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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57784
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Abstract

Primären menschlichen Keratinozyten aus frischem Hautgewebe und ihre Erweiterung in-vitro- isoliert haben für Laborforschung und klinische Anwendungen weit verbreitet. Die konventionelle Isolationsmethode der menschlichen Keratinozyten beinhaltet ein zweistufiges sequentielle enzymatische Verdauung Verfahren, die sich bewährt hat, als ineffizient bei der Schaffung von Primärzellen von adulten Geweben aufgrund der niedrigen Zelle Wiederfindungsrate und reduzierten Zelle Lebensfähigkeit. Wir berichteten vor kurzem eine fortgeschrittene Methode, menschliche primäre epidermaler Vorläuferzellen von Hautgewebe zu isolieren, die die Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 im Medium nutzt. Im Vergleich mit dem traditionellen Protokoll, diese neue Methode ist einfacher, leichter und weniger zeitaufwendig, und epithelialen Stammzellen Ausbeute erhöht und verbessert ihre Stammzell-Eigenschaften. Darüber hinaus der neuen Methodik erfordert nicht die Trennung der Epidermis von der Dermis, und eignet sich somit für die Isolierung von Zellen aus verschiedenen Arten von adulten Geweben. Diese neue Isolationsmethode überwindet die größten Schwächen der herkömmlichen Methoden und eignet sich eher für die Herstellung von großen Zahlen von epidermalen Zellen mit hoher Potenz für Labor und klinische Anwendungen. Hier beschreiben wir die neue Methode im Detail.

Introduction

Ziel war es, ein einfaches und effizientes Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten (HKCs) von adulten Geweben, vor allem für klinische Anwendungen isolieren zu entwickeln. Epidermalen Hautstammzellen, lokalisiert in der basalen Schicht der Haut, besitzen ein hohes Potenzial zu vermehren und zu unterscheiden und bieten Keratinozyten zur Aufrechterhaltung der Funktionen der Haut1,2,3, 4. HKCs von Geweben weit für Haut Gewebe-Engineering und Regeneration Zwecke, vor allem in der Reparatur der beschädigten Haut und in der Gentherapie für klinische Anwendungen5,6 verbreitet sindHaut isoliert. Die Schlüsselfrage für HKC-basierten Anwendungen ist es, effizient zu isolieren und zu große Anzahl von HKCs mit hohem Potenzial in-vitro-7,8zu erweitern. Obwohl verschiedene Forschergruppen Methoden entwickelt, um die Kulturen der Stamm-ähnliche HKCs zu produzieren, sind diese Methoden manchmal zeitaufwendig und kompliziert zu führen und andere Einschränkungen, z. B. niedrige Zelle Renditen und durch die Art der Haut Probe begrenzt 9verwendet. Zum Beispiel beinhaltet die traditionelle Methode, HKCs von Hautgewebe zu isolieren eine zweistufigen enzymatischen Verdauung mit einer Trennung der Epidermis von der Dermis-6. Diese Methode funktioniert in der Regel gut für neonatale Gewebe, aber es wird sehr schwierig, wenn verwendet, um Zellen aus adulten Geweben zu isolieren.

Y-27632, ein Inhibitor der Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK), wurde berichtet, erheblich verbessern die Effizienz der epidermalen Stammzellen isoliert und Kolonie Wachstum10,11,12. In einer früheren Studie entdeckten wir, dass Y-27632 das klonale Wachstum der Epidermiszellen erleichtert sondern den Ertrag der dermalen Zellen verringert durch die differentiell Steuerung des Ausdrucks der Adhäsion Moleküle13. Wir stellte auch ein neues konditionierten Inokulation Medium, genannt G-Medium, das Wachstum und Ertrag von primären epidermalen Zellen unterstützt. Durch die Kombination G-Medium mit Y-27632, kann diese neuartige Methode epidermale und dermale Zellen spontan nach Enzym Verdauung, so dass den Schritt der Epidermis-Dermis Trennung13,14trennen. Basierend auf früheren Berichten, beschreiben wir nun die Einzelheiten des Verfahrens der neuen Methode HKCs von Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren.

