Summary
Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.
Abstract
Keratinocytes umani primari isolato dai tessuti di pelle fresca e loro espansione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per ricerche di laboratorio e per applicazioni cliniche. Il metodo di isolamento convenzionale di cheratinociti umani comporta una procedura di digestione enzimatica sequenziale in due fasi, che ha dimostrata di essere inefficiente nel generare cellule primarie da tessuti adulti a causa del tasso di recupero cellulare basso e riduttrice delle cellule vitalità. Recentemente abbiamo segnalato un metodo avanzato per isolare le cellule progenitrici epidermica primaria umana dai tessuti della pelle che utilizza l'inibitore della chinasi Rho Y-27632 nel mezzo. Confrontato con il protocollo tradizionale, questo nuovo metodo è più semplice, più facile e meno dispendio di tempo e aumenta il rendimento delle cellule staminali epiteliali e migliora le caratteristiche di cellule staminali. Inoltre, la nuova metodologia non richiede la separazione dell'epidermide dal derma e, di conseguenza, è adatta per isolare le cellule da diversi tipi di tessuti dell'adulto. Questo nuovo metodo di isolamento supera le carenze principali dei metodi convenzionali ed è più adatto a produrre un numero elevato di cellule epidermiche con elevata potenza per laboratorio e per applicazioni cliniche. Qui, descriviamo il nuovo metodo in dettaglio.
Introduction
L'obiettivo era quello di sviluppare un protocollo semplice ed efficace per isolare i keratinocytes umani primari (HKCs) da tessuti adulti, soprattutto per applicazioni cliniche. Cellule staminali epidermiche cutanee, localizzate nello strato basale della pelle, possiedono un alto potenziale di proliferare e differenziare e fornire cheratinociti per mantenere le funzioni della pelle1,2,3, 4. HKCs isolato dalla pelle tessuti sono ampiamente utilizzati per pelle tessuto ingegneria e rigenerazione scopi, soprattutto nella riparazione della pelle danneggiata e nella terapia genica per applicazioni cliniche5,6. La questione chiave per le applicazioni basate su HKC è efficacemente isolare ed espandere i grandi numeri di HKCs con alto potenziale in vitro7,8. Anche se vari gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per produrre colture di staminali-simili HKCs, questi metodi sono a volte lungo e complicato per eseguire ed avere altre limitazioni, come cella bassa resa ed essere limitato dal tipo di esemplare della pelle usato9. Per esempio, il metodo tradizionale per isolare HKCs dai tessuti della pelle comporta una digestione enzimatica in due fasi con una separazione dell'epidermide dal derma6. Tale metodo di solito funziona bene per tessuti neonatale, ma diventa molto difficile quando utilizzato per isolare le cellule da tessuti adulti.
Y-27632, un inibitore della chinasi di proteina Rho-collegata (ROCK), è stato segnalato per migliorare significativamente l'efficienza della cellula staminale epidermica isolamento e Colonia crescita10,11,12. In uno studio precedente, abbiamo scoperto che Y-27632 facilita la crescita clonale delle cellule epidermiche, ma riduce il rendimento delle cellule dermiche differenzialmente controllando l'espressione di molecole di adesione13. Inoltre abbiamo stabilito un nuovo medium condizionato di inoculazione, chiamato G-medio, che sostiene la crescita e la resa delle cellule epidermiche primarie. Dalla combinazione di G-medio con Y-27632, questo metodo novello può separare spontaneamente le cellule epidermiche e cutanee dopo digestione degli enzimi, eliminando in tal modo il passaggio di epidermide-derma separazione13,14. Basato su rapporti precedenti, ora descriviamo la procedura dettagliata di questo nuovo metodo per isolare HKCs dal tessuto pelle adulta.
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Protocol
Tessuti umani utilizzati in questo protocollo sono state gestite secondo le direttive del Comitato di etica di ricerca umana dell'istituzione (NO.2015120401, Data: 12 maggio 2015).
1. preparati
- Tessuti di pelle addominale adulto fresca raccogliere scartati dalla chirurgia plastica presso l'ospedale in un tubo da 50 mL con 10 mL di Dulbecco ghiacciata s modified medium di Eagle (DMEM). I campioni possono essere conservati a 4 ° C fino a 72 ore senza alterare significativamente l'attuabilità delle cellule.
