Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En forenklet og effektiv metode til at isolere primære humane keratinocytter fra voksen hudvæv

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57784
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at effektivt isolere primære humane keratinocytter fra voksen hud væv. Denne metode forenkler den konventionelle procedure ved hjælp af ROCK hæmmer Y-27632 på mellemlang og podning til spontant adskille epidermale celler fra dermal celler.

Abstract

Primære humane keratinocytter isoleret fra frisk hud væv og deres ekspansion i vitro har været udbredt, laboratorie-forskning og kliniske applikationer. Metoden konventionelle isolation af humane keratinocytter indebærer en totrinsprocedure for sekventielle Enzymatisk nedbrydning, som har vist sig for at være ineffektive i generere primærelementer fra voksent væv på grund af lav celle genfindingsprocenten og reduceret celle levedygtighed. Vi har for nylig rapporteret en avanceret metode til at isolere menneskelige primære epidermal stamceller fra væv, hud, der udnytter Rho kinase inhibitor Y-27632 på mellemlang. Sammenlignet med den traditionelle protokol, denne nye metode er enklere, lettere og mindre tidskrævende, og øger epitelial stamcelle udbytte og forbedrer deres stamcelle karakteristika. Desuden, den nye metode kræver ikke adskillelse af epidermis til dermis, og, derfor, er velegnet til isolering af celler fra forskellige typer af voksen væv. Denne nye isolation metode overvinder de store mangler ved konventionelle metoder og er mere egnet til at producere store mængder af epidermale celler med høj potens både laboratorium og kliniske applikationer. Her beskriver vi den nye metode i detaljer.

Introduction

Målet var at udvikle en enkel og effektiv protokol for at isolere primære humane keratinocytter (HKCs) fra voksne væv, især til kliniske applikationer. Huden epidermal stamceller, lokaliseret i den basale lag af huden, besidder et stort potentiale til at formere sig og differentiere og give keratinocytter for at opretholde funktionerne af huden1,2,3, 4. HKCs isoleret fra hud væv er almindeligt brugt til hud væv manipulation og regenerering formål, især i reparation af beskadiget hud og genterapi for kliniske applikationer5,6. Det centrale spørgsmål for HKC-baserede programmer er effektivt isolerer og udvide stort antal HKCs med høj potentiel in vitro-7,8. Selv om forskellige forskergrupper har udviklet metoder til at producere kulturer af stilk-lignende HKCs, er disse metoder undertiden tidskrævende og kompliceret at udføre og har andre begrænsninger, såsom lav celle udbytter og er begrænset af typen af huden modellen brugte9. For eksempel, indebærer den traditionelle metode til at isolere HKCs fra hud væv en to-trins Enzymatisk nedbrydning med en adskillelse af epidermis fra dermis6. Denne metode fungerer normalt godt for neonatal væv, men det bliver meget vanskeligt, når det bruges til at isolere celler fra voksne væv.

Y-27632, en hæmmer af Rho-forbundet protein kinase (ROCK), er blevet rapporteret til betydeligt øge effektiviteten af epidermale stamceller isoleret og koloni vækst10,11,12. I en tidligere undersøgelse opdagede vi at Y-27632 letter den klonede vækst af epidermale celler, men reducerer udbyttet af dermal celler af varierende kontrollerende udtryk for vedhæftning molekyler13. Vi har også etableret et nyt konditioneret podning medie, kaldet G-medium, som støtter vækst og udbytte af primære epidermale celler. Ved at kombinere G-medium med Y-27632, kan denne nye metode spontant adskille dermal og epidermal celler efter enzym fordøjelse, dermed fjerne trin i epidermis-dermis adskillelse13,14. Baseret på tidligere betænkninger, beskrive vi nu den detaljerede procedure af denne nye metode til at isolere HKCs fra voksen hudvæv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humane væv bruges i denne protokol er blevet håndteret efter retningslinjerne i institutionens menneskelige videnskabsetisk Komité (NO.2015120401, dato: 12 maj 2015).