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Protocol

Menschlichem Gewebe, die in diesem Protokoll verwendeten nach den Richtlinien des Instituts Humanforschung Ethik-Kommission behandelt wurden (NO.2015120401, Datum: 12. Mai 2015).

1. Vorbereitungen

  1. Sammeln frische Erwachsenen Bauchhaut Gewebe verworfen von plastische Chirurgie am Krankenhaus in einen 50-mL-Tube mit 10 mL eiskaltes Dulbecco modifizierten Eagle Medium (DMEM). Das Präparat kann bei 4 ° C bis zu 72 h ohne erheblichen Auswirkungen auf die Zellviabilität gehalten werden.
  2. Bereiten Sie die Reagenzien und Kulturmedium wie unten beschrieben vor.
    1. Fügen Sie 1 mL Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 mg/L) bis 50 mL von Phosphat-gepufferte Lösung (PBS), die Waschlösung vorzubereiten.
    2. Bereiten Sie zwei Sätze von Enzym Verdauung Lösungen: (1) bereiten Sie 50 mL Dispase (2,5 mg/mL in DMEM) und 50 mL Typ I Kollagenase (2,5 mg/mL in DMEM) separat für die konventionelle Methode; und (2) bereiten Sie 50 mL einer Mischung aus Dispase und Typ I Kollagenase (auflösen 125 mg Dispase Pulver und 125 mg Typ I Kollagenase Pulver in 50 mL DMEM) für die neue Methode.
      Hinweis: Alle Enzym Lösungen sollten mit einem 0,22 µm-Sieb gefiltert und at4 ° c gehalten
    3. Beide Methoden Verdauung Lösungen vorbereiten: Trypsin 0,05 % und 0,25 % Trypsin im Handel gekauft wurden. Bereiten Sie eine 10 mg/mL DNase ich Lösung durch Auflösen von 50 mg DNase ich in 5 mL PBS Pulver, mit einem 0,22 µm-Sieb Filtern und speichern Sie es bei-20 ° C.
    4. Bereiten Sie 500 mL des Mediums, die enzymatische Verdauung zu neutralisieren: DMEM Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
    5. 500 mL Inokulation Medium (Wachstum-Faktor-haltige Mittel, genannt G-Medium) vorbereiten: DMEM/F12 (3:1) Medium mit 1 % Penicillin/Streptomycin, 40 µg/mL Fungizone, 40 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und Zuschlag von 2 % B27.
    6. 100 mm Zellkultur Vorbehandeln Gerichte mit 2 mL der Beschichtung Matrix, Typ enthält ich Kollagen für 30 min bei Raumtemperatur.