- Preparare i reagenti e il terreno di coltura come descritto di seguito.
- Aggiungere 1 mL di penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 mg/L) a 50 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) per preparare la soluzione di lavaggio.
- Preparare due serie di soluzioni di digestione degli enzimi: (1) preparare 50 mL di dispase (2,5 mg/mL in DMEM) e 50 mL di tipo I collagenasi (2,5 mg/mL in DMEM) separatamente per il metodo convenzionale; e (2) preparare 50 mL di una miscela di dispase e collagenasi di tipo I (sciogliere 125 mg di polvere di dispase e 125 mg di tipo polvere di collagenasi in 50 mL di DMEM) per il nuovo metodo.
Nota: Tutte le soluzioni di enzima dovrebbero essere filtrate con un filtro da 0,22 µm e mantenute at4 ° C. - Preparare le soluzioni di digestione per entrambi i metodi: 0.05% tripsina e 0,25% tripsina commercialmente sono stati acquistati. Preparare un 10mg/mL dnasi ho soluzione sciogliendo 50 mg di dnasi io polvere in 5 mL di PBS, filtrare con un colino da 0,22 µm e conservare a-20 ° C.
- Preparare 500 mL di medium per neutralizzare la digestione enzimatica: medium DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina.
- Preparare 500 mL di terreno di inoculazione (fattore di crescita-contenenti medio, chiamato G-medio): DMEM/F12 (3:1) mezzo contenente 1% di penicillina/streptomicina, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL fattore di crescita fibroblastico 2 (FGF2), 20 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), e Supplemento del 2% B27.
- Pretrattare coltura cellulare di 100 mm a piatti con 2 mL di una matrice di rivestimento contenente tipo I collagene per 30 min a temperatura ambiente.
2. convenzionale metodo
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Pretrattamento del tessuto della pelle
- Prendere 1,5 cm2 del tessuto della pelle e lavarlo 1 x 10 ml di PBS; quindi, risciacquare con 10 mL di etanolo al 70% per 30 s e incubare 2 x 10 ml di soluzione di lavaggio (PBS contenente il 2%, penicillina e streptomicina), 5 minuti ciascuno.
Nota: Tutti i lavaggi vengono eseguiti in piastre di coltura cellulare di 100 mm all'interno di una cappa a flusso laminare. - Tagliare il tessuto con forbici sterili per rimuovere lo strato di grasso sottocutaneo in una piastra di coltura cellulare di 100 mm e, quindi, pesare il tessuto della pelle (il peso è di 1 g in questo protocollo).
Nota: Taglio sufficiente è molto cruciale per la separazione efficiente dell'epidermide dal derma. Lo strato di grasso giallastro può essere facilmente distinto visivamente. - Trasferire il tessuto ad un altro piatto sterile 100 mm con il lato di derma verso il basso e, quindi, tagliate il tessuto della pelle a strisce di 3-4-mm-wide usando un bisturi.
Nota: Il lato di derma con lo strato di grasso è facilmente riconoscibile visivamente. - Aggiungere 10 mL di soluzione di dispase 2,5 mg/mL per i tessuti cutanei in una piastra di coltura di 100 mm e, quindi, incubare il piatto durante la notte a 4 ° C (non più di 20 h).
Nota: La quantità di soluzione dispase può essere calcolata utilizzando 10 mL di soluzione di dispase per la digestione di ogni grammo di tessuto.
- Prendere 1,5 cm2 del tessuto della pelle e lavarlo 1 x 10 ml di PBS; quindi, risciacquare con 10 mL di etanolo al 70% per 30 s e incubare 2 x 10 ml di soluzione di lavaggio (PBS contenente il 2%, penicillina e streptomicina), 5 minuti ciascuno.
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Separazione dell'epidermide dal tessuto della pelle
- Il secondo giorno, staccare l'epidermide dal derma con pinzette bene.
