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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57784
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

Summary

Nous présentons ici un protocole pour isoler efficacement les kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte. Cette méthode simplifie la procédure conventionnelle en utilisant le Y-27632 inhibiteur ROCK dans le milieu de l’inoculation pour séparer spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques.

Abstract

Des kératinocytes humains primaires isolés des tissus de la peau fraîche et leur expansion in vitro ont été largement utilisées pour la recherche en laboratoire et pour des applications cliniques. La méthode d’isolation classiques des kératinocytes humains implique une procédure en deux étapes séquentielles de la digestion enzymatique, qui s’est avérée inefficace dans la génération de cellules primaires provenant de tissus adultes en raison du taux de récupération des cellules faibles et cellulaire réduite viabilité. Nous avons récemment rapporté une méthode avancée pour isoler les cellules progénitrices épidermiques primaires humaines provenant de tissus de la peau qui utilise l’inhibiteur de kinase Rho Y-27632 dans le milieu. En comparaison avec le protocole traditionnel, cette nouvelle méthode est plus simple, plus facile et moins chronophage et augmente le rendement des cellules souches épithéliales et améliore leurs caractéristiques de cellules souches. De plus, la nouvelle méthodologie ne nécessite pas la séparation de l’épiderme, du derme et, est donc adaptée pour isoler les cellules de différents types de tissus adultes. Cette nouvelle méthode d’isolement surmonte les principales lacunes des méthodes conventionnelles et est plus adaptée pour produire un grand nombre de cellules épidermiques avec forte puissance pour laboratoire et pour des applications cliniques. Nous décrivons ici la nouvelle méthode en détail.

Introduction

L’objectif était d’élaborer un protocole simple et efficace pour isoler des kératinocytes humains primaires (HKCs) provenant de tissus adultes, en particulier pour des applications cliniques. Les cellules souches épidermiques peau, localisées dans la couche basale de la peau, possèdent un potentiel élevé de proliférer et de différencier et de fournir des kératinocytes pour maintenir les fonctions de la peau1,2,3, 4. HKCs isolées de la peau, les tissus sont employés couramment pour peau tissu ingénierie et régénération, particulièrement dans la réparation de la peau endommagée et en thérapie génique pour des applications cliniques5,6. La question clé pour les applications HKC est d’isoler efficacement et de développer un grand nombre de HKCs avec haut potentiel in vitro7,8. Bien que plusieurs groupes de recherche ont mis au point des méthodes pour produire des cultures de souches-comme HKCs, ces méthodes sont parfois long et compliqué à réaliser et ont d’autres limitations, telles que les cellules faibles rendements et limité par le type d’échantillon de peau utilisé9. Par exemple, la méthode traditionnelle pour isoler HKCs de tissus cutanés implique une digestion enzymatique en deux étapes avec une séparation de l’épiderme, le derme6. Cette méthode fonctionne généralement bien pour tissus néonatales, mais il devient très difficile lorsqu’il est utilisé pour isoler les cellules provenant de tissus adultes.

Y-27632, un inhibiteur de la protéine associée à Rho kinase (ROCK), a été signalé à améliorer considérablement l’efficacité des cellules souches épidermiques isolement et colonie croissance10,11,12. Dans une étude précédente, nous avons découvert que Y-27632 facilite la croissance clonale de cellules épidermiques, mais réduit le rendement des cellules dermiques de façon différentielle contrôlant l’expression des molécules d’adhérence13. Nous avons aussi établi un nouveau milieu conditionné l’inoculation, appelé G-medium, qui soutient la croissance et le rendement des cellules épidermiques primaires. En combinant le milieu G-avec Y-27632, cette nouvelle méthode permet de séparer spontanément des cellules épidermiques et dermiques après digestion enzymatique, éliminant ainsi l’étape de l’épiderme-derme séparation13,14. Se fondant sur les rapports précédents, nous avons maintenant décrire la procédure détaillée de cette nouvelle méthode isoler HKCs du tissu cutané adulte.

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Protocol

Les tissus humains utilisés dans le présent protocole ont été traités conformément aux directives du Comité d’éthique de l’Institution recherche humaine (NO.2015120401, date : 12 mai 2015).

