISPR/Cas9 जीन संपादन है कि पैदा हो सकता है की एक महत्वपूर्ण सीमा के लिए एक उपयुक्त gRNA डिजाइन करने के लिए ब्याज की जीन लक्ष्य अक्षमता है । ऐसे मामलों में, एक परीक्षण और त्रुटि के दृष्टिकोण की आवश्यकता हो सकती है, एकाधिक उप इष्टतम gRNA अनुक्रम का उपयोग कर जब तक सबसे अच्छा विकल्प मिला है, और सफल जीन संपादन हुआ है ।

CRISPR/Cas9 का उपयोग करते हुए P. फाल्सीपेरम म्यूटेंट जनरेट कर रहा है जब विचार करने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण कारक मरम्मत टेम्पलेट में उपयोग समरूपता क्षेत्रों की लंबाई है । इस प्रोटोकॉल की सिफारिश की है कि समरूपता क्षेत्रों लगभग ८०० आधार जोड़े प्रत्येक होना चाहिए, लेकिन हम भी छोटे क्षेत्रों ५०० आधार जोड़े3नंबर का उपयोग करने में सफल रहा है । पीसीआर उत्पादों पर CRISPR/Cas9 और शॉर्ट समरूपता आर्म्स का इस्तेमाल करने वाले सफल जीनोम संशोधन में अन्य प्रोटोजोआ परजीवी जैसे Toxoplasma gondii और ट्रायकॉमोनास वेजिनेलिस24,25का भी इस्तेमाल किया गया है। हम पीसीआर उत्पादों पर छोटे समरूपता हथियारों का उपयोग करने की व्यवहार्यता का परीक्षण (५०, ७५, या १०० आधार जोड़े) B7 परजीवी में नॉकआउट GFP के प्रयास से एक blasticidin प्रतिरोध कैसेट21का उपयोग कर । हम 5 दिन पोस्ट अभिकर्मक में blasticidin प्रतिरोध कैसेट के कुछ एकीकरण देखा; हालांकि, ये परजीवी कभी भी अभिकर्मक से बरामद नहीं हुए । इन transfections के लिए हमने DSM1 का प्रयोग करते हुए Cas9-व्यक्त प्लाज्मिड के लिए चुना । ऐसी blasticidin के साथ transfected संस्कृतियों के इलाज के रूप में एक अलग चयन विधि, अकेले या DSM1 के साथ संयोजन में, Cas9/gRNA-प्रेरित टूटता मरंमत के लिए छोटे समरूपता क्षेत्रों का उपयोग करते समय फिर से दिखने परजीवी की संभावना में सुधार हो सकता है । इस मामले में, हम blasticidin के साथ चयन नहीं किया एस के बाद से हम परीक्षण अगर कम समरूपता हथियार उदाहरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है जहां एक दवा प्रतिरोध कैसेट जीनोम में एकीकृत नहीं किया जा रहा है, जैसे जब एक प्रोटीन है टैग किया जा रहा है चाहता था ।

CRISPR/Cas9 जीन संपादन चर्चा के मुख्य घटक Cas9 endonuclease, gRNA, और मरंमत टेंपलेट हैं । हम इन घटकों को परजीवी में पेश करने के लिए एक त्रि-प्लाज्मिड दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, जहां Cas9, gRNA और मरंमत टेम्पलेट को अलग plasmids में पाया जाता है । इस दृष्टिकोण के अलावा, हमारी प्रयोगशाला एक दो प्लाज्मिड दृष्टिकोण है जिसमें Cas9 और gRNA अभिव्यक्ति एक एकल प्लाज्मिड द्वारा संचालित कर रहे हैं और मरंमत टेम्पलेट एक दूसरे प्लाज्मिड3में पाया जाता है का उपयोग करने में सफल रहा है । इसी तरह के दो प्लाज्मिड दृष्टिकोण भी सफलतापूर्वक अंय प्रयोगशालाओं द्वारा नियोजित किया गया है म्यूटेंट7,8,26,27,28,29उत्पंन करते हैं । इसके अलावा, कई प्रयोगशालाओं प्लाज्मोडियम (NF54attB) के एक तनाव का उपयोग कर रहे हैं, जो Cas9 व्यक्त constitutively और एक T7 आरएनए पोलीमरेज़30gRNAs की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए । इस मामले में, मरंमत टेम्पलेट और gRNA युक्त एक एकल प्लाज्मिड NF54attB परजीवी31,३२में transfected हैं । अंत में, एक प्लाज्मिड मुक्त एक शुद्ध Cas9-gRNA ribonucleoprotein परिसर का उपयोग दृष्टिकोण जीनोम में उत्परिवर्तनों डालने के लिए इस्तेमाल किया गया है, के रूप में अच्छी तरह से३३। इन विभिंन तरीकों की सफलता के तरीके में शोधकर्ताओं Cas9/gRNA घटकों को लागू कर सकते है के लचीलेपन को दर्शाता है परजीवी ।