Nota: Se è difficile da staccare l'epidermide, la digestione dispase non era sufficiente, che di solito è a causa di insufficiente rifilatura del tessuto. In questo caso, il tessuto ha bisogno di un tempo di incubazione più lungo. - Tritare l'epidermide pelato con 500 µ l di terreno di coltura cellulare in un impasto di tessuto usando lame di bisturi; Risospendere le con 10 mL di tripsina 0,25% in una provetta da 50 mL, quindi Incubare 20 min in un bagno di acqua a 37 ° C, con agitazione.
- Il secondo giorno, staccare l'epidermide dal derma con pinzette bene.
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Raccolta e messa in coltura di cellule primarie
- Neutralizzare l'attività della tripsina aggiungendo un uguale volume di soluzione di neutralizzazione (10 mL in questo protocollo).
- Dissociare le cellule epidermiche pipettando la soluzione su e giù per 20 volte con una pipetta sierologica di 10 mL e filtrare la soluzione delle cellule attraverso un colino di cella da 100 µm per rimuovere eventuali residui di tessuto residuo.
- Centrifugare la soluzione di cella a 200 x g per 5 min dopo filtrazione; Risospendere il pellet cellulare in mezzo di neutralizzazione per il lavaggio e, quindi, centrifugare nuovamente, a 200 x g per ottenere il pellet cellulare.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno del keratinocyte basso calcio, privo di siero (SFM). Prendere 10 µ l di questa soluzione per contare il numero totale delle cellule e, quindi, piastra circa 2 x 106 cellule con 10 mL di SFM in piastre di coltura delle cellule 100mm pretrattati con matrice di rivestimento (contenenti collagene di tipo I).
Nota: Il rivestimento è un passo necessario per il metodo convenzionale. - Cambiare il terreno di coltura ogni d 2.
Nota: Controllare l'adesione delle cellule al microscopio prima e dopo la modifica il terreno di coltura. - Le cellule del passaggio quando raggiungono circa l'80% confluenza.
Nota: Tutti i piatti di cultura sono pretrattati con la matrice di rivestimento.
3. il nuovo metodo
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Pretrattamento del tessuto della pelle
- Raccogliere il tessuto come descritto sopra (punto 2.1) per il metodo convenzionale.
- Lavare il tessuto della pelle 1 x 10 ml di PBS e, quindi, pesano in un contenitore di plastica sterile di una bilancia elettronica (il peso è circa 1 g in questo protocollo).
Nota: Il peso minimo del tessuto necessario per questo protocollo è 0,1 g, dal momento che è difficile ottenere un numero sufficiente di cellule se il campione di tessuto utilizzato è troppo piccolo. Non c'è nessun peso massimo del tessuto per questo protocollo, che in definitiva dipende la capacità di gestione dell'operatore. - Utilizzare pinze per sciacquare il tessuto cutaneo con 10 mL di etanolo al 70% per 30 s.
- Incubare il tessuto 2 x 10 ml di soluzione di lavaggio (preparata al punto 2.1.1), per 5 minuti ogni volta.
Nota: Tutti i passaggi di lavaggio indicati in precedenza vengono eseguiti in piastre di coltura cellulare di 100 mm all'interno di una cappa a flusso laminare (un cappuccio di coltura del tessuto). - Trasferire il tessuto piatto sterile cultura di un'altra cella di 100 mm.
- Utilizzando lame di bisturi, tritare il tessuto accuratamente in un impasto di tessuto.
- Aggiungere 200 µ l di PBS ogni 5 min per mantenere i tessuti bagnati.
Nota: Prendere circa 15 min per la procedura 3.1.5 - 3.1.7. Tutti i passaggi precedenti vengono eseguiti a temperatura ambiente.
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Digestione del tessuto cutaneo
- Trasferire la soluzione di tessuto omogeneizzato in una provetta da 50 mL. Aggiungere 10 mL di miscela di enzimi per ogni 1 g di tessuto cutaneo. Mescolare accuratamente gli enzimi con i tessuti omogeneizzati.
- Incubare la miscela con l'agitazione in un bagno di acqua a 37 ° C per 1 h.
- Aggiungere un volume di 1/5 di 0,25% tripsina (2,5 mL in questo protocollo) per la miscela di digestione per altri 30 min in un bagno di acqua a 37 ° C.
