Summary
نقدم هنا بروتوكولا لكفاءة عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار. يبسط هذا الأسلوب الإجراء التقليدي باستخدام Y-27632 مثبط لموسيقى الروك في الأجلين المتوسط والتطعيم بصورة عفوية فصل خلايا البشرة من خلايا الجلد.
Abstract
الكيراتينيه البشرية الأولية المعزولة من أنسجة الجلد طازجة وعلى التوسع في المختبر يستخدم على نطاق واسع لمختبر البحوث والتطبيقات السريرية. طريقة العزل التقليدية الكيراتينيه البشرية ينطوي على إجراء خطوتين هضم الأنزيمي متسلسل، التي ثبت أن تكون غير فعالة في توليد الخلايا الأولية من أنسجة البالغين نظراً لمعدل استرداد الخلية منخفضة وانخفاض الخلية البقاء. نحن ذكرت مؤخرا أسلوب متقدمة لعزل الخلايا البشرية السلف البشرة الأولية من أنسجة الجلد التي تستخدم مثبطات كيناز رو Y-27632 في الأجل المتوسط. وبالمقارنة مع البروتوكول التقليدي، هذا الأسلوب الجديد هو أبسط وأسهل وأقل استهلاكاً للوقت، ويزيد الغلة طلائي الخلايا الجذعية ويعزز خصائصها الخلايا الجذعية. وعلاوة على ذلك، المنهجية الجديدة لا تتطلب انفصال البشرة عن الأدمة، وذلك، وهي مناسبة لعزل الخلايا من أنواع مختلفة من الأنسجة الكبار. هذا الأسلوب الجديد في عزلة يتغلب على أوجه القصور الرئيسية في الطرق التقليدية، وهو أكثر ملاءمة لإنتاج إعداد كبيرة من خلايا البشرة بفاعلية عالية للمختبرات والتطبيقات السريرية. وهنا يصف لنا الطريقة الجديدة بالتفصيل.
Introduction
والهدف من ذلك وضع بروتوكول بسيط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية (هككس) من أنسجة البالغين، خاصة بالنسبة للتطبيقات السريرية. خلايا جذعية البشرة الجلد، المترجمة في الطبقة القاعدية للجلد، وتمتلك إمكانات كبيرة لتتكاثر والتفريق وتوفير الكيراتينيه للحفاظ على وظائف الجلد1،2،3، 4-هككس المعزولة من الجلد أنسجة تستخدم على نطاق واسع في الأغراض الجلد الأنسجة الهندسة والتجديد، خاصة في إصلاح تلف الجلد والعلاج الجيني للتطبيقات السريرية5،6. هو القضية الرئيسية للتطبيقات المستندة إلى HKC لعزل بكفاءة وتوسيع إعداد كبيرة من هككس مع ارتفاع محتمل في المختبر7،8. على الرغم من أن مختلف مجموعات بحثية تطورت أساليب إنتاج ثقافات هككس الشبيهة الجذعية، هذه الأساليب في بعض الأحيان تستغرق وقتاً طويلاً ومعقداً لأداء والقيود الأخرى، مثل الخلية منخفضة الغلة ويجري محدودة حسب نوع العينة الجلد ويستخدم9. على سبيل المثال، الأسلوب التقليدي لعزل هككس من أنسجة الجلد ينطوي خطوتين هضم الأنزيمي مع انفصال البشرة عن الأدمة6. هذا الأسلوب عادة ما يعمل بشكل جيد الوليدي الأنسجة، ولكن يصبح من الصعب جداً عندما تستخدم لعزل خلايا من أنسجة البالغين.