2. konventionelle Methode

  1. Haut-Gewebe-Vorbehandlung
    1. Nehmen Sie 1,5 cm2 von Hautgewebe und waschen Sie es 1 X mit 10 mL PBS; dann spülen sie mit 10 mL 70 % igem Ethanol für 30 s und inkubieren Sie es 2 X mit 10 mL Waschlösung (PBS, enthält 2 % Penicillin und Streptomycin), 5 min.
      Hinweis: Alle Waschungen sind im 100-mm-Zelle Kultur Gerichte in einem Laminar-Flow-Kapuze durchgeführt.
    2. Schneiden Sie das Gewebe mit einer sterilen Schere Entfernen der subkutanen Fettschicht in der Kulturschale 100 mm Zelle und dann wiegen das Hautgewebe (das Gewicht beträgt 1 g in diesem Protokoll).
      Hinweis: Ausreichende Besatz ist sehr entscheidend für die effiziente Trennung der Epidermis von der Dermis. Die gelbliche Fettschicht kann optisch leicht unterscheiden.
    3. Übertragen Sie das Gewebe auf ein weiteres 100 mm steril Gericht mit der Lederhaut Seite nach unten, und dann schneiden Sie das Hautgewebe in 3 bis 4 mm breite Streifen mit einem Skalpellklinge.
      Hinweis: Die Dermis-Seite mit der Fettschicht ist visuell erkennbar.
    4. Das Hautgewebe in der Kulturschale 100 mm 10 mL 2,5 mg/mL Dispase-Lösung hinzu und inkubieren Sie dann die Schale über Nacht bei 4 ° C (nicht mehr als 20 h).
      Hinweis: Die Menge der Dispase Lösung kann berechnet werden, mit 10 mL Dispase-Lösung für die Verdauung von jedem Gramm Gewebe.
  2. Trennung von der Epidermis der Hautgewebe
    1. Am zweiten Tag die Epidermis von der Dermis, die mit einer feinen Pinzette abziehen.
      Hinweis: Ist es schwierig, die Oberhaut abziehen, war die Dispase Verdauung nicht ausreichend, die ist in der Regel aufgrund unzureichender Trimmen des Gewebes. In diesem Fall braucht das Gewebe eine längere Inkubationszeit.
    2. Hacken Sie die geschälte Epidermis mit 500 µL Zellkulturmedium in ein Gewebe Gülle mit Skalpellklingen; dann, mit 10 mL von 0,25 % Trypsin in einen 50-mL-Tube Aufschwemmen Sie und inkubieren Sie es 20 Minuten in einem Wasserbad bei 37 ° C mit schütteln.
  3. Sammlung und Kultivierung von Primärzellen
    1. Neutralisieren Sie die Trypsin-Aktivität durch ein gleiches Volumen der Neutralisierung-Lösung (10 mL in diesem Protokoll) hinzufügen.
    2. Die epidermalen Zellen durch die Lösung nach oben und unten 20 X mit einer serologischen 10-mL-Pipette pipettieren zu distanzieren und ein 100 µm Zelle Sieb, alle restlichen Gewebe Ablagerungen zu entfernen die Zelle Lösung durchlaufen.
    3. Zentrifugieren Sie die Zelle Lösung bei 200 X g für 5 min nach der Filtration; Aufschwemmen der Zelle Pellet in Neutralisation Mittel zum Waschen und anschließend Zentrifugieren es wieder bei 200 X g Zelle Pellet zu erhalten.
    4. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Medium Low-Calcium, serumfreien Keratinozyten (SFM). Nehmen Sie 10 µL dieser Lösung auf die Ergebniszelle Anzahl und dann Platte ca. 2 x 106 Zellen mit 10 mL der SFM in 100 mm Zelle Kultur Gerichte vorbehandelt mit Beschichtung Matrix (mit Typ I Kollagen).
      Hinweis: Die Beschichtung ist ein notwendiger Schritt für die konventionelle Methode.
    5. Ändern Sie das Kulturmedium jeden 2 d.
      Hinweis: Überprüfen Sie die Zelladhäsion unter dem Mikroskop, vor und nach der Änderung des Kulturmediums.
    6. Durchgang der Zellen, wenn sie etwa 80 % erreichen Zusammenfluss.
      Hinweis: Alle Kultur-Gerichte sind mit der Matrix-Beschichtung vorbehandelt.

(3) die neue Methode

  1. Haut-Gewebe-Vorbehandlung
    1. Sammeln Sie das Gewebe wie beschrieben oben (Schritt 2.1) für die konventionelle Methode.
    2. Waschen Sie das Hautgewebe 1 X mit 10 mL PBS und dann in einen sterilen Behälter aus Kunststoff durch eine elektronische Waage (das Gewicht ist etwa 1 g in diesem Protokoll) wiegen.
      Hinweis: Das Mindestgewicht des Gewebes benötigt für dieses Protokoll ist 0,1 g, da es schwierig ist, eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, wenn die Gewebeprobe verwendet zu klein ist. Es gibt keine maximale Gewicht des Gewebes für dieses Protokoll, die letztlich die Umschlagskapazität des Betreibers abhängt.
    3. Pinzette verwenden, um das Hautgewebe mit 10 mL 70 % igem Ethanol für 30 spülen s.
    4. Inkubieren Sie das Gewebe 2 X mit 10 mL Lösung (in Schritt 2.1.1 vorbereitet), für 5 min jedes Mal zu waschen.
      Hinweis: Alle oben aufgeführten Waschschritte sind im 100-mm-Zelle Kultur Gerichte in einem Laminar-Flow-Kapuze (Gewebekultur Kapuze) durchgeführt.
    5. Übertragen Sie das Gewebe auf eine andere Zelle 100 mm steril Kulturschale.
    6. Verwendung von Skalpellklingen, Hackfleisch das Gewebe gründlich in ein Gewebe Gülle.
    7. Fügen Sie 200 µL PBS alle 5 min., um das Gewebe feucht zu halten.
      Hinweis: Nehmen Sie ca. 15 min für Schritte 3.1.5 - 3.1.7. Die oben genannten Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.
  2. Verdauung von Hautgewebe
    1. Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe-Lösung in eine 50-mL-Tube. Fügen Sie 10 mL Enzym Mischung für je 1 g von Hautgewebe. Mischen Sie die Enzyme mit dem homogenisierte Gewebe gründlich.
    2. Inkubieren Sie die Mischung mit schütteln in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1 h.
    3. Fügen Sie ein 1/5 Volumen von 0,25 % Trypsin (2,5 mL in diesem Protokoll) auf die Verdauung-Mischung für weitere 30 Minuten in einem Wasserbad bei 37 ° C.
    4. Fügen Sie DNase ich Lösung für das Enzym-Gemisch im Verhältnis 1: 100 (V/V) (250 µL in diesem Protokoll) und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Sammlung und Kultivierung von Primärzellen
    1. Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 12,5 mL Neutralisation Medium im Verhältnis 1:1. Pipette die Lösung oben und unten für ungefähr 20 x, mit einer serologischen 10-mL-Pipette, um die Zellen zu trennen.
    2. Filtern Sie die dissoziierten Zellen durch ein 100 µm Zelle Sieb, das Gewebe Ablagerungen zu entfernen. Zentrifugieren des Überstands 200 X g für 5 min. beobachten das Pellet am Boden des Röhrchens.
    3. Verwerfen Sie den überstand und waschen Sie die Zelle Pellet mit 10 mL der Neutralisation Medium und Zentrifuge wieder bei 200 X g für 5 min um die Zellen zu sammeln.
    4. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Inokulation Medium (G-Mittel aus Schritt 1.2.5) mit 10 µM Y-27632.
    5. Nehmen Sie 10 µL der Lösung für die Ergebniszelle Anzahl und dann Platte ca. 2 x 106 Zellen mit 10 mL G-Medium in der Kulturschale 100-mm-Zelle.
      Hinweis: Der precoating Schritt ist nicht erforderlich für die neue Methode, und keine Entfernung der dermalen Schicht ist erforderlich.
    6. Ersetzen Sie nach 3-d die Inokulation Medium mit Low-Calcium SFM Medium. Ändern Sie das Kulturmedium jeden 2 d.
      Hinweis: Überprüfen Sie die Zelladhäsion, vor und nach dem Ändern des Mediums.
    7. Durchgang der Zellen, wenn sie etwa 80 % erreichen Zusammenfluss.
      Hinweis: Gegebenenfalls Vorbehandeln der Zellen mit 0,05 % Trypsin für 2 min und waschen Sie die Zellen mit PBS, dermale Zellen vor trypsinizing der Epidermiszellen verunreinigen zu entfernen.

(4) Zelle Passagierung

  1. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie dann 2 mL 0,05 % Trypsin (pro pro 100 mm Schale).
  2. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator (37 ° C mit 5 % CO2) für 5 min.
  3. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen aus der Kulturschale abgelöst haben.
  4. Fügen Sie 8 mL DMEM mit 10 % FBS zu neutralisieren die enzymatische Reaktion und dann sammeln die Zellen in einem 15-mL-Tube.
  5. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min um die Zelle Pellet zu erhalten.
  6. Den überstand langsam entfernen dann Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 10 mL SFM Medium und die Anzahl der Zellen.
  7. Platte 1 x 106 Zellen mit 10 mL der SFM in jeder Zelle 100 mm Schale.
  8. Verändern Sie das Medium jeder 2 d.

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Representative Results

Schematische Darstellungen der neuen Methode (Abbildung 1A) und der konventionellen Methode (Abbildung 1 b) sind in Abbildung 1dargestellt. Die konventionelle Methode ist eine zweistufige Verdauung, die eine 2-Tages-Verfahren erfordert. Die neue Methode ist dagegen eine einstufige Verdauung, die dauert rund 3 Stunden durchzuführen. Wichtig ist, erhalten die neue One-Step-Methode zwei Populationen (epidermale und dermale Zellen) zur gleichen Zeit, die das Vorhandensein von Y-27632 in der Impfung Medium abhängig. Darüber hinaus die erste Blütezeit von epidermalen Zellen, rund 80 % erreichen Zusammenfluss dauert in der Regel mindestens 3 Tage weniger als die herkömmliche Methode, wenn die gleiche Anzahl von Zellen nach Isolierung geimpft ist.

Die neue Methode bringt mehr primäre epidermale Zellen, die in einer Kolonie Morphologie wachsen. Die isolierten HKCs aus der menschlichen Haut Gewebe wurden geimpft mit G-Medium mit Y-27632. Die gleiche Anzahl von Zellen wurden vernickelt nach der herkömmlichen Methode wie das Steuerelement. Repräsentative Bilder der epidermalen Zellen 3 und 5 Tage nach der ersten Impfung sind in Abbildung 2Aangezeigt. Die Zellen aus der neuen Methode tendenziell als eine Kolonie Morphologie zu wachsen. Die Wachstumskurve nach Inokulation wurde anhand einer Zelle zählen Kit-8 (CCK-8) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inokulation (Abb. 2 b), und die Verdopplungszeit ist ca. 3-4 Tage für Zellen, die durch die neue Methode vorbereitet aber ist etwa 6 bis 8 Tage für die konventionelle Methode. Am 7. Tag waren die Erträge der Zellen berechnet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2, dargestellt, was zeigt, dass die neue Methode dreimal mehr Zellen als die herkömmliche Methode und den Zeitaufwand zum Zusammenfluss erreichen ergab nach der ersten Impfung mindestens 3 Tage war weniger (Abb. 2D). Tag 7 erreichte die Epidermiszellen Zusammenfluss mit der neuen Methode, aber nicht mit der konventionellen Methode (Abb. 2D).

Die neue Methode verbessert die Expression von α6-Integrin durch die PV-Zellen. Α6-Integrin nachweislich stark durch epidermale Stammzellen15zum Ausdruck gebracht werden. Zellen, die durch die neue Methode isoliert gepflegt die Merkmale der Haut Basalzellen nach mehreren Durchgängen. Koloniewachstum ist eines der Merkmale der epidermalen Stammzellen aus der basalen Schicht der Haut, und ein hohes Maß an α6-Integrin-Expression ist ein weiteres Merkmal dieser epidermalen Stammzellen. Wir fanden, dass die Zugabe von Y-27632 deutlich die Expression von α6-Integrin in Epidermiszellen in der Passage 3 (Abbildung 3A-B erhöht), und in der Passage 3, epidermale Zellen isoliert, mit der neuen Methode keine Kontamination durch dermal Zellen zeigen 13. es ist sehr wichtig, die basale Zellen nach mehreren Durchgängen bei in Vitro Expansion pflegen. Immunfluoreszenz (IF) Analyse der basalen Zelle Marker Keratin 5 und das terminal Differenzierung Marker Loricrin16 wurde nach drei Passagen mit diesen Zellen durchgeführt. Wir fanden, dass 90 % aller Zellen K5-positiv waren, aber weniger als 10 % von ihnen Loricrin (Abbildung 3 - 3D geäußerten). Diese Ergebnisse zeigen, dass primäre HKCs isoliert mit der neuen Methode eine epidermale Stammzellen-Bevölkerung enthalten und die charakteristischen Merkmale der Basalzellen unterhalten können. Aber je länger, dass HKCs passagiert sind, desto mehr fangen sie an zu differenzieren. Durch die neue Methode fanden wir, dass epidermalen Zellen kultiviert in Vitro ihre Verbreitung Fähigkeit bis Durchgang 8 behaupten konnte. Zu guter Letzt haben wir die Reinheit von epidermalen Zellen isoliert, mit der neuen Methode, da eine Mischung aus epidermalen und dermalen Zellen direkt nach Isolierung geimpft wurde getestet. Bei einer kurz (2-3 min.) Behandlung mit Trypsin, wenige dermale Zellen verunreinigen die ursprüngliche Kultur zu entfernen wurde eine relativ reine Bevölkerung von epidermalen Zellen nach einer Passage (Abbildung 4) erhalten.

Figure 1
Abbildung 1 : Vergleich der neuen und herkömmlichen Isolierungsmaßnahmen. (A) dieses Panel zeigt eine schematische Darstellung der neuen Isolierung Methode. Am 1. Tag werden die dissoziierten Hautzellen in G-Medium mit oder ohne Y-27632 geimpft. In Anwesenheit von Y-27632 für 2 Tage erweitern die epidermalen Zellen gezielt. Am ganzen Tag 6, erreichen der Zellen einer Dichte ausreichend für passagierung. (B) dieses Panel zeigt eine schematische Darstellung des konventionellen Isolationsmethode. Die Epidermis von der Dermis getrennt ist die Epidermiszellen sind am 2. Tag isoliert und in der Regel erreichen die Zellen eine Dichte ausreichend für passagierung rund 10 Tage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Die neue Isolationsmethode erhöht den Ertrag des primären Epidermiszellen. (A) dieses Panel zeigt Vertreter Bilder von epidermalen Zellen, die durch die neue Methode (obere Reihe) und nach der konventionellen Methode (untere Zeile) auf 3 und 5 Tage nach der ersten Impfung vorbereitet. Der Maßstabsbalken = 200 µm. (B) primäre HKCs vorbereitet durch das neue und das konventionelle Methoden wurden zu den angegebenen Zeitpunkten für die Analyse der lebensfähigen Zellen mit einer Zelle zählen Kit-8 (CCK-8) gesammelt. (C) die Gesamtzahl der Zellen durch die neue Methode vorbereitet und von der konventionellen Methode wurden am 7. Tag nach der Inokulation gezählt. (D) ist die durchschnittliche Zeit, Zusammenfluss von primären Epidermiszellen (Abschnitt 0) zu erreichen für die neue Isolationsmethode und der konventionellen Methode gezeigt. Für Platten B - D: der Student t-Test wurde verwendet; die Fehlerbalken zeigen die Standardvariante; n = 4; p < 0,01 * p < 0,05 vergleicht man die neue Methode mit der konventionellen Methode. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Primäre epidermale Zellen erhalten durch die neue Methode sind in der Lage weiterhin Basalzell-Funktionen während der in-vitro- Erweiterung. (A) dieses Panel zeigt eine FACS-Analyse der α6-Integrin Ausdruck der Epidermiszellen in der Passage 3 mit Y-27632 (Y-27632, rot) behandelt oder ohne Y-27632 (Control, grau) für 48 h (B) dieses Panel zeigt eine Quantifizierung Analyse der Zellen mit hoher Expression Level voller α6-Integrin aus Schalttafel A; hohen α6-Integrin Ausdruck ist definiert als ein Signal > 103, ** p < 0,01. (C) zeigt dieses Panel repräsentative Bilder von Immunfluoreszenz-Färbung des K5 (rot) und Loricrin (rot); DAPI (blau) wurde verwendet, um die Kerne zu beflecken. Der Maßstabsbalken = 100 µm. (D) dieses Panel zeigt eine Quantifizierung Analyse der K5 - und Loricrin-positiven Zellen. Insgesamt 400 Zellen gezählt werden, um jede Gruppe zu quantifizieren, und die durchschnittliche Zahl der K5 - und Loricrin-positiven Zellen gezeigt. Das Experiment wurde unabhängig 4 Mal wiederholt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Nach dem ersten Durchgang wurden relativ reine Epidermiszellen mit der neuen Methode erhalten. (A) dieses Panel zeigt repräsentative Bilder der Immunfluoreszenz Färbung von Vimentin (rot) für die Epidermiszellen an Stellen 0 (P0) und 3 (P3); DAPI (blau) wurde verwendet, um die Kerne zu beflecken. Der Maßstabsbalken = 50 µm. (B) dieses Panel zeigt eine Quantifizierung Analyse von Vimentin-positiven Zellen auf Passagen 0 (P0) und 1 (P1). Insgesamt 400 Zellen gezählt werden, um jede Gruppe zu quantifizieren, und die durchschnittliche Anzahl von Vimentin-positiven Zellen wird angezeigt. Das Experiment wurde unabhängig 4 Mal wiederholt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Kultivierte primäre HKCs haben häufig genutzt, um Wunden in Kliniken mehr als drei Jahrzehnte lang zu behandeln, und seit dieser Zeit wurde es immer wichtig, ausreichende Zahl von Zellen für klinische Anwendungen in einer fristgerechten Weise effizient zu erhalten. Daher erschwert in der Praxis, die herkömmliche Isolierung-Methode, die die Trennung der Epidermis von der Dermis erfordert, diese Anforderungen durch die geringe Ausbeute an Zellen und die geringe Fähigkeit, adulte Zellen die passage. Hier beschreiben wir eine neue einfache Methode, die wir entwickelt, um effizient zu erhalten HKCs von Erwachsenen Gewebe basierend auf vorherigen Berichte13,14, was eignet sich besser für Labor und klinische Anwendungen.

Die folgenden kritischen Schritte muss man Aufmerksamkeit zu erzielen die besten Ergebnisse für die neue Methode. Erstens ist die Homogenisierung Verfahren einen entscheidenden Schritt; ungenügende Homogenisierung wird deutlich die Effizienz der enzymatischen Verdauung und führen zu einer geringen Ausbeute von dissoziierten Zellen beeinflussen. Zweitens sollte die Trypsin-Verdauung-Schritt nicht mehr als 30 Minuten dauern; Andernfalls wird die Lebensfähigkeit der dissoziierten Zellen verringern. Drittens sollte um die dissoziierten Zellen effizient zu sammeln, die Porengröße der Zelle Sieb verwendet für die Filtration 100 µm, und ein einzelnes Sieb sollte nicht mehr als 20 mL der Lösung Zelle Filtern verwendet werden. Viertens ist die Dichte an die ursprüngliche Beschichtung ein wichtiger Faktor um Kontaminationen mit dermalen Zellen zu minimieren weil eine hohe Zelldichte die hemmende Wirkung des Y-27632 auf dermale Zellen deutlich gesenkt werden. Daher ist es entscheidend, genau die Gesamtzahl der dissoziierten Zellen am Ende des Verfahrens vor der Beschichtung Isolierung zählen.

Zunächst vereinfacht die neue Methode der Isolierung Verfahren: herkömmliche Isolierung Zweischrittverfahren dauert in der Regel 2 Tage durchführen, und der Fräsvorgang ist entscheidend für das Fettgewebe aus der Haut, insbesondere bei adulten Geweben ( vollständig zu entfernen Abbildung 1); Andernfalls wird eine ineffiziente Trennung der Epidermis von der Dermis nach Übernachtung Verdauung mit Dispase sein. Unter Ausnutzung des Y-27632, das hemmt das Wachstum von dermalen Zellen nach Inokulation13muss die neue Methode nicht die Epidermis von der Dermis zu trennen, und daher der Fräsvorgang das Fettgewebe zu entfernen ist nicht notwendig für das neue Methode, die braucht nur einen halben Tag durchgeführt werden. Zweitens vereinfacht die neue Methode auch das Kultur-Verfahren, da mit der traditionellen Methode der dissoziierten Zellen in der Regel auf einem Zubringer-Layer der bestrahlten Maus-Fibroblasten in 10 %-haltigem Medium kultiviert werden FBS oder in einer Kollagen-vorbeschichteten Schale. Tierische Komponenten sind immer Risikofaktoren, die für klinische Anwendungen vermieden werden sollte. Wir entwickelten ein konditionierten Inokulation serumfreien Medium (G-Mittel), erfordert keine precoating Schritt für Kultur Gerichte und verbessert auch die Ausbeute an primären Keratinozyten13 , weil G-Medium kombiniert mit Y-27632 die Befestigung der fördert Epidermiszellen der Kultur Gericht13,17,18. Daher ist die neue Methode erleichtert das Kultur-Verfahren und ist auch ein relativ sicheres Verfahren für klinische Anwendungen ohne Zusatz von tierischen Komponenten. Drittens: die neue Methode verbessert die Ausbeute an primären Epidermiszellen und verkürzt die ursprüngliche Kultur Zusammenfluss erreichen musste. Verglichen mit der traditionellen Methode, die Ausbeute an Zellen produziert durch die neue Methode ist etwa 3 mal höher, und der ersten Durchgang der Epidermiszellen Zusammenfluss erreicht mindestens 3 Tage früher (Abbildung 2). Schließlich kann die neue Methode genutzt werden, für die Isolierung von epidermalen Zellen aus allen Arten von Haut-Proben, wie behaarte Kopfhaut und Erwachsenen Hautgewebe mit einer dicken Fettschicht, die in einem früheren Bericht13getestet wurden.