1. les préparatifs

  1. Tissus de la peau d’abdominale adultes frais virés écartés de chirurgie plastique à l’hôpital dans un tube de 50 mL avec 10 mL de Dulbecco glacee modifiée milieu Eagle (DMEM). L’échantillon peut être maintenu à 4 ° C pendant 72 h sans affecter sensiblement la viabilité des cellules.
  2. Préparer les réactifs et le milieu de culture, tel que décrit ci-dessous.
    1. Ajouter 1 mL de pénicilline (100 U/mL) et à la streptomycine (100 mg/L) dans 50 mL de solution tamponnée au phosphate (PBS), afin de préparer la solution de lavage.
    2. Préparer deux ensembles de solutions de digestion enzymatique : (1) préparation de 50 mL d’a (2,5 mg/mL en DMEM) et 50 mL de type I collagénase (2,5 mg/mL en DMEM) séparément pour la méthode conventionnelle ; et (2) préparer 50 mL d’un mélange d’a et de collagénase de type I (dissoudre 125 mg de poudre d’a et 125 mg de type I poudre de collagénase dans 50 mL de DMEM) pour la nouvelle méthode.
      Remarque : Toutes les solutions enzymatiques doivent être filtrées avec un filtre de 0,22 µm et conservées à 4 ° C.
    3. Préparer des solutions de digestion pour les deux méthodes : la trypsine 0.05 % et 0,25 % de trypsine ont été achetées dans le commerce. Préparer une DNase 10 mg/mL j’ai solution en dissolvant 50 mg de DNase I poudre dans 5 mL de PBS, filtrez-le avec un filtre de 0,22 µm et conserver à-20 ° C.
    4. Préparer 500 mL de milieu pour neutraliser la digestion enzymatique : milieu DMEM avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine.
    5. Préparer 500 mL de milieu de l’inoculation (moyen contenant du facteur de croissance, appelée G-milieu) : DMEM/F12 (3:1) medium contenant 1 % pénicilline/streptomycine, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2), 20 facteur de croissance épidermique (EGF), ng/mL et Supplément de 2 % B27.
    6. Prétraitez les cultures cellulaires de 100 mm plats avec 2 mL de matrice de revêtement contenant du type j’ai collagène pendant 30 min à température ambiante.

2. conventionnel méthode

  1. Prétraitement de tissus de la peau
    1. Prendre 1,5 cm2 du tissu cutané et lavez-le 1 x 10 ml de PBS ; Ensuite, rincez-la avec 10 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 s et il Incuber 2 x 10 ml de solution (PBS contenant 2 % de pénicilline et de streptomycine), de lavage 5 min chacun.
      Remarque : Tous les lavages sont effectuées dans les récipients de culture de cellules de 100 mm à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
    2. Coupez le tissu avec des ciseaux stériles pour enlever la couche de graisse sous-cutanée dans une boîte de Petri de cellule de 100 mm et, ensuite, peser les tissus de la peau (le poids est 1 g dans le présent protocole).
      Remarque : Compensation suffisante est tout à fait crucial pour la séparation efficace de l’épiderme du derme. La couche de graisse jaunâtre peut être aisément distinguée visuellement.
    3. Transférer le tissu dans un autre récipient stérile de 100 mm avec le côté du derme vers le bas et, ensuite, couper les tissus de la peau en lanières de 3 à 4 mm-largeur à l’aide d’une lame de bistouri.
      Remarque : Le côté du derme avec la couche de graisse est facilement reconnaissable visuellement.
    4. Ajouter 10 mL de solution a 2,5 mg/mL pour les tissus cutanés dans une boîte de Petri de 100 mm et, ensuite, incuber le plat du jour au lendemain à 4 ° C (pas plus de 20 h).
      Remarque : La quantité de solution a peut être calculée à l’aide de 10 mL de solution a pour la digestion de chaque gramme de tissu.
  2. Séparation de l’épiderme dans les tissus de la peau
    1. Le deuxième jour, peler l’épiderme du derme à l’aide de pinces fines.
      Remarque : S’il est difficile à décoller de l’épiderme, la digestion a ne suffisait pas, qui est habituellement en raison de l’insuffisante Coupe du tissu. Dans ce cas, le tissu a besoin d’un temps d’incubation plus longs.
    2. Émincer l’épiderme Pelée avec 500 µL de milieu de culture cellulaire dans une boue de tissu à l’aide de lames de bistouri ; Ensuite, il resuspendre avec 10 mL de 0,25 % de trypsine dans un tube de 50 mL et il incuber 20 min dans un bain d’eau à 37 ° C, sous agitation.
  3. Collecte et mise en culture de cellules primaires
    1. Neutraliser l’activité de la trypsine en ajoutant un volume égal de solution de neutralisation (10 mL dans le présent protocole).
    2. Dissocier les cellules épidermiques en pipettant également, la solution de haut en bas 20 x avec une pipette sérologique de 10 mL et passer la solution de la cellule à travers un tamis de cellule de 100 µm pour éliminer les débris de tissu résiduel.
    3. Centrifuger la solution cellulaire à 200 x g pendant 5 min après filtration ; Resuspendre le culot dans un milieu de neutralisation pour le lavage et, ensuite, le centrifuger à nouveau à 200 x g pour obtenir le culot cellulaire.
    4. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de kératinocytes de faible teneur en calcium, sans sérum (GDF). Prendre 10 µL de cette solution pour compter le nombre total de cellules et, ensuite, plaque environ 2 x 106 cellules avec 10 mL de l’AFD dans les récipients de culture 100 mm cellule prétraités avec matrice de revêtement (contenant du collagène de type I).
      Remarque : Le revêtement est une étape nécessaire à la méthode conventionnelle.
    5. Changer le milieu de culture tous les 2 jours.
      Remarque : Vérifier l’adhérence de cellules au microscope avant et après avoir changé le milieu de culture.
    6. Les cellules de passage lorsqu’ils atteignent environ 80 % confluence.
      Remarque : Tous les récipients de culture sont prétraités avec la matrice de revêtement.