Y-27632، المانع من البروتينات المرتبطة رو كيناز (روك)، أبلغ أن يعزز كفاءة الخلايا الجذعية البشرة العزلة ومستعمرة النمو10،،من1112. في دراسة سابقة، اكتشفنا أن Y-27632 يسهل نمو خلايا البشرة الاستنساخ ولكن يقلل عائد خلايا الجلد عن طريق خلطات السيطرة على التعبير عن التصاق جزيئات13. كما أنشأنا وسيلة تلقيح مكيفة جديدة، تسمى ز-المتوسطة، التي تدعم النمو والعائد من خلايا البشرة الأولية. من خلال الجمع بين ز-متوسطة مع Y-27632، يمكن فصل هذا الأسلوب رواية عفويا خلايا البشرة والجلد بعد إنزيم الهضم، وبالتالي إزالة الخطوة البشرة-الأدمة الفصل13،14. استناداً إلى التقارير السابقة، ونحن الآن أن تصف الإجراءات المفصلة لهذا الأسلوب الجديد لعزل هككس من أنسجة الجلد الكبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول قد تم التعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية للمؤسسة (NO.2015120401، التاريخ: 12 مايو 2015).
1-الأعمال التحضيرية
- تعديل الأنسجة جمع جلد البطن الكبار جديدة سيتم تجاهلها من الجراحة التجميلية في المستشفى في أنبوب 50 مل مع 10 مل دولبيكو المثلج النسر المتوسطة (دميم). يمكن الاحتفاظ بالعينة في 4 درجات مئوية ليصل إلى 72 ساعة دون درجة كبيرة تؤثر على بقاء الخلية.
- إعداد الكواشف والمتوسطة الثقافة كما هو موضح أدناه.
- إضافة 1 مل من البنسلين (100 U/mL) وستربتوميسين (100 مغ/لتر) إلى 50 مل من محلول التي مخزنة الفوسفات (PBS) لإعداد الحل الغسيل.
- إعداد مجموعتين من إنزيم الهضم الحلول: (1) إعداد 50 مل ديسباسي (2.5 ملغ/مل في دميم) و 50 مل من النوع الأول كولاجيناز (2.5 ملغ/مل في دميم) بشكل منفصل عن الطريقة التقليدية؛ و (2) إعداد 50 مل مزيج ديسباسي والنوع الأول كولاجيناز (ذوب 125 ملغ من مسحوق ديسباسي و 125 ملغ من النوع الأول من مسحوق كولاجيناز في 50 مل دميم) للأسلوب الجديد.
ملاحظة: جميع إنزيم الحلول ينبغي تصفيتها بمصفاة 0.22 ميكرومتر وأبقى at4 درجة مئوية. - إعداد الحلول الهضم لكلا الأسلوبين: التربسين 0.05% و 0.25% التربسين تم شراؤها تجارياً. إعداد 10 ملغ/مل الدناز أنا الحل بإذابة 50 مغ الدناز أنا مسحوق في 5 مل من برنامج تلفزيوني، تصفية بمصفاة 0.22 ميكرومتر، وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد 500 مل متوسطة تحييد الهضم الأنزيمي: دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1%.
- إعداد 500 مل من التطعيم المتوسطة (التي تحتوي على عامل النمو المتوسطة، دعا ز-المتوسطة): DMEM/F12 المتوسطة (3:1) الذي يحتوي على 1% البنسلين/ستربتوميسين، 40 ميكروغرام/مل فونجيزوني، 40 نانوغرام/مليلتر تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو 2 (FGF2)، 20 عامل نمو البشرة من نانوغرام/مليلتر (لو)، و الملحق 2% B27.
- بريتريات خلية 100 ملم ثقافة الأطباق مع 2 مل مصفوفة الطلاء الذي يحتوي على نوع الكولاجين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2-الأسلوب التقليدية
-
المعالجة المسبقة أنسجة الجلد
- تأخذ 1.5 سم2 من أنسجة الجلد وغسله x 1 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني؛ ثم شطفة مع 10 مل إيثانول 70% ل 30 s واحتضان أنه x 2 مع 10 مل من الغسيل الحل (برنامج تلفزيوني يتضمن البنسلين 2% وستربتوميسين)، كل 5 دقائق.
ملاحظة: يتم تنفيذ يغسل جميع في الخلية 100 ملم ثقافة الأطباق داخل غطاء الاندفاق الصفحي. - تقليم النسيج مع مقص معقم إزالة طبقة الدهون تحت الجلد في صحن ثقافة خلية 100 مم، وتزن ثم أنسجة الجلد (الوزن 1 ز في هذا البروتوكول).