- Aggiungere dnasi I soluzione per la miscela di enzimi ad un rapporto di 1: 100 (v/v) (250 µ l in questo protocollo) e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
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Raccolta e messa in coltura di cellule primarie
- Interrompere il processo di digestione con l'aggiunta di 12,5 mL di terreno di neutralizzazione in un rapporto 1:1. Dispensare la soluzione su e giù per circa 20 x, utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL per dissociare le cellule.
- Filtrare le cellule dissociate attraverso un colino di cella da 100 µm per rimuovere i residui di tessuto. Centrifugare il supernatante a 200 x g per 5 min, osservare la pallina nella parte inferiore del tubo.
- Scartare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 10 mL di mezzo di neutralizzazione e centrifugare nuovamente a 200 x g per 5 min raccogliere le cellule.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di inoculazione (G-medio dal punto 1.2.5) con 10 µM di Y-27632.
- Prendere 10 µ l della soluzione per contare il numero totale delle cellule e, quindi, piastra circa 2 x 106 cellule con 10 mL di G-medio in una piastra di coltura cellulare di 100 mm.
Nota: Il passaggio gasose non è necessario per il nuovo metodo, e rimozione dello strato dermico non è richiesto. - Dopo 3 d, sostituire il mezzo di inoculazione con il mezzo di SFM basso-calcio. Cambiare il terreno di coltura ogni d 2.
Nota: Controllare l'adesione delle cellule prima e dopo aver cambiato il mezzo. - Le cellule del passaggio quando raggiungono circa l'80% confluenza.
Nota: Se necessario, pretrattare le cellule con tripsina 0.05% per 2 min e lavare le cellule con PBS per rimuovere contaminanti cellule dermiche prima trypsinizing delle cellule epidermiche.
4. cellule di passaggio
- Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS e, quindi, aggiungere 2 mL di tripsina 0,05% (per ogni piatto di 100 mm).
- Incubare le cellule in un incubatore (37 ° C con 5% CO2) per 5 min.
- Controllare le celle utilizzando un microscopio per assicurarsi che tutte le cellule hanno staccato dalla piastra di coltura.
- Aggiungere 8 mL di DMEM con 10% FBS per neutralizzare la reazione enzimatica e, quindi, raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare a 200 x g per 5 min ottenere il pellet cellulare.
- Rimuovere il surnatante lentamente e, quindi, risospendere il pellet cellulare con 10 mL di terreno SFM e contare il numero di cellule.
- Piastra di 1 x 106 cellule con 10 mL di SFM in ogni piatto di cella di 100 mm.
- Modificare il mezzo ogni d 2.
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Representative Results
Diagrammi schematici del nuovo metodo (Figura 1A) e il metodo convenzionale (Figura 1B) sono presentati nella Figura 1. Il metodo convenzionale è una digestione in due fasi, che richiede una procedura di 2 giorni. Al contrario, il nuovo metodo è una digestione di One-Step, che dura circa 3 ore per eseguire. Cosa importante, il nuovo metodo di One-Step può ottenere due popolazioni (cellule epidermiche e cutanee) allo stesso tempo, che dipende dalla presenza di Y-27632 nel mezzo di inoculazione. Inoltre, l'iniziale precocità delle cellule epidermiche di raggiungere circa 80% confluenza richiede solitamente almeno 3 giorni di meno rispetto al metodo convenzionale, se lo stesso numero di cellule è inoculato dopo l'isolamento.
Il nuovo metodo produce più primarie cellule epidermiche, che crescono in una morfologia di Colonia. Il HKCs isolato dalla pelle umana tessuti sono stati inoculati con G-medio contenente Y-27632. Lo stesso numero di cellule sono stato placcato seguendo il metodo convenzionale del controllo. Immagini rappresentative delle cellule epidermiche ai giorni 3 e 5 dopo l'inoculazione iniziale sono mostrati nella Figura 2A. Le cellule ottenute dal nuovo metodo tendevano a crescere come una morfologia di Colonia. La curva di crescita dopo l'inoculazione è stata valutata utilizzando una cella contando kit-8 (CCK-8) in diversi momenti dopo l'inoculazione (Figura 2B), e il tempo di raddoppiamento è circa 3-4 giorni per le cellule preparate con il metodo nuovo ma è circa 6-8 giorni per la Metodo convenzionale. Al giorno 7, sono stati calcolati i rendimenti delle celle. I risultati sono mostrati in Figura 2, che mostra che il nuovo metodo ha prodotto tre volte più cellule rispetto il metodo convenzionale e che il tempo necessario a raggiungere la confluenza dopo l'inoculazione iniziale era almeno 3 giorni meno (Figura 2D). Al giorno 7, cellule epidermiche raggiunse la confluenza con il nuovo metodo, ma non con il metodo convenzionale (Figura 2D).
Il nuovo metodo ha migliorato l'espressione dell'integrina α6 dalle cellule primarie. Α6-integrina è stato indicato per essere altamente espressi da cellule staminali epidermiche15. Le cellule isolate dal nuovo metodo ha mantenuto le caratteristiche delle cellule basali della pelle dopo vari passaggi. Sviluppo della Colonia è una delle caratteristiche delle cellule staminali epidermiche derivate dallo strato basale della pelle, e un alto livello di espressione di α6-integrina è un'altra caratteristica di queste cellule staminali epidermiche. Abbiamo trovato che l'aggiunta di Y-27632 ha aumentato significativamente l'espressione dell'integrina α6 in cellule epidermiche al passaggio 3 (Figura 3A-B) e al passaggio 3, cellule epidermiche isolate utilizzando il nuovo metodo non mostrano nessuna contaminazione da cellule dermiche 13. è molto importante mantenere le caratteristiche delle cellule basali dopo vari passaggi durante l'espansione in vitro . Analisi di immunofluorescenza (IF) di cheratina marcatore delle cellule basali 5 e la differenziazione terminale segnapunti loricrina16 è stata eseguita con quelle cellule dopo tre passaggi. Abbiamo trovato che il 90% di tutte le cellule erano K5-positivi ma meno del 10% di loro espresso loricrina (Figura 3 - 3D). Questi risultati indicano che HKCs primario isolato utilizzando il nuovo metodo contengono una popolazione delle cellule staminali epidermiche e può mantenere i tratti caratteristici delle cellule basali. Ma il più che HKCs sono attraversate, più essi cominciano a differenziarsi. Con il nuovo metodo, abbiamo trovato che le cellule epidermiche coltivate in vitro potrebbe manterranno la loro capacità di proliferazione fino al passaggio 8. Infine, abbiamo testato la purezza delle cellule epidermiche isolati utilizzando il nuovo metodo, poiché una miscela delle cellule epidermiche e cutanee è stata inoculata proprio dopo l'isolamento. Con un trattamento di breve durata (2-3 min) con tripsina per rimuovere alcune cellule dermiche, contaminando la coltura, una popolazione relativamente pura delle cellule epidermiche è stata ottenuta dopo un passaggio (Figura 4).
Figura 1 : Confronto tra le procedure di isolamento di nuove e convenzionali. (A), questo pannello mostra una rappresentazione schematica del nuovo metodo di isolamento. Giorno 1, le cellule della pelle dissociate sono inoculate nel G-medio con o senza Y-27632. In presenza di Y-27632 per 2 giorni, le cellule epidermiche espandere in modo selettivo. A intorno giorno 6, le cellule raggiungere una densità sufficiente per il passaggio. (B), questo pannello mostra una rappresentazione schematica del metodo isolamento convenzionale. L'epidermide è separata dal derma e le cellule epidermiche sono isolate su 2 ° giorno, e di solito, le cellule di raggiungono una densità sufficiente per passaggio a circa 10 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Il nuovo metodo di isolamento aumenta il rendimento delle cellule epidermiche primarie. (A), questo pannello spettacoli rappresentante immagini delle cellule epidermiche, preparate con il metodo nuovo (riga superiore) e secondo il metodo convenzionale (riga inferiore) ai giorni 3 e 5 dopo l'inoculazione iniziale. Le barre di scala = 200 µm. (B) HKCs primaria preparato da convenzionale e le nuove modalità sono stati raccolti presso i punti di tempo indicato per l'analisi di cellule vitali utilizzando una cella contando kit-8 (CCK-8). (C) il numero totale di cellule preparato con il metodo nuovo e secondo il metodo convenzionale sono stato conteggiato al 7 ° giorno dopo l'inoculazione. (D) il tempo medio per raggiungere la confluenza delle cellule epidermiche primarie (passaggio 0) è indicato per il nuovo metodo di isolamento e il metodo convenzionale. Per pannelli B - D: di Student t-test è stato utilizzato; le barre di errore indicano la variazione