Primäre HKCs High Potentials haben für Laborforschung und klinische Anwendungen weit verbreitet. Diese neue Methode erhöht das Potenzial der kultivierten Zellen mit Merkmalen der epidermalen Stammzellen13. Y-27632 erhöht die α6-Integrin-Expression HKCs, und nach drei Durchgängen, mehr als 90 % der kultivierten epidermalen Zellen ausgedrückt der basalen Zelle Marker Keratin 5 und weniger als 10 % der Zellen ausgedrückt die Differenzierung Markierung Loricrin, darauf hinweist, dass Diese Zellen behalten die Eigenschaften der Haut Basalzellen nach mehreren Durchgängen. Die Kultur erweitert Epidermiszellen können Haut in Vivo nach Verpflanzung13, was darauf hindeutet, dass sie mögliche Regeneration nach einer Expansion in Kultur besitzen wiederherzustellen. Die neue Methode eignet sich vor allem aus adulten Geweben, Zellen zu isolieren, wie oben erwähnt. Daher Epidermiszellen vorbereitet durch diese Methode können verwendet werden, für in-Vitro und in Vivo Modellen um Hautkrankheiten zu studieren und in autologen Zell-basierte Produkte für klinische Anwendungen wie die Behandlung von Hautwunden entwickelt werden können.

Zusammenfassend lässt sich sagen enthält das neue Protokoll eine vereinfachte und effektive Prozedur zum isolieren und primäre Epidermiszellen aus Erwachsenen Hautgewebe zu erweitern. Diese fortschrittliche Methode eignet sich eher für die Herstellung von großen Zahlen von High Potentials epidermalen Zellen für Labor und klinische Anwendungen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), das allgemeine Programm der National Natural Science Foundation of China (NSFC, 81772093), der Wissenschaft und Technologie Entwicklung Programm von Suzhou (ZXL2015128), der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20161241), und ein Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting 
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker Shanghai Boxun 150036 For water bath
Electronic Scale Harbin Zhonghui 1171193 For tissue weighing
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifuge
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science  P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HKC dissociation
0.25% Trypsin  Beijing Solarbio Science & Technology T1350-100 For HKC dissociation
Coating Matrix Kit Life Technologies R-011-K For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HKC isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HKC isolation
Deoxyribonuclease I Sigma 9003-98-9 For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Thermo Scientific NC9864731 cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 Hewlett-Packard Development Company MA-20142 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin Covance PRB-145p For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3) Santa Cruz  SC-19622 flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC Santa Cruz  SC-2831 negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 138 menschlichen Keratinozyten epidermale Stammzellen dermal Zellen primären Haut Zelle isoliert Keratinozyten Kultur Y-27632 Rho-assoziierten Kinase-Inhibitor Regeneration der Haut
Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren
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Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou, Q., Zhou, C., Zhao, H., Wu, X. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57784, doi:10.3791/57784 (2018).

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