3. la nouvelle méthode

  1. Prétraitement de tissus de la peau
    1. Percevoir le tissu tel que décrit ci-dessus (étape 2.1) pour la méthode conventionnelle.
    2. Laver les tissus de la peau 1 x 10 ml de PBS et, ensuite, il peser dans un flacon en plastique stérile par une balance électronique (le poids est environ de 1 g dans le présent protocole).
      Remarque : Le poids minimum de tissu nécessaire pour que ce protocole est 0,1 g, car il est difficile d’obtenir un nombre suffisant de cellules si l’échantillon de tissu utilisé est trop petite. Il n’y a aucun poids maximum du tissu pour ce protocole, qui dépendante de la capacité de manutention de l’opérateur.
    3. Utiliser des pinces pour rincer le tissu cutané avec 10 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 s.
    4. Incuber le tissu 2 x 10 ml de solution (préparée à l’étape 2.1.1), pendant 5 min à laver chaque fois.
      Remarque : Toutes les étapes de lavage susmentionnées sont effectuées dans les récipients de culture de cellules de 100 mm à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire (une hotte de culture de tissus).
    5. Transférer le tissu dans un autre récipient stérile de la culture cellulaire de 100 mm.
    6. À l’aide de lames de bistouri, émincer les tissus soigneusement dans une boue de tissu.
    7. Ajouter 200 µL de PBS toutes les 5 min pour garder les tissus humides.
      Remarque : Prendre environ 15 min pour obtenir la procédure 3.1.5 - 3.1.7. Toutes les étapes ci-dessus sont effectuées à température ambiante.
  2. Digestion du tissu cutané
    1. Transvaser la solution de tissu homogénéisé dans un tube de 50 mL. Ajouter 10 mL de mélange d’enzymes par 1 g de tissu cutané. Bien mélanger les enzymes avec les tissus homogénéisés.
    2. Incuber le mélange avec la secousse dans un bain-marie à 37 ° C pendant 1 h.
    3. Ajouter un volume de 1/5 de 0,25 % de trypsine (2,5 mL dans le présent protocole) au mélange digestion pendant 30 min dans un bain d’eau à 37 ° C.
    4. Ajouter DNase I solution au mélange enzyme à un ratio de 1 : 100 (v/v) (250 µL dans le présent protocole) et il incuber pendant 5 min à température ambiante.
  3. Collecte et mise en culture de cellules primaires
    1. Arrêter le processus de digestion en ajoutant 12,5 mL de milieu de neutralisation dans un rapport 1:1. Déposer la solution monter et descendre pour environ 20 x, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL de dissocier les cellules.
    2. Filtrer les cellules dissociées à travers un tamis de cellule de 100 µm pour éliminer les débris tissulaires. Centrifuger le surnageant à 200 x g pendant 5 min. Observez la pastille au fond du tube.
    3. Jeter le surnageant et laver le culot cellulaire avec 10 mL de milieu de neutralisation et centrifuger à nouveau à 200 x g pendant 5 min recueillir les cellules.
    4. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de l’inoculation (G-milieu de l’étape 1.2.5) avec 10 µM de Y-27632.
    5. Prendre 10 µL de la solution de compter le nombre total de cellules et, ensuite, plaque environ 2 x 106 cellules avec 10 mL de milieu-G dans une boîte de Petri de cellule de 100 mm.
      Remarque : L’étape alluvionnaire n’est pas nécessaire pour la nouvelle méthode, et aucun ablation de la couche dermique n’est nécessaire non plus.
    6. Après 3 jours, remplacez le milieu de l’inoculation par moyen de GDF de faible teneur en calcium. Changer le milieu de culture tous les 2 jours.
      Remarque : Vérifier l’adhésion cellulaire avant et après avoir changé le milieu.
    7. Les cellules de passage lorsqu’ils atteignent environ 80 % confluence.
      Remarque : Si nécessaire, un prétraitement des cellules avec de la trypsine 0.05 % pendant 2 min et laver les cellules avec du PBS pour enlever la contamination des cellules dermiques avant trypsinisation les cellules épidermiques.