1. præparater

  1. Indsamle friske voksne abdominal hud væv kasseret fra plastikkirurgi på hospitalet i en 50 mL tube med 10 mL iskold Dulbecco ændrede Eagle medium (DMEM). Modellen kan opbevares ved 4 ° C i op til 72 timer uden væsentligt påvirker cellernes levedygtighed.
  2. Forberede reagenser og næringssubstrat, som beskrevet nedenfor.
    1. Der tilsættes 1 mL (100 U/mL) penicillin og streptomycin (100 mg/L) til 50 mL af fosfatbufferet løsning (PBS) til at forberede vask løsning.
    2. Forbered to sæt af enzymet fordøjelsen løsninger: (1) forberede 50 mL af dispase (2,5 mg/mL i DMEM) og 50 mL af type I-collagenase (2,5 mg/mL i DMEM) separat for den konventionelle metode; og (2) forberede 50 mL af en blanding af dispase og skriv jeg collagenase (opløses 125 mg dispase pulver og 125 mg af type I-collagenase pulver i 50 mL af DMEM) for den nye metode.
      Bemærk: Alle enzym løsninger bør være filtreret med en 0,22 µm si og holdt at4 ° C.
    3. Forbereder fordøjelsen løsninger for begge metoder: 0,05% trypsin og 0,25% trypsin var kommercielt købt. Forberede en 10 mg/mL DNase jeg løsning ved at opløse 50 mg af DNase jeg pulver i 5 mL PBS, filtrere det med en 0,22 µm si, og opbevar den ved-20 ° C.
    4. Forberede 500 mL af medium til at neutralisere den enzymatiske fordøjelse: DMEM medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin.
    5. Forberede 500 mL af podning medium (vækst-faktor-holdige medium, kaldet G-medium): DMEM/F12 (3:1) medium indeholdende 1% penicillin/streptomycin, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast vækstfaktor 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF), og 2% B27 supplement.
    6. Forbehandle 100-mm cellekultur retter med 2 mL af belægning matrix indeholdende type kollagen i 30 min. ved stuetemperatur.

2. konventionelle metode

  1. Hud væv forbehandling
    1. Tage 1,5 cm2 af hudvæv og vaske det 1 x med 10 mL PBS; derefter, skyl det med 10 mL af 70% ethanol til 30 s og inkuberes det 2 x med 10 mL af vask løsning (PBS indeholdende 2% penicillin og streptomycin), 5 min.
      Bemærk: Alle vasker er udført i 100-mm celle kultur retter inde i en laminar flow hætte.
    2. Trim vævet med steril saks til at fjerne det subkutane fedt lag i en 100-mm celle kultur parabol og så vejer den hudvæv (vægten er 1 g i denne protokol).
      Bemærk: Tilstrækkelig trimning er meget afgørende for en effektiv adskillelse af epidermis fra dermis. Den gullige fedtlag kan nemt skelnes visuelt.
    3. Overføre væv til et andet 100-mm sterile parabol med dermis side ned, og derefter skære huden væv i 3 til 4 mm bred strimler ved hjælp af en skalpel klinge.
      Bemærk: Dermis siden med det fedtlag er let anerkendte visuelt.
    4. Tilsættes 10 mL 2,5 mg/mL dispase til huden væv i en 100-mm kultur parabol, og derefter inkuberes parabol natten over ved 4 ° C (ikke mere end 20 h).
      Bemærk: Den dispase løsning kan beregnes ved hjælp af 10 mL af dispase løsning for fordøjelsen af hvert gram væv.
  2. Adskillelse af overhuden huden væv
    1. På andendagen, skalle af epidermis fra dermis ved hjælp af fine pincet.
      Bemærk: Hvis det er svært at skrælle epidermis, dispase fordøjelse ikke var tilstrækkelig, hvilket er normalt på grund af utilstrækkelig trimning af væv. I dette tilfælde væv har brug for en længere inkubationstiden.
    2. Hakkekød flåede epidermis med 500 µL af cellekulturmedium i et væv gylle med skalpel vinger; derefter resuspend det med 10 mL 0,25% trypsin i en 50 mL tube og inkuberes det 20 min. i et vandbad ved 37 ° C under omrystning.
  3. Indsamling og dyrkning af primærelementer
    1. Neutralisere trypsin aktivitet ved at tilføje et lige saa stort volumen af neutralisering opløsning (10 mL i denne protokol).
    2. Adskille den epidermale celler af pipettering løsning op og ned ad 20 x med en 10-mL serologisk pipette og passere celle løsning gennem en 100 µm celle si til at fjerne enhver resterende væv snavs.
    3. Der centrifugeres celle løsning på 200 x g for 5 min efter filtrering; resuspenderes celle i neutralisering medium til vask, og derefter centrifugeres det igen på 200 x g at opnå celle pellet.
    4. Celle resuspenderes i 10 mL af lav-calcium, serumfrit keratinocytter medium (SFM). Tage 10 µL af denne løsning til at tælle det samlede celle nummer og derefter plade omkring 2 x 106 celler med 10 mL af SFM i 100-mm celle kultur retter forbehandlet med belægning matrix (indeholdende type jeg kollagen).
      Bemærk: Belægning er et nødvendigt skridt for den konventionelle metode.
    5. Ændre næringssubstratet hver 2 d.
      Bemærk: Kontroller celle friktion under et mikroskop før og efter skiftende næringssubstratet.
    6. Passage af celler, når de når omkring 80% sammenløb.
      Bemærk: Alle kultur retter er forbehandlet med belægning matrix.