ملاحظة: التشذيب كافية بالغ الأهمية لكفاءة فصل البشرة من الأدمة. ويمكن بسهولة تمييز طبقة الدهون مصفر بصريا. - نقل الأنسجة إلى آخر طبق معقم 100 ملم مع الجانب باطن الجلد إلى أسفل، وثم قطع أنسجة الجلد إلى شرائح 3 إلى 4-مم-على صعيد استخدام شفرة المبضع.
ملاحظة: الجانب الأدمة مع طبقة الدهون بسهولة التعرف بصريا. - أضف 10 مل من محلول ديسباسي 2.5 ملغ/مل إلى أنسجة الجلد في صحن ثقافة 100 ملم، واحتضان ثم طبق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (أي أكثر من 20 ح).
ملاحظة: يمكن حساب مقدار ديسباسي الحل باستخدام 10 مل من محلول ديسباسي لهضم كل جرام من الأنسجة.
- تأخذ 1.5 سم2 من أنسجة الجلد وغسله x 1 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني؛ ثم شطفة مع 10 مل إيثانول 70% ل 30 s واحتضان أنه x 2 مع 10 مل من الغسيل الحل (برنامج تلفزيوني يتضمن البنسلين 2% وستربتوميسين)، كل 5 دقائق.
-
انفصال البشرة عن أنسجة الجلد
- اليوم الثاني، تقشر البشرة من باطن الجلد باستخدام الملقط غرامة.
ملاحظة: إذا كان من الصعب أن تقشر البشرة، الهضم ديسباسي لم تكن كافية، الذي يحدث عادة بسبب اقتطاع غير كافية للأنسجة. وفي هذه الحالة، يحتاج الأنسجة فترة حضانة أطول. - فرم البشرة مقشرة مع 500 ميليلتر من مستنبت الخلية إلى ملاط أنسجة استخدام شفرات مشرط؛ ثم، ريسوسبيند أنه مع 10 مل التربسين 0.25% في أنبوب 50 مل واحتضان من 20 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية، مع الهز.
- اليوم الثاني، تقشر البشرة من باطن الجلد باستخدام الملقط غرامة.
-
جمع واستزراع الخلايا الأولية
- تحييد نشاط التربسين بإضافة وحدة تخزين مساوية لتحييد الحل (10 مل في هذا البروتوكول).
- فصل خلايا البشرة قبل بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً 20 x مع ماصة 10 مل مصلية وتمرير الحل خلية عن طريق مصفاة خلية 100 ميكرون لإزالة أي حطام الأنسجة المتبقية.
- الطرد المركزي حل الخلية في 200 x ز لمدة 5 دقائق بعد الترشيح؛ ريسوسبيند بيليه الخلية في تحييد المتوسطة للغسيل، وثم الطرد المركزي أنه مرة أخرى في 200 x ز للحصول على خلية بيليه.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل متوسطة keratinocyte الكالسيوم منخفضة وخالية من المصل (SFM). تأخذ 10 ميليلتر لهذا الحل عد عدد الخلايا الإجمالية، ولوحة حوالي 2 × 106 خلايا، ثم مع 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات في الخلية 100 ملم ثقافة الأطباق pretreated مع مصفوفة الطلاء (التي تحتوي على النوع الأول من الكولاجين).
ملاحظة: يتم طلاء خطوة ضرورية للطريقة التقليدية. - تغيير الثقافة المتوسطة كل 2 (د).
ملاحظة: التحقق من التصاق الخلايا تحت مجهر قبل وبعد تغيير الثقافة المتوسطة. - مرور الخلايا عندما تصل إلى حوالي 80% التقاء.
ملاحظة: جميع أطباق الثقافة هي pretreated مع مصفوفة الطلاء.
3-أسلوب جديد
-
المعالجة المسبقة أنسجة الجلد
- جمع الأنسجة كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2، 1) للأسلوب التقليدي.
- أغسل أنسجة الجلد 1 x مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، وتزن ثم، في حاوية بلاستيكية معقمة بمقياس إلكترونية (الوزن حوالي 1 ز في هذا البروتوكول).