4. cellule passage

  1. Enlever le milieu, laver les cellules avec du PBS et, ensuite, ajouter 2 mL de 0.05 % de trypsine (par chaque plat de 100 mm).
  2. Incuber les cellules dans un incubateur (37 ° C avec 5 % de CO2) pendant 5 min.
  3. Vérifier les cellules à l’aide d’un microscope pour s’assurer que toutes les cellules ont détaché de la boîte de Pétri.
  4. Ajoutez 8 mL de DMEM avec 10 % FBS à neutraliser la réaction enzymatique et, puis, de recueillir les cellules dans un tube de 15 mL.
  5. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min obtenir le culot cellulaire.
  6. Retirez le surnageant lentement et, ensuite, resuspendre le culot cellulaire avec 10 mL de milieu de GDF et compter le nombre de cellules.
  7. Plaque de 1 x 106 cellules avec 10 mL de la GDF dans chaque boîte de cellule de 100 mm.
  8. Changer le milieu tous les 2 jours.

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Representative Results

Diagrammes schématiques de la nouvelle méthode (Figure 1 a) et la méthode conventionnelle (Figure 1 b) sont présentés dans la Figure 1. La méthode conventionnelle est une digestion en deux étapes, qui nécessite une procédure de 2 jours. En revanche, la nouvelle méthode est une digestion en une seule étape, qui dure environ 3 heures à effectuer. Ce qui est important, la nouvelle méthode en une seule étape peut obtenir deux populations (cellules épidermiques et dermiques) dans le même temps, qui dépend de la présence de Y-27632 dans le milieu de l’inoculation. Par ailleurs, la première culture temps des cellules épidermiques pour atteindre environ 80 %, confluence prend généralement au moins 3 jours de moins que la méthode conventionnelle si le même nombre de cellules est ensemencé après l’isolement.

La nouvelle méthode donne les cellules épidermiques plus primaires, qui se développent dans une morphologie de la colonie. Les HKCs isolées de la peau humaine tissus ont été inoculés avec G-moyen contenant Y-27632. Le même nombre de cellules ont été cultivée suivant la méthode conventionnelle comme contrôle. Des images représentant des cellules épidermiques à 3 et 5 jours après l’inoculation initiale sont indiqués dans la Figure 2 a. Les cellules obtenues à partir de la nouvelle méthode avait tendance à se développer comme une morphologie de la colonie. La courbe de croissance après l’inoculation a été évaluée à l’aide d’une cellule de comptage kit-8 (CCK-8) à des moments différents après l’inoculation (Figure 2 b), et le temps de doublement est environ 3-4 jours pour cellules préparées par la nouvelle méthode, mais est d’environ 6 à 8 jours pour la méthode conventionnelle. Au jour 7, les rendements des cellules ont été calculés. Les résultats sont présentés dans la Figure 2, qui montre que la nouvelle méthode a donné trois fois plus de cellules que la méthode conventionnelle et que le temps nécessaire pour atteindre le confluent au moins 3 jours après l’inoculation initiale moins (Figure 2D). Au jour 7, les cellules épidermiques arriva à confluence avec la nouvelle méthode, mais pas avec la méthode conventionnelle (Figure 2D).