3. den nye metode

  1. Hud væv forbehandling
    1. Indsaml det væv som beskrevet ovenfor (trin 2.1) for den konventionelle metode.
    2. Vaske hudvæv 1 x med 10 mL PBS og så vejer det i en steril plastikbeholder af en elektronisk skala (vægten er ca. 1 g i denne protokol).
      Bemærk: Mindstevægt af væv, der er nødvendige for denne protokol er 0,1 g, da det er vanskeligt at opnå et tilstrækkeligt antal celler hvis væv modellen bruges er for lille. Der er ingen maksimale vægt af væv til denne protokol, som i sidste ende afhænger af operatøren håndtering kapacitet.
    3. Bruge pincet til at skylle huden væv med 10 mL af 70% ethanol til 30 s.
    4. Inkuber væv 2 x med 10 mL af vask løsning (udarbejdet i trin 2.1.1), for 5 min hver gang.
      Bemærk: Alle vask trinene nævnt ovenfor er udført i 100-mm celle kultur retter inde i en laminar flow hætte (en vævskultur hood).
    5. Overføre væv til et andet 100-mm celle kultur sterile parabol.
    6. Bruger skalpel vinger, hakkekød vævet grundigt ind i et væv gylle.
    7. Tilføje 200 µL af PBS hvert 5 min for at holde væv våd.
      Bemærk: Tage omkring 15 min. skridt 3.1.5 - 3.1.7. Alle ovenstående trin udføres ved stuetemperatur.
  2. Fordøjelsen af hudvæv
    1. Oploesningen homogeniseret væv til en 50 mL tube. Der tilsættes 10 mL af enzymet blanding for hver 1 g af hudvæv. Bland enzymerne grundigt med homogeniseret væv.
    2. Inkuber blanding med rystende i et vandbad ved 37 ° C i 1 time.
    3. Tilføje en 1/5 volumen af 0,25% trypsin (2,5 mL i denne protokol) til fordøjelsen blandingen til en anden 30 minutter i et vandbad ved 37 ° C.
    4. Tilføje DNase jeg løsning til enzym blandingen i forholdet 1: 100 (v/v) (250 µL i denne protokol) og Inkuber det i 5 min ved stuetemperatur.
  3. Indsamling og dyrkning af primærelementer
    1. Stop fordøjelsesprocessen ved at tilføje 12,5 mL neutralisering medium i forholdet 1:1. Der afpipetteres løsningen op og ned til omkring 20 x, ved hjælp af en 10-mL serologisk pipette til at adskille cellerne.
    2. Filtrere de dissocierede celler gennem en 100 µm celle si til at fjerne væv snavs. Der centrifugeres supernatanten ved 200 x g i 5 min. observere pellet i bunden af røret.
    3. Supernatanten og vaske den celle pellet med 10 mL af neutralisering medium, og der centrifugeres igen ved 200 x g i 5 min til at indsamle cellerne.
    4. Celle resuspenderes i 10 mL af podning medium (G-medium fra trin 1.2.5) med 10 µM af Y-27632.
    5. Tage 10 µL af løsningen at tælle det samlede celle nummer og derefter plade omkring 2 x 106 celler med 10 mL af G-medium i en 100-mm celle kultur skål.
      Bemærk: Det precoating skridt er ikke nødvendigt for den nye metode, og ingen fjernelse af den dermale lag er påkrævet enten.
    6. Efter 3 d, skal du erstatte podning medium med lav-calcium SFM medium. Ændre næringssubstratet hver 2 d.
      Bemærk: Kontroller celle vedhæftning før og efter skiftende medium.
    7. Passage af celler, når de når omkring 80% sammenløb.
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, forbehandle celler med 0,05% trypsin for 2 min og cellerne vaskes med PBS til at fjerne forurenende dermal celler før trypsinizing den epidermale celler.