ملاحظة: وزن الحد الأدنى من الأنسجة اللازمة لهذا البروتوكول 0.1 غ، نظراً لأنه من الصعب الحصول على عدد كاف من الخلايا إذا كانت العينة الأنسجة المستخدمة صغيرة جداً. لا يوجد أي الحد الأقصى للوزن من الأنسجة لهذا البروتوكول، الذي يعتمد في نهاية المطاف على قدرة التعامل مع المشغل. - استخدام الملقط شطف أنسجة الجلد مع 10 مل إيثانول 70% لمدة 30 ثانية.
- احتضان الأنسجة 2 x مع 10 مل من الغسيل الحل (أعد الخطوة 2.1.1)، لمدة 5 دقائق في كل مرة.
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الغسيل المشار إليها أعلاه في الخلية 100 ملم ثقافة الأطباق داخل غطاء الاندفاق الصفحي (غطاء زراعة الأنسجة). - نقل الأنسجة إلى آخر خلية 100 ملم الثقافة طبق العقيمة.
- باستخدام شفرات مشرط، فرم النسيج دقيق إلى ملاط أنسجة.
- إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني كل 5 دقائق للحفاظ على الأنسجة الرطبة.
ملاحظة: يستغرق حوالي 15 دقيقة لخطوات 3.1.5-3.1.7. يتم تنفيذ كافة الخطوات المذكورة أعلاه في درجة حرارة الغرفة.
-
هضم أنسجة الجلد
- نقل الحل النسيج المتجانس في أنبوب 50 مل. أضف 10 مل مخلوط الإنزيم لكل 1 غ من أنسجة الجلد. مزيج الإنزيمات تماما مع أنسجة المتجانس.
- احتضان المخلوط مع الهز في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ح 1.
- إضافة وحدة تخزين 1/5 من 0.25% التربسين (2.5 مل في هذا البروتوكول) إلى الخليط الهضم لآخر 30 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
- إضافة الدناز أنا الحل إلى خليط الإنزيم بنسبة 1: 100 (v/v) (250 ميليلتر في هذا البروتوكول) وتبني عليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
-
جمع واستزراع الخلايا الأولية
- إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة 12.5 مل من تحييد المتوسطة بنسبة 1:1. "الماصة؛" الحل صعودا وهبوطاً لحوالي 20 x, استخدام ماصة 10 مل مصلية لفصل الخلايا.
- تصفية الخلايا معزولة عن طريق مصفاة خلية 100 ميكرون لإزالة الحطام الأنسجة. الطرد المركزي المادة طافية في 200 x ز 5 دقيقة ملاحظة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
- تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه الخلية مع 10 مل من تحييد المتوسطة، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 200 x ز لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من التطعيم المتوسطة (ز-المتوسطة من الخطوة 1.2.5) مع 10 ميكرون من Y-27632.
- تأخذ 10 ميليلتر من الحل لعد عدد الخلايا الإجمالية، ولوحة حوالي 2 × 106 خلايا، ثم مع 10 مل من ز-المتوسطة إلى طبق ثقافة خلية 100 ملم.
ملاحظة: الخطوة precoating غير ضروري للأسلوب الجديد، ولا إزالة طبقة الجلد مطلوب أما. - بعد 3 د، يستعاض عن المتوسطة التطعيم منخفضة الكالسيوم المتوسطة الإدارة المستدامة للغابات. تغيير الثقافة المتوسطة كل 2 (د).
ملاحظة: التحقق من التصاق الخلايا قبل وبعد تغيير المتوسطة. - مرور الخلايا عندما تصل إلى حوالي 80% التقاء.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، بريتريت الخلايا مع التربسين 0.05% لمدة 2 دقيقة وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لإزالة تلوث خلايا الجلد قبل تريبسينيزينج خلايا البشرة.
4-خلية باساجينج
- إزالة المتوسطة وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وثم إضافة 2 مل التربسين 0.05% (لكل طبق 100 ملم).
- احتضان الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية، مع 5% CO2) لمدة 5 دقائق.
- فحص الخلايا باستخدام مجهر للتأكد من أن كافة الخلايا وقد فصل من طبق الثقافة.
- إضافة 8 مل دميم مع 10% FBS تحييد رد فعل الانزيمية، ومن ثم، جمع الخلايا في أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق للحصول على خلية بيليه.
- إزالة المادة طافية ببطء، ثم، ريسوسبيند بيليه الخلية مع 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات المتوسطة وحساب عدد الخلايا.
- بلايت 1 × 106 خلايا مع 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات في كل طبق خلية 100 ملم.
- تغيير المتوسطة كل 2 (د).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد في الشكل 1التخطيطية للأسلوب الجديد (الشكل 1A) والطريقة التقليدية (الشكل 1B). هو الأسلوب التقليدي خطوتين هضم، الأمر الذي يتطلب إجراء 2 يوم. على النقيض من ذلك، هو أسلوب جديد هضم خطوة واحدة، والتي تستغرق حوالي 3 ساعات لأداء. الأهم من ذلك، يمكن الحصول على الأسلوب الجديد خطوة واحدة السكان اثنين (خلايا البشرة والجلد) في نفس الوقت، الذي يعتمد على وجود Y-27632 في الأجلين المتوسط والتطعيم. وعلاوة على ذلك، الثقافة الأولى الوقت لخلايا البشرة لتصل إلى حوالي 80% التقاء عادة ما يأخذ على الأقل 3 أيام أقل من الطريقة التقليدية إذا تم تلقيح نفس العدد من الخلايا بعد عزلة.
الأسلوب الجديد غلة خلايا البشرة أكثر الأولية، التي تنمو في مورفولوجيا مستعمرة. هككس المعزولة من جلد الإنسان تم تلقيح الأنسجة مع ز والمتوسطة التي تحتوي على Y-27632. نفس العدد من الخلايا كانت مطلية باتباع الأسلوب التقليدي كعنصر التحكم. صور الممثل من خلايا البشرة في أيام 3 و 5 بعد التطعيم الأولية مبينة في الشكل 2 ألف. الخلايا التي تم الحصول عليها من الأسلوب جديدة تميل لتنمو مورفولوجيا مستعمرة. منحنى النمو بعد أن قيمت التطعيم باستخدام خلية العد كيت-8 (CCK-8) عند نقاط زمنية مختلفة بعد التلقيح (الشكل 2)، ومضاعفة الوقت هو حوالي 3-4 أيام للخلايا التي أعدت بطريقة جديدة ولكن حوالي 6-8 أيام الأسلوب التقليدي. في يوم 7، حسبت غلة الخلايا. يتم إظهار النتائج في الشكل 2، مما يدل على أن الأسلوب الجديد أسفرت عن خلايا أكثر ثلاث مرات من الطريقة التقليدية، وأن الوقت اللازم للتوصل إلى التقاء بعد التطعيم الأولى كان على الأقل 3 أيام أقل (الشكل 2D). في يوم 7، خلايا البشرة التوصل إلى التقاء مع الأسلوب الجديد، ولكن ليس بالطريقة التقليدية (الشكل 2D).
الأسلوب الجديد تعزيز التعبير عن α6-إنتغرين بالخلايا الأولية. لقد ثبت إنتغرين α6 الغاية يعبر عنه بالبشرة من الخلايا الجذعية البالغة15. الخلايا المعزولة بالأسلوب الجديد الحفاظ على خصائص الخلايا القاعدية في الجلد بعد عدة مقاطع. نمو مستعمرة واحدة من خصائص البشرة الخلايا الجذعية المشتقة من الطبقة القاعدية للجلد، وعلى مستوى عال من التعبير α6-إنتغرين سمة أخرى لهذه الخلايا الجذعية البشرة. لقد وجدنا أن إضافة Y-27632 زيادة كبيرة في التعبير عن α6-إنتغرين في خلايا البشرة في مرور 3 (الشكل 3 أ-ب)، وفي مرور 3، تظهر البشرة الخلايا المعزولة باستخدام الأسلوب الجديد أي تلوث بخلايا الجلد 13-من المهم جداً للحفاظ على ميزات الخلايا القاعدية بعد عدة مقاطع من خلال التوسع في المختبر . تم إجراء تحليل الفلورة (إذا كان) من الكيراتين علامة الخلية القاعدية 5 و لوريكرين علامة التمايز المحطة الطرفية16 مع تلك الخلايا بعد الممرات الثلاثة. لقد وجدنا أن 90% من كافة الخلايا K5-إيجابية ولكن أقل من 10% منهم أعرب عن لوريكرين (الشكل 3 - 3D). تشير هذه النتائج إلى أن هككس الابتدائي معزول باستخدام أسلوب جديد تحتوي على نسبة سكان خلايا الجذعية البشرة ويمكن الحفاظ على الخصائص المميزة للخلايا القاعدية. ولكن يعد أن هككس هي باساجيد، أكثر أنها تبدأ في التفريق. بأسلوب جديد، وجدنا أن خلايا البشرة المستزرعة في المختبر يمكن أن تحافظ على قدرتها على الانتشار حتى مرور 8. وأخيراً، نحن اختبار نقاء البشرة الخلايا المعزولة باستخدام الأسلوب الجديد، حيث تم تلقيح خليط خلايا البشرة والجلد بعد عزلة. مع علاج بوقت قصير (2-3 دقيقة) مع التربسين لإزالة بعض الخلايا الجلدية تلويث الثقافة الأولية، تم الحصول على عدد سكان نسبيا نقية من خلايا البشرة بعد مرور واحد (الشكل 4).
الشكل 1 : مقارنة بين إجراءات العزل التقليدية والجديدة- (أ) هذا الفريق يظهر تمثيل تخطيطي أسلوب العزلة الجديدة. في اليوم الأول، يتم تلقيح خلايا الجلد منفصلان في ز-المتوسطة مع أو بدون Y-27632. حضور Y-27632 لمدة يومين، توسيع خلايا البشرة بشكل انتقائي. حول يوم 6، تصل إلى الخلايا بكثافة كافية باساجينج. (ب) هذا الفريق يظهر تمثيل تخطيطي لأسلوب العزلة التقليدية. يفصل البشرة عن الأدمة ويتم عزل خلايا البشرة في اليوم 2، وعادة ما تصل الخلايا بكثافة كافية باساجينج في حوالي 10 أيام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : أسلوب العزل الجديد يزيد عائد خلايا البشرة الأساسية- (أ) هذا الممثل يظهر في لوحة الصور لخلايا البشرة أعدتها الأسلوب الجديد (الصف العلوي) والطريقة التقليدية (الصف السفلي) في أيام 3 و 5 بعد التطعيم الأولى. أشرطة مقياس = 200 ميكرومتر. (ب) "الابتدائية هككس" أعدها الجديدة والتقليدية وجمعت الطرق في النقاط الزمنية المشار إليها للتحليل خلايا قابلة للتطبيق باستخدام خلية العد كيت-8 (CCK-8). (ج) العدد الإجمالي للخلايا إعداده بأسلوب جديد واحصى بالأسلوب التقليدي في اليوم السابع بعد التلقيح. (د) متوسط الوقت للتوصل إلى التقاء خلايا البشرة الأولية (مرور 0) يرد لعزل الأسلوب الجديد والأسلوب التقليدي. للوحات ب - د: الطالب t-تم استخدام الاختبار؛ أشرطة الخطأ إظهار التباين القياسية؛ n = 4؛ ف < 0.01، * p < 0.05 عند مقارنة أسلوب جديد بالطريقة التقليدية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : خلايا البشرة الأولية التي تم الحصول عليها بطريقة جديدة قادرة على الحفاظ على ميزات الخلية القاعدية خلال في المختبر التوسع. (أ) يظهر هذا الفريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية للتعبير α6-إنتغرين من خلايا البشرة في مرور 3 تعامل مع Y-27632 (Y-27632، الأحمر) أو دون Y-27632 (التحكم، رمادي) ل h. 48 (ب) يظهر هذا الفريق بتحليل الكمي للخلايا مع ارتفاع مستويات التعبير من α6-إنتغرين من الفريق ألف؛ يتم تعريف التعبير إنتغرين α6 عالية كإشارة > 103، * * ف < 0.01. (ج) يظهر هذا الفريق الصور التمثيلية لتلطيخ الفلورة K5 (أحمر) ولوريكرين (أحمر)؛ واستخدمت لوصمة عار نوى DAPI (أزرق). أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر-(د) هذا الفريق تعرض تحليل الكمي للخلايا إيجابية K5 ولوريكرين. أحصى ما مجموعة 400 الخلايا التحديد الكمي لكل مجموعة، ويتم عرض أرقام متوسط الخلايا إيجابية K5 ولوريكرين. وتكررت هذه التجربة بشكل مستقل 4 مرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : بعد مرور الأولية، تم الحصول على خلايا البشرة نقية نسبيا باستخدام أسلوب جديد. (أ) هذا الفريق يظهر صور الممثلة الفلورة تلطيخ من فيمنتين (أحمر) لخلايا البشرة في الممرات 0 (P0) و 3 (ف-3)؛ واستخدمت لوصمة عار نوى DAPI (أزرق). أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر. (ب) هذا الفريق تعرض تحليل الكمي للخلايا فيمنتين-الإيجابية في الممرات 0 (P0) و 1 (P1). أحصى ما مجموعة 400 الخلايا التحديد الكمي لكل مجموعة، ويبين متوسط عدد الخلايا فيمنتين-إيجابية. وتكررت هذه التجربة بشكل مستقل 4 مرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هككس الابتدائي مثقف قد استخدمت على نطاق واسع لعلاج الجروح في مستوصفات لأكثر من ثلاثة عقود، ومنذ ذلك الوقت، أنها كانت دائماً أهمية كفاءة الحصول على إعداد كافية من الخلايا للتطبيقات السريرية في الوقت مناسب. ولذلك، في الممارسة العملية، طريقة العزل التقليدية، الأمر الذي يتطلب انفصال البشرة عن الأدمة، يجعل من الصعب تلبية هذه المطالب، بسبب منخفضة الغلة من الخلايا وقدرة منخفضة على مرور الخلايا الكبار. هنا، يمكننا وصف طريقة بسيطة جديدة قمنا بتطوير كفاءة الحصول على هككس من أنسجة البالغين استناداً إلى التقارير السابقة13،14، الذي أكثر ملاءمة للمختبرات والتطبيقات السريرية.
يجب إيلاء الاهتمام للخطوات الحاسمة التالية لتحقيق أفضل النتائج للأسلوب الجديد. أولاً، إجراء التجانس خطوة حاسمة؛ تجانس غير كافية سوف تؤثر بوضوح على كفاءة الهضم الأنزيمي ويؤدي انخفاض عائد من خلايا معزولة. ثانيا، لا ينبغي أن تتمثل الخطوة الهضم التربسين أكثر من 30 دقيقة؛ خلاف ذلك، سيتم تقليل صلاحية الخلايا منفصلان. ثالثا، كفاءة جمع الخلايا منفصلان، يجب أن يكون حجم المسام من مصفاة الخلية المستخدمة لتنقية 100 ميكرومتر، وينبغي استخدام مصفاة واحدة لتصفية أي أكثر من 20 مل الحل خلية. رابعا، كثافة الطلاء الأولى عاملاً هاما للتقليل من التلوث مع خلايا الجلد، نظراً لكثافة عالية خلية سيقلص المثبطة تأثير Y-27632 على خلايا الجلد. ولذلك، من الأهمية بمكان دقة حساب العدد الإجمالي لخلايا معزولة في نهاية الإجراء عزلة قبل الطلاء.
أولاً، أسلوب جديد يبسط إجراءات العزل: الإجراء المكون من مرحلتين العزلة التقليدية عادة ما يستغرق يومين لإجراء، والإجراء التشذيب ضروري تماما لإزالة الأنسجة الدهنية من الجلد، وخاصة بالنسبة للكبار الأنسجة ( الشكل 1)؛ وبخلاف ذلك، يكون هناك فصل غير فعالة للبشرة من الأدمة بعد الهضم بين عشية وضحاها مع ديسباسي. بالاستفادة من Y-27632، الذي يحول دون نمو خلايا الجلد بعد التطعيم13، لا يحتاج إلى أسلوب جديد لفصل البشرة عن الأدمة، وذلك الإجراء التشذيب لإزالة الأنسجة الدهنية ليس ضروريا للجديد الأسلوب الذي يحتاج فقط إلى نصف يوم لإجراء. ثانيا، الأسلوب الجديد أيضا يبسط الإجراءات الثقافة منذ ذلك الحين، بالطريقة التقليدية، تستزرع خلايا منفصلان عادة على طبقة وحدة تغذية الخلايا الليفية الماوس المشع في المتوسط تحتوي على 10% FBS أو في صحن بريكواتيد الكولاجين. المكونات المشتقة من الحيوان هي دائماً عوامل الخطر التي ينبغي تجنبها للتطبيقات السريرية. قمنا بتطوير وسيلة خالية من مصل تطعيم مكيفة (ز-المتوسطة)، التي لا تتطلب خطوة بريكواتينج لثقافة الأطباق وأيضا يعزز غلة الكيراتينيه الابتدائية13 سبب جنبا إلى جنب مع Y-27632 ز والمتوسطة يعزز المرفق من خلايا البشرة للثقافة صحن13،،من1718. ولذلك، أسلوب جديد يسهل عملية الثقافة وهو أيضا إجراء آمنة نسبيا للتطبيقات السريرية دون إضافة المكونات المشتقة من الحيوانات. ثالثا، أسلوب جديد يحسن عائد خلايا البشرة الأولية وتقصير الوقت الثقافة الأولية اللازمة للوصول إلى التقاء. بالمقارنة مع الطريقة التقليدية، عائد الخلايا المنتجة بواسطة الأسلوب الجديد أعلى بحوالي 3 مرات، ومرور خلايا البشرة الأولى التوصل إلى التقاء على الأقل 3 أيام في وقت سابق (الشكل 2). وأخيراً، يمكن أن تستخدم أسلوب جديد لعزل خلايا البشرة من جميع أنواع العينات الجلد، مثل فروة شعر الجلد والأنسجة الجلد الكبار مع طبقة سميكة من الدهون، التي تم اختبارها في تقرير سابق13.
هككس الأولية ذات الإمكانات العالية استخدمت على نطاق واسع لمختبر البحوث والتطبيقات السريرية. هذا الأسلوب الجديد يعزز إمكانات الخلايا المستزرعة مع خصائص الخلايا الجذعية البشرة13. Y-27632 يعزز التعبير إنتغرين α6 هككس، وبعد ثلاثة مقاطع، أن أكثر من 90% خلايا البشرة مثقف وأعرب عن الكيراتين علامة الخلية القاعدية 5 وأقل من 10% الخلايا وأعرب علامة تمييز لوريكرين، مما يدل على أن تبقى هذه الخلايا خصائص خلايا الجلد القاعدية بعد عدة مقاطع. ويمكن إعادة تشكيل خلايا البشرة توسيع ثقافة الجلد في فيفو بعد تطعيم13، مما يوحي بأن لديهم إمكانية التجديد بعد التوسع في الثقافة. جدير بالذكر أن الأسلوب الجديد مثالي لعزل خلايا من أنسجة البالغين، كما هو مذكور أعلاه. ولذلك، خلايا البشرة أعد بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في المختبر و في فيفو نماذج لدراسة الأمراض الجلدية ويمكن تطويرها إلى منتجات ذاتي يستند إلى الخلية للتطبيقات السريرية مثل علاج الجروح الجلدية.
وباختصار، يوفر البروتوكول الجديد إجراءات مبسطة وفعالة لعزل وتوسيع نطاق خلايا البشرة الأولية من أنسجة الجلد الكبار. هذا الأسلوب المتقدم أكثر ملاءمة لإنتاج إعداد كبيرة من خلايا البشرة ذات الإمكانات العالية للمختبرات والتطبيقات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيده هذا العمل الوطني للبحوث الرئيسية وتطوير برنامج للصين (2017YFA0104604)، البرنامج العام "مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية" (تشرف، 81772093)، العلم والتكنولوجيا تنمية البرنامج سوتشو (ZXL2015128)، مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة جيانغسو (BK20161241)، وهي جائزة الباحث شاندونغ تايشان (tshw201502065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C.
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E.
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