अंत में, दवा दबाव का चुनाव transfected परजीवी को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया निर्माण पर निर्भर करता है, बदला जा सकता है । यहां, हम क्षणिक Cas9-व्यक्त प्लाज्मिड का उपयोग DSM1 जब तक परजीवी फिर से दिखने के लिए चयन द्वारा म्यूटेंट की सफल पीढ़ी दिखाते हैं । PfHsp70x पीटकर परजीवी उत्पन्न करने के लिए, PfHsp70x मानव dihydrofolate रिडक्टेस जीन के साथ प्रतिस्थापित किया गया था, और परजीवी तो13WR99210 का उपयोग कर चुना गया. हाल ही में वर्णित TetR-PfDOZI पछाड़ना प्रणाली एक blasticidin प्रतिरोध जीन युक्त एक प्लाज्मिड के एकीकरण पर निर्भर करता है, blasticidin एस15,31का उपयोग परजीवी के चयन के लिए अनुमति देता है ।

कुल मिलाकर, CRISPR/Cas9 जीन संपादन पी फाल्सीपेरम के मलेरिया अनुसंधान में एक शक्तिशाली उपकरण साबित हो गया है, और यहां प्रोटोकॉल सशर्त पछाड़ना म्यूटेंट3,7,8 पैदा करने के लिए तरीके विवरण , 13 , 20 , 28. इस प्रोटोकॉल को व्यक्तिगत अनुसंधान के हितों के लिए अत्यधिक अनुकूल है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Muthugapatti Kandasamy जॉर्जिया के विश्वविद्यालय में धंयवाद (UGA) तकनीकी सहायता और जोस-जुआन लोपेज के लिए जैव चिकित्सा माइक्रोस्कोपी कोर-pUF1 Cas9 और pL6 plasmids बांटने के लिए रूबियो । यह काम आर्क्स फाउंडेशन पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था D.W.C. करने के लिए और H.M.K. करने के लिए, UGA स्टार्टअप धन V.M. करने के लिए, सिक्का फाउंडेशन के मार्च से अनुदान (तुलसी कॉनर स्टार्टर विद्वान अनुसंधान पुरस्कार) V.M. के लिए, और अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान (R00AI099156 और R01AI130139) को V.M. और (T32AI060546) को H.M.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 1652660
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 165-2086 We buy the ones that are individually wrapped
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889-250g
DSM1 Gift from Akhil Vaidya lab Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
TPP Tissue Culture 6 Well Plates MIDSCI TP92006
TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) MIDSCI TP93100
TPP Tissue Culture 96 Well Plates MIDSCI TP92096
TPP Tissue Culture 24 Well Plates MIDSCI TP92024
NEBuffer 2 New England Biolabs #B7002S
NEBuffer 2.1 New England Biolabs #B7202S
BtgZI New England Biolabs #R0703L
SacII New England Biolabs #R0157L
HindIII-HF New England Biolabs #R3104S
Afe1 New England Biolabs #R0652S
Nhe1-HF New England Biolabs #R3131L
T4 DNA Polymerase New England Biolabs #M0203S
500 mL Steritop bottle top filter unit Millipore SCGPU10RE You can use any size that fits your needs
EGTA Sigma E4378-100G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500g
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902-500g
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100g
K2HPO4 Fisher P288-500
HEPES Sigma-Aldrich H4034-500g
pMK-U6 Generated by the Muralidharan Lab n/a
pHA-glmS Generated by the Muralidharan Lab n/a
pUF1-Cas9 Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab Ghorbal et al. Nature Biotech 2014
Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280-100G
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9636-25g
Gentamicin Reagent Gibco 15710-064
Thymidine Sigma-Aldrich T1895-1G
PL6-eGFP BSD Generated by the Muralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNA Generated by the Muralidharan Lab
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.250
Albumax I Life Technologies N/A You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best
Human Red Blood Cells Interstate Blood Bank, Inc Email or call them directly for ordering We typically use O+ blood
3D7 parasite line Available upon request N/A
Lysogeny Broth (LB) Fisher BP1426-2 You can make your own, it is not necessary to use exactly this
Ampicilin Fisher BP1760-25 We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C
Ampicilin Clonetech R050A
Anti-EF1alpha Dr. Daniel Goldberg's Lab Washington University in St. Louis You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory
Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal Made by Roche, sold by Sigma 11867423001 You can use your preferred anti-HA antibody
0.6 mL tubes Fisher AB0350
Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) Fisher 22-122-911 You can also use giemsa stain
Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. Fisher 12-544-3

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १३९ CRISPR प्लाज्मोडियम glmS पछाड़ना मलेरिया जेनेटिक्स
CRISPR/Cas9 जीन संपादन मानव मलेरिया परजीवी <em>पी. फाल्सीपेरम</em> की सशर्त म्यूटेंट बनाने के लिए
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Kudyba, H. M., Cobb, D. W.,… More

Kudyba, H. M., Cobb, D. W., Florentin, A., Krakowiak, M., Muralidharan, V. CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum. J. Vis. Exp. (139), e57747, doi:10.3791/57747 (2018).

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