4. celle Passaging

  1. Fjern mediet, cellerne vaskes med PBS, og derefter tilsættes 2 mL 0,05% trypsin (per hver 100-mm parabol).
  2. Inkuber celler i en inkubator (37 ° C med 5% CO2) i 5 min.
  3. Se celler ved hjælp af et mikroskop for at sikre, at alle celler er skilt fra kultur parabol.
  4. Tilføje 8 mL af DMEM med 10% FBS at neutralisere den enzymatiske reaktion og derefter indsamle cellerne i en 15 mL tube.
  5. Der centrifugeres ved 200 x g for 5 min at opnå celle pellet.
  6. Fjern supernatanten langsomt, og derefter resuspenderes celle med 10 mL af SFM medium og tæller antallet af celler.
  7. Plade 1 x 106 celler med 10 mL af SFM i hver 100-mm celle skål.
  8. Ændre medium hver 2 d.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skematiske diagrammer af den nye metode (figur 1A) og den konventionelle metode (figur 1B) er præsenteret i figur 1. Den konventionelle metode er en to-trins fordøjelse, som kræver en 2-dages procedure. Den nye metode er derimod en et-trins fordøjelsen, hvilket tager omkring 3 timer for at udføre. Vigtigere, kan et-trins nye metode få to populationer (epidermale og dermal celler) på samme tid, hvilket afhænger af tilstedeværelsen af Y-27632 i podning medium. Desuden, oprindelige kultur tid af epidermale celler at nå omkring 80% sammenløbet normalt tager mindst 3 dage mindre end den konventionelle metode hvis det samme antal celler Podningen efter isolation.

Den nye metode giver mere primære epidermale celler, der vokser i en koloni morfologi. De isolerede HKCs fra menneskelige hud væv blev podet med G-medium, der indeholder Y-27632. Det samme antal celler blev forgyldt, efter den konventionelle metode som kontrol. Repræsentative billeder af den epidermale celler dage 3 og 5 efter den indledende podning er vist i figur 2A. De celler, der er fremstillet af den nye metode tendens til at vokse som en koloni morfologi. Vækstkurven efter inokulation blev vurderet ved hjælp af en celle tælle kit-8 (CCK-8) på forskellige tidspunkter efter podning (figur 2B), og den fordobling tid er omkring 3-4 dage for celler, der er udarbejdet af den nye metode men er omkring 6-8 dage til den konventionelle metode. På dag 7, blev udbyttet af celler beregnet. Resultaterne er vist i figur 2 c, hvilket viser, at den nye metode gav tre gange flere celler end den konventionelle metode, og at den tid, det tager at nå sammenløbet efter den indledende podning var mindst 3 dage mindre (figur 2D). På dag 7 nåede den epidermale celler sammenløbet med den nye metode, men ikke med den konventionelle metode (figur 2D).