La nouvelle méthode améliorée de l’expression de l’intégrine α6 par les cellules primaires. Intégrine Α6 s’est avéré être fortement exprimée par les cellules souches épidermiques15. Cellules isolées par la nouvelle méthode a conservé les caractéristiques des cellules basales de la peau après plusieurs passages. Croissance de la colonie est l’une des caractéristiques des cellules souches épidermiques provenant de la couche basale de la peau, et un haut niveau d’expression de l’intégrine α6 est une autre caractéristique de ces cellules souches épidermiques. Nous avons trouvé que l’addition de Y-27632 augmente significativement l’expression de l’intégrine α6 dans les cellules épidermiques au passage 3 (Figure 3 a-B), et au passage 3, cellules épidermiques isolées à l’aide de la nouvelle méthode ne montrent aucune contamination par des cellules dermiques 13. il est très important de maintenir les caractéristiques de carcinome baso-cellulaire après plusieurs passages pendant l’expansion de in vitro . Analyse d’immunofluorescence (IF) de la kératine de marqueur des cellules basales 5 et de la différenciation terminale marqueur loricrin16 a été réalisée avec ces cellules après trois passages. Nous avons constaté que 90 % de toutes les cellules étaient séropositifs au K5 mais moins de 10 % d'entre eux ont exprimé loricrin (Figure 3 - 3D). Ces résultats indiquent que les primaires HKCs isolés en utilisant la nouvelle méthode contiennent une population de cellules souches épidermiques et peuvent maintenir les traits caractéristiques des cellules basales. Mais plus que les HKCs sont repiquées, plus ils commencent à se différencier. Par la nouvelle méthode, nous avons constaté que les cellules épidermiques cultivés in vitro pourraient maintenir leur capacité de prolifération jusqu’au passage 8. Enfin, nous avons testé la pureté des cellules épidermiques isolées à l’aide de la méthode nouvelle, car un mélange de cellules épidermiques et dermiques a été inoculé à droite après l’isolement. Avec un traitement de courte durée (2-3 min) avec la trypsine pour enlever quelques cellules dermiques contaminer la culture initiale, une population relativement pure des cellules épidermiques a été obtenue après un seul passage (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Comparaison des procédures nouvelles et classiques d’isolement. (A), ce tableau montre une représentation schématique de la nouvelle méthode d’isolement. Au jour 1, les cellules de la peau dissociés sont inoculées dans G-médium avec ou sans Y-27632. En présence de Y-27632 pendant 2 jours, les cellules épidermiques se sélectivement. À autour du jour 6, les cellules atteignent une densité assez suffisante pour le passage. (B), ce tableau montre une représentation schématique de la méthode conventionnelle d’isolation. L’épiderme est séparé du derme et les cellules épidermiques sont isolées au jour 2, et généralement, les cellules atteignent une densité assez suffisante pour le passage à environ 10 jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : La nouvelle méthode d’isolement augmente le rendement des cellules épidermiques primaires. (A), ce panneau affiche représentant des images des cellules épidermiques, préparés par la nouvelle méthode (rangée du haut) et par la méthode conventionnelle (rangée du bas) 3 et 5 jours après l’inoculation initiale. Les barres d’échelle = 200 µm. (B) primaire HKCs préparé par la nouvelle et les classiques méthodes ont été prélevés dans les points de l’heure indiquée pour l’analyse de cellules viables à l’aide d’une cellule de comptage kit-8 (CCK-8). (C) le nombre total de cellules préparé par la nouvelle méthode et par la méthode conventionnelle ont été compté au 7e jour après l’inoculation. (D) la durée moyenne pour atteindre le confluent des cellules épidermiques primaires (passage 0) s’affiche pour la nouvelle méthode de l’isolement et la méthode conventionnelle. Pour les panneaux B - D: de Student t-test a été utilisé ; les barres d’erreur montrent la variation standard ; n = 4 ; p < 0,01, * p < 0,05 lorsque l'on compare la nouvelle méthode avec la méthode conventionnelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les cellules épidermiques primaires obtenues par la nouvelle méthode sont capables de maintenir les caractéristiques de carcinome baso-cellulaire au cours de à la vitro extension. (A) ce panneau montre une analyse de FACS d’expression de l’intégrine α6 des cellules épidermiques au passage 3 traitée avec Y-27632 (Y-27632, rouge) ou sans Y-27632 (contrôle, gris) pour 48 h. (B) ce panneau montre une analyse de la quantification des cellules à haute niveaux d’expression de l’intégrine α6 de panneau A; expression de l’intégrine α6 élevé est définie comme un signal > 103, ** p < 0,01. (C) ce panneau montre les images représentatives d’immunofluorescence souillant de K5 (rouge) et loricrin (rouge) ; DAPI (bleu) a été utilisé pour colorer les noyaux. Les barres d’échelle = 100 µm. (D), ce panneau indique une analyse de la quantification des cellules positives-K5 et à loricrin. Un total de 400 cellules étaient comptés pour quantifier chaque groupe, et le nombre moyen de cellules de K5 - et loricrin-positifs est indiqué. L’expérience a été répétée indépendamment de 4 fois. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Après le premier passage, les cellules épidermiques relativement purs ont été obtenues en utilisant la nouvelle méthode. (A), ce panneau affiche des images représentatives de l’immunofluorescence souillant de vimentine (rouge) pour les cellules épidermiques aux passages 0 (P0) et 3 (P3) ; DAPI (bleu) a été utilisé pour colorer les noyaux. Les barres d’échelle = 50 µm. (B), ce panneau indique une analyse de la quantification des cellules de vimentine positifs à des passages 0 (P0) et 1 (P1). Un total de 400 cellules étaient comptés pour quantifier chaque groupe, et le nombre moyen de cellules de vimentine positifs s’affiche. L’expérience a été répétée indépendamment de 4 fois. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

HKCs primaires cultivées ont été largement utilisés pour traiter les plaies dans les cliniques pendant plus de trois décennies et, depuis lors, il a toujours été important obtenir efficacement un nombre suffisant de cellules pour des applications cliniques en temps opportun. Par conséquent, dans la pratique, la méthode conventionnelle d’isolement, qui requiert une séparation de l’épiderme du derme, rend difficile de répondre à ces demandes, en raison du faible rendement des cellules et la faible capacité de passage des cellules adultes. Nous décrivons ici une nouvelle méthode simple, que nous avons mis au point pour obtenir efficacement HKCs de tissu adulte issu des précédents rapports13,14, qui est plus approprié pour laboratoire et pour des applications cliniques.

Doit être une attention les étapes essentielles suivantes pour obtenir les meilleurs résultats pour la nouvelle méthode. Tout d’abord, la procédure de l’homogénéisation est une étape cruciale ; homogénéisation insuffisante affecteront clairement l’efficacité de la digestion enzymatique et aboutir à un rendement faible de cellules dissociées. Deuxièmement, l’étape de digestion trypsique ne devrait pas prendre plus de 30 min ; dans le cas contraire, la viabilité des cellules dissociées diminuera. Troisièmement, pour recueillir de manière efficace les cellules dissociées, la taille des pores du filtre de cellule utilisé pour la filtration doit être de 100 µm, et un filtre unique doit être utilisé pour filtrer pas plus de 20 mL de la solution de la cellule. Quatrièmement, la densité de la tôle initiale est un facteur important pour minimiser la contamination par des cellules dermiques, parce qu’une densité cellulaire élevée réduira considérablement l’effet inhibiteur des Y-27632 sur les cellules dermiques. Par conséquent, il est essentiel de compter avec précision le nombre total de cellules dissociées à la fin de la procédure d’isolement avant l’ensemencement.

Tout d’abord, la nouvelle méthode simplifie la procédure d’isolement : la technique d’isolation conventionnelle de deux étapes prend habituellement 2 jours à effectuer, et la procédure de suppression est cruciale pour éliminer complètement les tissus adipeux de la peau, en particulier pour les tissus adultes ( Figure 1) ; Sinon, il y aura une séparation inefficace de l’épiderme du derme après digestion pendant la nuit avec a. En tirant parti des Y-27632, qui inhibe la croissance des cellules cutanées après inoculation13, la nouvelle méthode n’a pas besoin de séparer l’épiderme du derme et, par conséquent, la procédure de coupe pour éliminer le tissu graisseux n’est pas nécessaire pour les nouveaux méthode, qui n’a besoin d’une demi-journée à accomplir. En second lieu, la nouvelle méthode simplifie également la mise en culture puisque, avec la méthode traditionnelle, les cellules dissociées sont habituellement cultivées sur une couche de fibroblastes de souris irradiées dans un milieu contenant 10 % de conducteur FBS ou dans un plat recouvertes de collagène. Composants d’origine animale sont toujours des facteurs de risque qui doit être évitées pour des applications cliniques. Nous avons développé un milieu sans sérum conditionné l’inoculation (G-milieu), qui ne nécessite pas une étape alluvionnaire de Pétri et améliore également le rendement des kératinocytes primaire13 parce que G-moyen combiné avec Y-27632 favorise la fixation du la culture des cellules épidermiques plat13,17,18. Par conséquent, la nouvelle méthode facilite la mise en culture et est également une procédure relativement sûre pour des applications cliniques sans l’ajout de composants d’origine animale. Troisièmement, la nouvelle méthode améliore le rendement des cellules épidermiques primaires et réduit le temps de la culture initiale nécessaire pour atteindre le confluent. Comparée à la méthode traditionnelle, le rendement des cellules produites par la nouvelle méthode est environ 3 fois supérieur, et le passage initial de cellules épidermiques arriva à confluence au moins 3 jours auparavant (Figure 2). Enfin, la méthode new peut être utilisée pour l’isolement des cellules épidermiques de tous types d’échantillons de peau, tels que le cuir chevelu poilu peau et les tissus de peau adultes avec une épaisse couche de graisse, qui ont été testés dans un précédent rapport13.

Fort potentiel HKCs primaires ont été largement utilisées pour la recherche en laboratoire et pour des applications cliniques. Cette nouvelle méthode améliore le potentiel des cultures de cellules ayant des caractéristiques des cellules souches épidermiques13. Y-27632 augmente l’expression de l’intégrine α6 par HKCs et après trois passages, plus de 90 % des cellules épidermiques cultivés exprimées la kératine de marqueur des cellules basales 5, et moins de 10 % des cellules du marqueur de différenciation Loricrin, ce qui indique que ces cellules conservent les caractéristiques des cellules basales de la peau après plusieurs passages. Les cellules épidermiques développé la culture peuvent reconstituer la peau en vivo après la greffe13, ce qui laisse supposer qu’ils possèdent le potentiel de régénération après une expansion dans la culture. Notamment, la nouvelle méthode est idéale pour isoler des cellules provenant de tissus adultes, comme mentionné ci-dessus. Par conséquent, les cellules épidermiques préparées par cette méthode peuvent être utilisés pour in vitro et in vivo des modèles pour étudier les maladies de la peau et peut se transformer en produits à base de cellules autologues pour applications cliniques telles que le traitement des plaies cutanées.

En résumé, le nouveau protocole prévoit une procédure simplifiée et efficace pour isoler et augmenter les cellules épidermiques primaires provenant de tissus de la peau adulte. Cette méthode de pointe est plus adaptée pour produire un grand nombre de cellules épidermiques fort potentiel pour laboratoire et pour des applications cliniques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National Key Research and Development Programme of China (2017YFA0104604), le programme général de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC, 81772093), la Science et la technologie de développement programme de Suzhou (ZXL2015128), la Fondation sciences naturelles de la Province du Jiangsu (BK20161241) et une bourse de chercheur Shandong Taishan (tshw201502065).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting 
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker Shanghai Boxun 150036 For water bath
Electronic Scale Harbin Zhonghui 1171193 For tissue weighing
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifuge
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science  P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HKC dissociation
0.25% Trypsin  Beijing Solarbio Science & Technology T1350-100 For HKC dissociation
Coating Matrix Kit Life Technologies R-011-K For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HKC isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HKC isolation
Deoxyribonuclease I Sigma 9003-98-9 For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Thermo Scientific NC9864731 cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 Hewlett-Packard Development Company MA-20142 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin Covance PRB-145p For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3) Santa Cruz  SC-19622 flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC Santa Cruz  SC-2831 negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

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References

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Biologie du développement numéro 138 les kératinocytes cellules souches épidermiques cellules dermiques isolement de cellules primaires de peau culture de kératinocytes inhibiteur de la kinase Y-27632 associée à Rho régénération de la peau
Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte
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Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou,… More

Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou, Q., Zhou, C., Zhao, H., Wu, X. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57784, doi:10.3791/57784 (2018).

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