standard; n = 4; p < 0.01, * p < 0,05 confrontando il nuovo metodo con il metodo convenzionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Cellule epidermiche primarie ottenute con il metodo nuovo sono in grado di mantenere le caratteristiche delle cellule basali durante in vitro espansione. (A) questo pannello mostra un'analisi di FACS di α6-integrina espressione delle cellule epidermiche al passage 3 trattata con Y-27632 (Y-27632, rosso) o senza Y-27632 (controllo, grigio) per 48 h. (B) questo pannello mostra un'analisi di quantificazione delle cellule con alta livelli di espressione dell'integrina α6 dal pannello A; espressione di alta α6-integrina è definito come un segnale > 103, * * p < 0.01. (C) questo pannello mostra le immagini rappresentative di colorazione di immunofluorescenza di K5 (rosso) e loricrin (rosso); DAPI (blu) è stato utilizzato a macchiare i nuclei. Le barre di scala = 100 µm. (D), questo pannello mostra un'analisi di quantificazione delle cellule positive K5 e loricrina. Un totale di 400 celle sono stati contati per quantificare ogni gruppo, e viene visualizzato il numero medio delle cellule positive K5 e loricrina. L'esperimento fu ripetuto in modo indipendente 4 volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Dopo il passaggio iniziale, le cellule epidermiche relativamente pure sono state ottenute utilizzando il nuovo metodo. (A), questo pannello Mostra immagini rappresentative di immunofluorescenza colorazione di vimentina (rosso) per le cellule epidermiche a passaggi 0 (P0) e 3 (P3); DAPI (blu) è stato utilizzato a macchiare i nuclei. Le barre di scala = 50 µm. (B), questo pannello mostra un'analisi di quantificazione delle cellule vimentin-positive a passaggi 0 (P0) e 1 (P1). Un totale di 400 celle sono stati contati per quantificare ogni gruppo, e viene visualizzato il numero medio di cellule vimentin-positive. L'esperimento fu ripetuto in modo indipendente 4 volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Colta HKCs primario sono stati ampiamente utilizzati per curare le ferite in cliniche per più di tre decenni e, da quel momento, è stato sempre importante ottenere in modo efficiente un numero sufficiente di cellule per applicazioni cliniche in modo tempestivo. Quindi, in pratica, il metodo di isolamento convenzionale, che richiede la separazione dell'epidermide dal derma, rende difficile soddisfare queste esigenze, a causa della bassa resa delle cellule e la bassa capacità di passaggio di cellule adulte. Qui, descriviamo un nuovo metodo semplice che abbiamo sviluppato per ottenere in modo efficiente HKCs da tessuto adulto basato su precedenti rapporti13,14, che è più adatto per laboratorio e per applicazioni cliniche.
Deve prestare attenzione ai seguenti passaggi critici per ottenere i migliori risultati per il nuovo metodo. In primo luogo, la procedura di omogeneizzazione è un passo cruciale; insufficiente omogeneizzazione influenzerà chiaramente l'efficienza della digestione enzimatica e risultato in una bassa resa di cellule dissociate. In secondo luogo, la fase di digestione della tripsina non dovrebbe prendere più di 30 min; in caso contrario, la vitalità delle cellule dissociate diminuirà. In terzo luogo, per raccogliere in modo efficiente le cellule dissociate, la dimensione dei pori del filtro cella utilizzato per la filtrazione deve essere 100 µm, e un singolo filtro deve essere utilizzato per filtrare non più di 20 mL della soluzione di cella. In quarto luogo, la densità della placcatura iniziale è un fattore importante per minimizzare la contaminazione con le cellule cutanee, perché una densità alta cella ridurrà notevolmente l'effetto inibitorio di Y-27632 sulle cellule cutanee. Pertanto, è fondamentale per contare con precisione il numero totale di cellule dissociate alla fine della procedura di isolamento prima di placcatura.
In primo luogo, il nuovo metodo semplifica la procedura di isolamento: la procedura di isolamento convenzionale in due passaggi richiede solitamente 2 giorni per eseguire, e la procedura di taglio è fondamentale per rimuovere completamente il tessuto grasso della pelle, soprattutto per i tessuti dell'adulto ( Figura 1); in caso contrario, ci sarà un'inefficiente separazione dell'epidermide dal derma dopo digestione durante la notte con dispase. Y-27632, che inibisce la crescita delle cellule dermiche dopo inoculazione13, sfruttando il nuovo metodo non è necessario separare l'epidermide dal derma e, di conseguenza, la procedura di rimozione per rimuovere il tessuto adiposo non è necessaria per il nuovo Metodo, che necessita solo di un giorno e mezzo per essere eseguita. In secondo luogo, il nuovo metodo semplifica anche la procedura di cultura poiché, con il metodo tradizionale, le cellule dissociate sono solitamente coltivate su uno strato dell'alimentatore di fibroblasti di topo irradiati in medium che contiene 10% FBS o in un piatto di collagene-sensibilizzati. Componenti di origine animale sono sempre fattori di rischio che dovrebbe essere evitati per applicazioni cliniche. Abbiamo sviluppato un mezzo privo di siero condizionato inoculazione (G-medio), che non richiede un passo gasose per piastre di coltura e migliora anche il rendimento dei keratinocytes primari13 perché G-medio combinato con Y-27632 promuove il collegamento di cellule epidermiche alla cultura piatto13,17,18. Pertanto, il nuovo metodo facilita la procedura di cultura ed è anche una procedura relativamente sicura per applicazioni cliniche senza l'aggiunta di componenti di origine animale. In terzo luogo, il nuovo metodo migliora il rendimento delle cellule epidermiche primarie e accorcia i tempi di coltura iniziale necessario a raggiungere la confluenza. Rispetto al metodo tradizionale, il rendimento delle cellule prodotte con il metodo nuovo è circa 3 volte superiore, e il passaggio iniziale delle cellule epidermiche raggiunto confluenza almeno 3 giorni prima (Figura 2). Infine, il nuovo metodo può essere utilizzato per l'isolamento delle cellule epidermiche da tutti i tipi di campioni di pelle, come cuoio capelluto pelosi pelle e tessuti di pelle adulta con uno spesso strato di grasso, che sono stati testati in un precedente rapporto13.
HKCs primario ad alto potenziale sono stati ampiamente usati per ricerche di laboratorio e per applicazioni cliniche. Questo nuovo metodo migliora il potenziale delle cellule coltivate con caratteristiche di cellule staminali epidermiche13. Y-27632 migliora l'espressione α6-integrina HKCs e dopo tre passaggi, oltre il 90% delle cellule epidermiche coltivate espresse la cheratina di marcatore delle cellule basali 5, e le meno del 10% delle cellule l'indicatore di differenziazione loricrina, indicando che Queste cellule mantengono le caratteristiche delle cellule basali della pelle dopo vari passaggi. Le cellule epidermiche espanse in coltura possono ricostituire pelle in vivo dopo l'innesto13, suggerendo che essi possiedono potenziale rigenerazione dopo l'espansione nella cultura. In particolare, il nuovo metodo è ideale per isolare le cellule da tessuti adulti, come accennato in precedenza. Di conseguenza, le cellule epidermiche preparate da questo metodo possono essere utilizzate per in vitro e in vivo modelli per lo studio di malattie della pelle e può essere sviluppato in prodotti basati su cellule autologhi per applicazioni cliniche quali il trattamento di ferite della pelle.
In sintesi, il nuovo protocollo prevede una procedura semplificata ed efficace per isolare ed espandere cellule epidermiche primarie da tessuti di pelle adulta. Questo avanzato metodo è più adatto per la produzione di un numero elevato di cellule epidermiche ad alto potenziale per laboratorio e per applicazioni cliniche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (2017YFA0104604), il programma generale della Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (NSFC, 81772093), la scienza e la tecnologia di sviluppo programma di Suzhou (ZXL2015128), la Fondazione con scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20161241) e un Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
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