Den nye metode forbedret udtryk for α6-integrin af primære celler. Α6-integrin har vist sig at udtrykkes meget af epidermale stamceller15. Celler isoleret ved den nye metode vedligeholdes Karakteristik af huden basal celler efter flere passager. Koloni vækst er en af egenskaber af epidermale stamceller afledt af den basale lag af huden, og et højt niveau af α6-integrin udtryk er en anden funktion i disse epidermal stamceller. Vi fandt, at tilsætning af Y-27632 markant øget udtryk for α6-integrin i epidermal celler på passage 3 (Figur 3A-B), og på passage 3, epidermale celler isoleret ved hjælp af den nye metode viser ingen forurening af dermal celler 13. det er meget vigtigt at opretholde basalcelle funktioner efter flere passager under in vitro- udvidelsen. Immunofluorescens (IF) analyse af basalcelle markør keratin 5 og terminal differentiering markør loricrin16 blev udført med disse celler efter tre passager. Vi fandt, at 90% af alle celler var K5-positive, men mindre end 10% af dem udtrykt loricrin (figur 3 c - 3D). Disse resultater viser, at primære HKCs isoleret ved hjælp af den nye metode indeholder en epidermal stamcelle befolkning og kan fastholde de karakteristiske træk af basal celler. Men jo længere at HKCs er passaged, jo mere begynder de at differentiere. Ved den nye metode, vi har fundet den epidermale celler dyrkes in vitro- kunne bevare deres spredning evne indtil passage 8. Endelig, vi testede renheden af epidermale celler isoleret ved hjælp af den nye metode, da en blanding af dermal og epidermal celler blev vaccineret lige efter isoleret. Med en kort tid (2-3 min) behandling med trypsin at fjerne et par dermal celler forurener den oprindelige kultur, blev en forholdsvis ren population af epidermale celler opnået efter en passage (figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Sammenligning af de nye og konventionelle isolationsprocedurer. (A) dette panel viser en skematisk fremstilling af den nye isolering metode. På dag 1 podes dissocierede hudens celler i G-medium, med eller uden Y-27632. I overværelse af Y-27632 for 2 dage udvide den epidermale celler selektivt. På omkring dag 6, nå cellerne en tilstrækkelig nok til passaging tæthed. (B) dette panel viser en skematisk gengivelse af metoden konventionelle isolation. Epidermis er adskilt fra dermis og den epidermale celler er isoleret på dag 2, og normalt, cellerne nå en tæthed tilstrækkelige nok til passaging på omkring 10 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Den nye isolering metode øger udbyttet af primære epidermale celler. (A) dette panel viser repræsentant billeder af epidermale celler udarbejdet efter den nye metode (øverste række) og den konventionelle metode (nederste række) på dage 3 og 5 efter den indledende podning. Skala barer = 200 µm. (B) primære HKCs udarbejdet af de nye og de konventionelle metoder blev indsamlet på de angivne tidspunkter til analyse af levedygtige celler ved hjælp af en celle tælle kit-8 (CCK-8). (C) det samlede antal celler udarbejdet af den nye metode og af den konventionelle metode blev talt på dag 7 efter podning. (D) den gennemsnitlige tid at nå frem til sammenløbet af primære epidermale celler (passage 0) er vist for både den nye isolering metode og den konventionelle metode. For paneler B - D: Student's t-test anvendtes; fejllinjer Vis standardvariationen; n = 4; p < 0,01, * p < 0,05 når man sammenligner den nye metode med den konventionelle metode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Primære epidermale celler fremstillet ved den nye metode er købedygtig påstå basalcelle funktioner under in vitro- ekspansion. (A) dette panel viser en FACS analyse af α6-integrin udtryk for epidermal celler på passage 3 behandles med Y-27632 (Y-27632, red) eller uden Y-27632 (kontrol, grå) for 48 h. (B) dette panel viser en kvantificering analyse af celler med høj udtrykket niveauer af α6-integrin fra panelet A; høj α6-integrin udtryk er defineret som en signal > 103, ** p < 0,01. (C) dette panel viser repræsentative billeder af immunofluorescens farvning af K5 (rød) og loricrin (rød); DAPI (blå) blev brugt til at plette kerner. Skala barer = 100 µm. (D) dette panel viser en kvantificering analyse af K5 - og loricrin-positive celler. Ialt 400 celler blev talt for at kvantificere hver gruppe, og det gennemsnitlige antal K5 - og loricrin-positive celler er vist. Eksperimentet blev selvstændigt gentages 4 gange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Efter den første passage, relativt ren epidermale celler blev opnået med den nye metode. (A) dette panel viser repræsentative billeder af immunofluorescens farvning af vimentin (rød) til epidermale celler på passager 0 (P0) og 3 (P3); DAPI (blå) blev brugt til at plette kerner. Skala barer = 50 µm. (B) dette panel viser en kvantificering analyse af vimentin-positive celler på passager 0 (P0) og 1 (P1). Ialt 400 celler blev talt for at kvantificere hver gruppe, og det gennemsnitlige antal vimentin-positive celler er vist. Eksperimentet blev selvstændigt gentages 4 gange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kulturperler primære HKCs har været bredt udnyttet til at behandle sår i klinikker i mere end tre årtier, og siden tid, det har altid været vigtigt at effektivt opnå tilstrækkeligt antal celler til kliniske applikationer i tide. Metoden konventionelle isolation, der kræver adskillelse af epidermis til dermis, gør det derfor vanskeligt at opfylde disse krav, på grund af det lave udbytte af celler og den lave evne til passage voksne celler i praksis. Her, beskriver vi en ny enkel metode vi udviklede for at opnå effektivt HKCs fra voksne væv baseret på tidligere rapporter13,14, som er mere velegnet både til laboratoriet og til kliniske applikationer.

Være skal opmærksom på følgende kritiske trin at opnå de bedste resultater for den nye metode. Først, homogenisering proceduren er et afgørende skridt; utilstrækkelig homogenisering vil klart påvirke effektiviteten af enzymatisk fordøjelse og resultere i et lavt udbytte af dissocierede celler. Andet, trypsin fordøjelsen skridt bør ikke tage mere end 30 min. ellers, levedygtigheden af de dissocierede celler vil falde. For det tredje at effektivt samle de dissocierede celler, bør porestørrelse af celle sien bruges til filtrering 100 µm, og en enkelt si bør bruges til at filtrere ikke mere end 20 mL af opløsningen, celle. Fjerde er tæthed af den oprindelige plating en vigtig faktor til at minimere forurening med dermal celler, fordi en høj celle tæthed vil reducere den hæmmende effekt af Y-27632 på dermal celler. Derfor er det afgørende at præcist tælle det samlede antal dissocierede celler i slutningen af proceduren isolation før plating.

Først, den nye metode forenkler proceduren isolation: konventionelle isolation totrinsprocedure tager normalt 2 dage at udføre, og proceduren for trimning er afgørende for helt at fjerne det fedtvæv fra huden, især for voksent væv ( Figur 1); ellers vil der være en ineffektiv adskillelse af epidermis fra dermis efter natten fordøjelse med dispase. Ved at udnytte Y-27632, som hæmmer væksten af dermal celler efter podning13, den nye metode behøver ikke at adskille epidermis fra dermis og trimning procedure til at fjerne det fedtvæv er derfor ikke nødvendigt for den nye metode, som kun har behøver for en halv dag skal udføres. For det andet den nye metode også forenkler proceduren kultur, da med den traditionelle metode, de dissocierede celler er normalt dyrkes på en feeder lag af bestrålede mus fibroblaster i medium indeholdende 10% FBS eller i en kollagen-præcoatede parabol. Dyr-afledte komponenter er altid risikofaktorer, der bør undgås for kliniske applikationer. Vi udviklede et serumfrit konditioneret podning medium (G-medium), som ikke kræver en precoating skridt for kultur retter og også øger udbyttet af primære keratinocytter13 fordi G-medium kombineret med Y-27632 fremmer udlæg i Epidermal celler til kultur fad13,17,18. Derfor, den nye metode letter proceduren kultur og er også en forholdsvis sikker procedure til kliniske applikationer uden tilsætning af dyr-afledte komponenter. For det tredje, den nye metode forbedrer udbyttet af primære epidermale celler og forkorter den oprindelige kultur tid at nå sammenløbet. Sammenlignet med den traditionelle metode, udbyttet af celler fremstillet ved den nye metode er omkring 3 gange højere, og den første passage af epidermale celler nåede sammenløbet mindst 3 dage tidligere (figur 2). Endelig, den nye metode kan anvendes til isolering af epidermale celler fra alle typer af hud prøver, såsom behårede hovedbund huden og voksen hud væv med et tykt fedtlag, der er blevet testet i en tidligere betænkning13.

Stort potentiale primære HKCs har været meget anvendt til laboratorie-forskning og kliniske applikationer. Denne nye metode øger potentialet af dyrkede celler med Karakteristik af epidermale stamceller13. Y-27632 forbedrer α6-integrin udtryk af HKCs, og efter tre passager, mere end 90% af den kulturperle epidermale celler udtrykt basalcelle markør keratin 5, og færre end 10% af cellerne udtrykt differentiering markør Loricrin, hvilket indikerer, at disse celler holde Karakteristik af huden basal celler efter flere passager. Den kultur-udvidet epidermale celler kan rekonstruere hud i vivo efter podning13, tyder på, at de besidder regenerering potentielle efter ekspansion i kultur. Navnlig er den nye metode ideel til at isolere celler fra voksne væv, som nævnt ovenfor. Derfor epidermale celler udarbejdet af denne metode kan anvendes til in vitro og i vivo modeller for at studere hudsygdomme og kan udvikles til autolog cellebaserede lægemidler til kliniske applikationer såsom behandling af hud sår.

I sammendrag giver den nye protokol en forenklet og effektiv procedure for at isolere og udvide primære epidermale celler fra voksne hudvæv. Denne avancerede metode er mere egnet til fremstilling af stort antal frodigt epidermale celler både laboratorium og kliniske applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den nationale nøgle forskning og udvikling Program af Kina (2017YFA0104604), General Program af National Natural Science Foundation of China (NSFC, 81772093), videnskab og teknologi udvikling Program af Suzhou (ZXL2015128), Natural Science Foundation of Jiangsu provins (BK20161241), og en Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting 
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker Shanghai Boxun 150036 For water bath
Electronic Scale Harbin Zhonghui 1171193 For tissue weighing
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifuge
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science  P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HKC dissociation
0.25% Trypsin  Beijing Solarbio Science & Technology T1350-100 For HKC dissociation
Coating Matrix Kit Life Technologies R-011-K For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HKC isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HKC isolation
Deoxyribonuclease I Sigma 9003-98-9 For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Thermo Scientific NC9864731 cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 Hewlett-Packard Development Company MA-20142 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin Covance PRB-145p For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3) Santa Cruz  SC-19622 flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC Santa Cruz  SC-2831 negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  2. Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
  3. Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
  4. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
  5. Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
  6. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  7. Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
  8. Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
  9. Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
  10. Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
  11. Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  12. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
  15. Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
  16. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
  17. Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
  18. Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 138 humane keratinocytter epidermal stamceller dermal celler primære hud celle isolation keratinocytter kultur Y-27632 Rho-associerede kinase inhibitor hud regeneration
En forenklet og effektiv metode til at isolere primære humane keratinocytter fra voksen hudvæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou,… More

Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou, Q., Zhou, C., Zhao, H., Wu, X. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57784, doi:10.3791/57784 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter