Summary
Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.
Abstract
Taze cilt dokularının ve kendi genişleme vitro izole birincil insan Lenfositi yaygın olarak laboratuvar araştırma ve klinik uygulamaları için kullanılmaktadır. İnsan Lenfositi geleneksel yalıtım yöntemi nedeniyle düşük hücre kurtarma hızı ve düşük hücre yetişkin dokulara gelen primer hücre oluşturmak için verimsiz olduğu kanıtlanmış bir iki adım sıralı enzimatik sindirim yordamı içerir canlılığı. Biz son zamanlarda Orta Rho kinaz inhibitörü Y-27632 kullanan insan birincil epidermal progenitör hücrelerin cilt dokularının yalıtmak için gelişmiş bir yöntem bildirdi. Geleneksel iletişim kuralı ile karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem daha basit, daha kolay ve daha az zaman alıcı ve epitel kök hücre verim artar ve kök hücre özellikleri geliştirir. Ayrıca, yeni metodoloji dermis epidermis ayrılması does değil istemek ve, bu nedenle, farklı türdeki yetişkin doku hücreleri yalıtmak için uygundur. Bu yeni yalıtım yöntemi geleneksel yöntemlerle önemli eksiklikleri üstesinden gelir ve daha yüksek güç için laboratuar ve klinik uygulamalar için ile çok sayıda epidermal hücre üretmek için uygundur. Burada, yeni yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Introduction
Amaç birincil insan keratinositler (HKCs)--dan yetişkin dokular, özellikle klinik uygulamalar için yalıtmak için basit ve etkili bir iletişim kuralı geliştirmekti. Cilt epidermal kök hücreleri, deri, bazal tabaka içinde lokalize çoğalırlar ve ayırt etmek ve cilt1,2,3, fonksiyonlarını korumak için Lenfositi sağlamak için yüksek bir potansiyele sahip 4. deri dokuları yaygın cilt doku mühendisliği ve yenilenme amacıyla kullanılan, özellikle hasarlı cilt onarım ve gen tedavisi için klinik uygulamaları5,6izole HKCs. Önemli HKC tabanlı uygulamalar için etkili bir şekilde izole ve HKCs çok sayıda yüksek potansiyel vitro7,8ile genişletin konudur. Çeşitli araştırma grupları kök benzeri HKCs kültürleri üretmek için yöntemler geliştirdik, bu yöntemler bazen düşük hücre verimleri ve cilt numune türü tarafından sınırlı olmak gibi diğer kısıtlamalar bulunmaktadır ve gerçekleştirmek karmaşık ve zaman alıcı olmakla birlikte 9kullanılır. Örneğin, HKCs cilt dokularının yalıtmak için geleneksel yöntem iki aşamalı enzimatik sindirim epidermis bir ayırma DermIS6ile karıştırmak. Bu yöntem genellikle de yenidoğan dokular için çalışıyor, ama yetişkin doku hücreleri izole etmek için kullanıldığında çok zor olur.
Y-27632, Rho ilişkili protein kinaz (kaya), bir inhibitörü bildirilmiştir önemli ölçüde epidermal kök hücre izolasyon ve koloni büyüme10,11,12verimliliği artırmak için. Bir önceki çalışmada, keşfettiğimiz Y-27632 epidermal hücrelerin klonal büyümesini kolaylaştıran ama differentially adezyon molekülleri13ifade kontrol ederek deri hücreleri verimini azaltır. Ayrıca büyüme ve verim birincil epidermal hücre destekler G-Orta adı verilen yeni bir şartına aşılama orta kurduk. G-Orta Y-27632 ile birleştirerek, bu roman yöntemi kendiliğinden böylece epidermis-DermIS ayrılık13,14adım kaldırma enzim sindirim sonra epidermal ve dermal hücreleri ayırabilirsiniz. Önceki raporlara dayanarak, biz şimdi detaylı HKCs yetişkin cilt dokusundan ayırmak için bu yeni yöntemin açıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol için kullanılan insan doku kurumun insan Araştırma Etik Komitesi kurallarına göre ele (NO.2015120401, tarihi: 12 Mayıs 2015).
1. hazırlıkları
- Plastik cerrahi ile buz gibi Dulbecco 10 mL 50 mL tüp Hastanesi'nde üzerinden atılan toplamak taze yetişkin karın cilt dokularının kartal Orta (DMEM) değiştiren. Örnek, hücre canlılığı önemli ölçüde etkilemeden en fazla 72 saat için 4 ° C'de tutulabilir.
- Reaktifler ve kültür orta aşağıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
- 1 mL penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 mg/L) 50 mL fosfat tamponlu çözeltisi (PBS) yıkama çözüm hazırlamak için ekleyin.
- İki enzim sindirim çözümler kümesi hazırlamak: (1) dispase (DMEM içinde 2.5 mg/mL) 50 mL hazırlamak ve 50 mL tip ı collagenase (2.5 mg/mL DMEM) ayrı ayrı geleneksel yöntemi; ve (2) 50 mL dispase karışımı hazırlamak ve tip ı collagenase (erime 125 mg dispase tozu ve 125 mg tip ı collagenase toz DMEM 50 mL) yeni yöntem için.
Not: Tüm enzim çözümler olmalı bir 0,22-µm süzgeç ile filtre ve sürekli at4 ° C. - Her iki yöntem için sindirim çözümleri hazırlamak: % 0.05 tripsin ve % 0.25 tripsin ticari olarak satın. Bir 10 mg/mL DNaz hazırlamak ben 50 mg 5 mL PBS, toz DNaz eriterek tarafından çözüm 0,22-µm süzgeç ile filtre ve -20 ° C'de depolayın
- Orta enzimatik sindirim nötralize etmek için 500 mL hazırlamak: DMEM orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiştir.
- Aşı Orta (G-Orta olarak adlandırılan büyüme faktörü içeren orta,) 500 mL hazırlamak: içeren % 1 penisilin/streptomisin, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), DMEM/F12 (3:1) orta ve %2 B27 ek.
- 100-mm hücre kültürü pretreat yemekleri kaplama matris türünü içeren 2 mL ile ben kollajen, oda sıcaklığında 30 dakika.
2. geleneksel Yöntem
-
Cilt doku Önarıtma
- 1,5 cm2 cilt dokusunun almak ve yıkayın 1 x 10 mL PBS; o zaman, 10 mL % 70 etanol için 30 ile durulayın s ve o kuluçkaya 2 x 10 mL, 5 min çözüm (PBS) % 2 penisilin ve streptomisin içeren, yıkama ile.
Not: Tüm yıkama 100-mm hücre kültür yemekleri bir laminar akış başlık içinde gerçekleştirilir. - Deri altı yağ tabakası bir 100-mm hücre kültür çanağı kaldırmak ve sonra (Bu iletişim kuralı 1 g ağırlığıdır) deri dokusu tartmak için steril makasla doku kırpın.
Not: Yeterli düzeltme dermis çok epidermis verimli ayrılması için çok önemlidir. Sarımsı yağ katman kolayca görsel olarak ayırt edilebilir. - Ve aşağı başka bir 100-mm Steril çanak DermIS tarafı ile doku transfer, o zaman, cilt dokusu bir neşter bıçak kullanarak 3 - için 4-mm-geniş şeritler halinde kesin.
Not: DermIS yan yağ tabaka ile kolayca görsel olarak kabul edilmektedir. - 100-mm kültür tabağına cilt dokularının 10 mL 2.5 mg/mL dispase çözeltisi ekleyin ve sonra bir gecede 4 ° C'de (en fazla 20 h) çanak kuluçkaya.
Not: Dispase çözüm miktarı her gram doku sindirim için 10 mL dispase çözeltisi kullanılarak hesaplanabilir.
- 1,5 cm2 cilt dokusunun almak ve yıkayın 1 x 10 mL PBS; o zaman, 10 mL % 70 etanol için 30 ile durulayın s ve o kuluçkaya 2 x 10 mL, 5 min çözüm (PBS) % 2 penisilin ve streptomisin içeren, yıkama ile.
-
Epidermis ayrılması deri dokusu
- İkinci gün, iyi Cımbız kullanarak dermis epidermis akasındaki.
Not: epidermis soyma zorsa, dispase sindirim hangi genellikle yetersiz doku düzeltme nedeniyle olduğunu yeterli değildi. Bu durumda, doku daha uzun bir kuluçka süresi gerekir. - Hücre kültür ortamının 500 µL ile soyulmuş epidermis neşter bıçakları kullanarak bir doku Bulamaç kıyma; daha sonra 10 mL % 0.25 tripsin bir 50 mL tüp ile resuspend ve 37 ° C'de sallayarak ile bir su banyosu içinde 20 dk kuluçkaya.
- İkinci gün, iyi Cımbız kullanarak dermis epidermis akasındaki.
-
Toplama ve primer hücre kültürü çalışmalarının
- Tripsin etkinlik nötralize çözüm (bu Protokolü 10 mL) eşit bir hacmi ekleyerek etkisiz hale getirin.
- Çözüm yukarı ve aşağı 20 x 10 mL serolojik pipet ile pipetting tarafından epidermal hücrelerin ayırmak ve hücre çözümü herhangi bir kalıntı doku enkaz kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
- Hücre çözümü 200 x g 5 min için de filtrasyon sonra santrifüj kapasitesi; hücre Pelet nötralizasyon orta yıkama resuspend ve sonra tekrar hücre Pelet elde etmek için 200 x g santrifüj kapasitesi.
- Hücre Pelet düşük kalsiyum, serum-Alerjik keratinosit Orta (SFM) 10 mL resuspend. Bu çözümün Toplam hücresini saymak ve sonra SFM 10 mL içine kaplama matris ile ön işleme 100-mm hücre kültür yemekler ile yaklaşık 2 x 106 hücre plakası için 10 µL al (içeren tip ı kollajen).
Not: Kaplama geleneksel yöntem için gerekli bir adımdır. - Kültür orta her 2 d değiştirin.
Not: bir mikroskop altında hücre adezyon önce ve kültür orta değiştirdikten sonra kontrol edin. - Yaklaşık % 80 ulaştığında hücreleri geçiş izdiham.
Not: Tüm kültür yemekleri ile kaplama matris ön işleme.
3. yeni yöntemi
-
Cilt doku Önarıtma
- Doku açıklandığı gibi yukarıdaki (adım 2.1) geleneksel yöntem için toplamak.
- Deri dokusu 1 yıkama x 10 mL PBS ile ve daha sonra tartmak bir steril plastik kap içinde elektronik bir ölçek (ağırlığı ise yaklaşık 1 g bu protokolü) tarafından.
Not: kullanılan doku örnek çok küçük ise hücreler yeterli sayıda elde etmek zor olduğundan 0.1 g, doku bu iletişim kuralı için gerekli minimum ağırlık olur. Sonuçta operatör işleme kapasitesine bağlıdır bu iletişim kuralı için doku yok maksimum ağırlık vardır. - 10 mL % 70 etanol için 30 ile deri dokusu durulama için forseps kullanın s.
- Doku 2 kuluçkaya x 10 mL, 5 min için (adım 2.1.1 hazır) çözüm her zaman yıkama ile.
Not: yukarıda belirtilen tüm çamaşır adımlar 100-mm hücre kültür yemekleri laminar akış hood (doku kültürü hood) içinde gerçekleştirilir. - Doku başka bir 100-mm hücre kültür steril yemek için transfer.
- Neşter bıçakları kullanarak, doku iyice bir doku Bulamaç kıyma.
- 200 µL her 5 dk PBS, ıslak mendil tutmak için ekleyin.
: Dikkat adımları 3.1.5 - 3.1.7 yaklaşık 15 dakikadır. Yukarıdaki tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
-
Sindirim cilt dokusunun
- Homojenize doku çözüm 50 mL tüp içine aktarın. 10 mL cilt dokusunun her 1 g için enzim karışımı ekleyin. Enzimler homojenize kurcalayarak iyice karıştırın.
- 1s için 37 ° C'de bir su banyosunda sallayarak ile karışımı kuluçkaya.
- Başka bir 30 dk 37 ° C'de bir su banyosu içinde sindirim karışımı için % 0.25 tripsin (Bu iletişim kuralı 2.5 mL) 1/5 hacmi ekleyin
- DNaz ekleyin ben çözüm 1: 100 (v/v) oranında (Bu protokolündeki 250 µL) enzim karışımı ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
-
Toplama ve primer hücre kültürü çalışmalarının
- 1:1 oran içinde 12,5 mL nötralizasyon orta ekleyerek sindirim işlemini durdurun. Çözüm yukarı ve aşağı yaklaşık 20 x 10 mL serolojik pipet hücreleri ayırmak için kullanma için pipette.
- Disosiye hücreleri doku enkaz kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Süpernatant 200 x g 5 dk. gözlemlemek Pelet tüpün dibinde de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant atmak ve nötralizasyon orta ve santrifüj 10 mL ile hücre Pelet tekrar 200 x g hücreleri toplamak 5 min için de yıka.
- Hücre Pelet aşılama Orta (adım 1.2.5 G-Orta) 10 ml Y-27632 10 µM ile resuspend.
- Toplam hücre sayar ve ardından, G-Orta 10 mL 100-mm hücre kültür çanak içine ile yaklaşık 2 x 106 hücre plakası için çözüm 10 µL al.
Not: Precoating adım yeni yöntemi için gerekli değildir ve hiçbir kaldırma dermal tabakanın da gereklidir. - 3 d sonra aşı orta düşük kalsiyum SFM orta ile değiştirin. Kültür orta her 2 d değiştirin.
Not: hücre adezyon önce ve orta değiştirdikten sonra kontrol edin. - Yaklaşık % 80 ulaştığında hücreleri geçiş izdiham.
Not: gerekirse, % 0.05 tripsin 2 min için hücrelerle pretreat ve deri hücreleri epidermal hücrelerin trypsinizing önce kirletici kaldırmak için PBS hücrelerle yıkayın.
4. hücre Passaging
- Orta kaldırmak, PBS hücrelerle yıkayın ve ardından, 2 mL % 0.05 tripsin (başına her 100-mm çanak) ekleyin.
- 5 min için bir kuluçka (37 ° C % 5 CO2) hücrelerde kuluçkaya.
- Tüm hücreler kültür çanak ayırdıktan emin olmak için bir mikroskop kullanarak hücreleri denetleyin.
- DMEM 8 mL % 10 ile ekleyin FBS enzimatik reaksiyon etkisiz hale getirmek ve daha sonra bir 15 mL tüp hücreleri toplamak için.
- 200 x g hücre Pelet elde etmek 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Yavaş yavaş süpernatant kaldırmak ve, sonra hücre Pelet SFM orta 10 mL ile resuspend ve hücreleri saymak.
- 1 x 106 hücre SFM 10 mL her 100-mm hücre çanak içine ile plaka.
- Her 2 d orta değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şematik diyagramları yeni yöntemi (resim 1A) ve geleneksel Yöntem (Şekil 1B) Şekil 1' de sunulmaktadır. 2 günlük yordamı gerektirir bir iki adım sindirim geleneksel yöntemdir. Buna karşılık, en yeni yöntemdir gerçekleştirmek için yaklaşık 3 saat sürer bir tek adımlı sindirim. Önemlisi, tek adımlı Yöntem Y-27632 varlığı aşılama orta bağlıdır aynı anda iki popülasyonun (epidermal ve dermal hücreleri) edinebilirsiniz. Ayrıca, ilk kültür zaman aynı sayıda hücre izolasyon sonra aşı epidermal hücrelerin % 80 civarında ulaşmak için izdiham genellikle en az 3 gün geleneksel yöntem daha az alır.
Yeni yöntem bir koloni morfolojisi büyümek tüm birincil epidermal hücre üretir. G-orta ile insan deri dokuları aşısını HKCs izole Y-27632 içeren. Aynı sayıda hücre tabi denetim olarak geleneksel yöntem kaplama. 3 ve 5 gün sonra ilk aşı, epidermal hücrelerin temsilcisi görüntüleri Şekil 2Agösterilir. Bir koloni morfolojisi büyümek eğilimi yeni yöntemi elde edilen hücreleri. Aşılama değerlendirildi kit-8 (CCK-8) aşı (Şekil 2B) sonra farklı zaman noktalarda sayma bir hücre kullanarak ve katlama süresi yaklaşık 3-4 gün yeni yöntemi tarafından hazırlanan hücreler için ama yaklaşık 6-8 gün sonra büyüme eğrisi geleneksel yöntem. Gün 7, hücrelerin sayıları hesaplanır. Sonuçları yeni yöntem geleneksel yöntem ve o daha üç kat daha fazla hücre ilk aşılama en az 3 gün sonra izdiham daha az (Şekil 2B) ulaşmak için gereken süreyi verdiğini gösteren Şekil 2Ciçinde gösterilmiştir. Gün 7, epidermal hücrelerin izdiham yeni yöntemi, ancak değil geleneksel Yöntem (Şekil 2B) ulaştı.
Yeni Yöntem α6-integrin ifade primer hücre tarafından geliştirilmiş. Α6-integrin son derece epidermal kök hücre15tarafından ifade edilebilir olduğu gösterilmiştir. Yeni yöntemle izole hücreler cilt bazal hücre özellikleri sonra çeşitli pasajlar yapılmaktadır. Koloni büyüme epidermal kök hücreleri cilt bazal katmandan türetilmiş özelliklerinden biri, ve α6-integrin ifade yüksek düzeyde epidermal bu kök hücrelerin bir başka özelliğidir. Y-27632 ek α6-integrin passage 3 (Şekil 3A-B), epidermal hücrelerin ifade anlamlı bir artış ve geçiş 3 epidermal hücrelerin yeni yöntemle izole hiç bulaşma deri hücreleri tarafından göstermek bulduk 13. bazal hücre özellikleri sonra çeşitli pasajlar vitro genişleme sırasında korumak çok önemlidir. Bazal Hücre işaretçisi keratin 5 ve terminal farklılaşma işaret loricrin16 ayirt (Eğer) analizi içeren hücreleri sonra üç pasajlar gerçekleştirildi. Bulduğumuz tüm hücrelerin % 90'ı K5-pozitif olduğunu ancak bunların daha az % 10 loricrin (Şekil 3 c - 3D) ifade. Bu sonuçları birincil HKCs izole bir epidermal kök hücre popülasyonu içeren yeni yöntemini kullanarak ve bazal hücre karakteristik özelliklerini koruyabilirsiniz gösterir. Ama artık HKCs pasajlı ki, daha onlar ayırt etmeye başlar. Yeni yöntemle bulduk o epidermal hücrelerin kültürlü vitro nükleer silahların yayılmasına karşı yeteneklerini geçiş 8 kadar korumak olabilir. Son olarak, epidermal hücrelerin epidermal ve dermal hücreleri karışımı şu yalıtım sonra aşı bu yana yeni yöntemi kullanılarak izole saflığı test ettik. Bazı deri hücreleri ilk kültür kirletici kaldırmak için tripsin ile kısa süreli (2-3 dk) tedavi ile nispeten saf Vaha'da epidermal hücrelerin bir geçiş (Şekil 4) sonra elde edildi.
Resim 1 : Yeni ve geleneksel yalıtım yordamlar karşılaştırılması. (A) Bu panel gösterir yeni yalıtım yönteminin şematik gösterimi. Gün 1, Disosiye cilt hücrelerini G-Orta veya Y-27632 olmadan aşı. 2 gün Y-27632 huzurunda epidermal hücrelerin seçici olarak genişletin. 6, hücreleri bir yoğunluk passaging için yeterli ulaşmak. (B) Bu panel geleneksel yalıtım yönteminin şematik gösterimi gösterir. Dermis epidermis ayrılır ve epidermal hücre 2 gün izole ve genellikle, yaklaşık 10 gün passaging için yeterli bir yoğunluk hücreleri ulaşmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Yeni yalıtım yöntemini birincil epidermal hücrelerin verimini artırır. (A) Bu paneli gösterir temsilcisi görüntüleri epidermal hücre yeni yöntemi (üst satır) ve geleneksel Yöntem (alt satır) tarafından 3 ve 5 gün sonra ilk aşı hazır. Ölçek çubukları 200 µm. (B) birincil yeni ve geleneksel tarafından hazırlanan HKCs = yöntemleri kit-8 (CCK-8) sayma bir hücre kullanarak hücrelerin analizi için belirtilen zaman puan toplanan. (C) yeni yöntemi tarafından hazırlanan ve 7 gün sonra aşılama, geleneksel yöntemle sayıldı hücre toplam sayısı. (D) yeni yalıtım yöntemini ve geleneksel yöntem için izdiham birincil epidermal hücre (geçit 0) ulaşmak için geçen ortalama süre gösterilir. Panelleri B - D: öğrenci t-testi kullanılmıştır; hata çubukları standart varyasyon gösterir; n = 4; p < 0,01, * p < 0,05 ne zaman yeni yöntemi geleneksel yöntemi ile karşılaştırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Yeni yöntemle elde edilen birincil epidermal hücrelerin Bazal Hücre Özellikleri sırasında korumak mümkün vitro genişleme. (A)Bu panel gösterir Y-27632 (Y-27632, kırmızı) ile tedavi FACS analizini α6-integrin ifade geçiş 3, epidermal hücrelerin veya Y-27632 (kontrol, gri) 48 h. (B) için olmadan bu panel hücreleri yüksek bir miktar analizini gösterir α6-integrin panelinden Adüzeyde ifade; yüksek α6-integrin ifade bir sinyal > 103olarak tanımlanan ** p < 0,01. (C) Bu panel ayirt K5 (kırmızı) ve loricrin (kırmızı); boyama temsilcisi görüntüleri gösterir. DAPI (mavi) çekirdeği leke için kullanıldı. Ölçek çubukları = 100 µm. (D) Bu panel gösterir bir miktar analiz K5 ve loricrin pozitif hücre. Toplam 400 hücre sayılır her grup ölçmek için ve K5 ve loricrin pozitif hücrelerinin ortalama numaraları gösterilir. Deneme bağımsız olarak 4 kez tekrarlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : İlk geçiş sonra nispeten saf epidermal hücrelerin yeni yöntemi kullanarak elde edildi. (A) Bu panel gösterir temsili resimleri boyama ayirt (kırmızı) vimentin epidermal hücrelerin, pasajlar 0 (P0) ve 3 (P3); DAPI (mavi) çekirdeği leke için kullanıldı. Ölçek çubukları = 50 µm. (B) Bu panel gösterir vimentin pozitif hücre pasajlar 0 (P0) ve 1 (P1) adlı bir miktar analiz. Toplam 400 hücre sayılır her grup ölçmek için ve vimentin pozitif hücre ortalama sayısı gösterilir. Deneme bağımsız olarak 4 kez tekrarlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kültürlü birincil HKCs yaygın olarak fazla üç yıl için klinikler yaraları tedavi etmek için kullanılan ve o zamandan beri her zaman verimli bir şekilde zamanında yeterli sayıda klinik uygulamaları için hücre elde etmek önemli olmuştur. Bu nedenle, uygulamada, dermis epidermis ayrılması gerektirir, geleneksel yalıtım yöntemini hücrelerin ve yetişkin hücreleri geçiş yeteneği düşük düşük verim nedeniyle bu talepleri karşılamak zor olur. Burada, verimli bir şekilde HKCs için laboratuar ve klinik uygulamalar için daha uygun önceki raporları13,14, temel yetişkin dokusundan elde etmek için geliştirdiğimiz yeni bir basit yöntem açıklanmaktadır.
Dikkat yeni yöntem için en iyi sonuçları elde etmek için aşağıdaki kritik adımlar için ödenmesi gerekmektedir. İlk olarak, homojenizasyon işlemi çok önemli bir adımdır; yetersiz homojenizasyon açıkça enzimatik sindirim ve sonuç düşük verim Disosiye hücrelerin verimliliğini etkiler. İkinci olarak, tripsin sindirim adım daha--dan 30 dk almamalıdır; Aksi takdirde, Disosiye hücre canlılığı azalacak. Üçüncü olarak, verimli bir şekilde Disosiye hücreleri toplamak için filtrasyon sonrasi için kullanilir hücre süzgeç gözenek boyutu 100 µm olmalıdır ve tek bir süzgeç hücre çözümü en fazla 20 mL filtre uygulamak için kullanılmalıdır. Dördüncü olarak, ilk kaplama yoğunluğu kirlenme dermal hücrelerle en aza indirmek için önemli bir faktör çünkü yüksek hücre yoğunluğu Y-27632 deri hücreleri üzerinde inhibitör etkisi önemli ölçüde azaltacaktır. Bu nedenle, doğru bir şekilde önce kaplama yalıtım yordamının sonunda Disosiye hücreleri toplam sayısını saymak çok önemlidir.
İlk olarak, yeni yöntem yalıtım yordamı basitleştirir: iki adım geleneksel yalıtım yordam genellikle gerçekleştirmek için 2 gün sürer ve kesme yordamı tamamen deri, özellikle yetişkin dokuları ( için yağ dokusu kaldırmak çok önemlidir Şekil 1); Aksi takdirde, bir verimsiz ayrılması epidermis dermis gecede sindirim dispase ile sonra olacak. Aşı13sonra deri hücrelerinin büyümesini engeller, Y-27632 yararlanarak yeni yöntem dermis epidermis ayırmak gerekli değildir ve bu nedenle, yağ dokusu kaldırmak için kırpma yordam yeni için gerekli değildir yöntemi, yalnızca yarım gün gerçekleştirilmesi gerekir. Geleneksel yöntemle Disosiye hücreleri genellikle % 10 içeren ortamda radyasyonlu fare fibroblastlar besleyici tabakası üzerinde kültürlü beri ikinci olarak, yeni yöntemi ayrıca kültür yordamı basitleştirir FBS veya kollajen precoated bir tabak içinde. Hayvan kaynaklı her zaman risk faktörleri, klinik uygulamalar için kaçınılması gereken bileşenlerdir. Precoating bir adım kültür yemekleri için gerekli değildir ve G-Orta Y-27632 ile kombine ve eki teşvik çünkü da birincil Lenfositi13 verimini artırır bir şartına aşılama serum-Alerjik Orta (G-Orta), geliştirdiğimiz epidermal hücre kültürüne13,17,18çanağı. Bu nedenle, yeni yöntemi kültür yordamı kolaylaştırır ve ayrıca hayvan kaynaklı bileşenler olmadan klinik uygulamalar için nispeten güvenli bir işlemdir. Üçüncü olarak, yeni yöntem birincil epidermal hücrelerin verimini artırır ve izdiham ulaşmak için gereken ilk kültür süresini kısaltır. Geleneksel yöntem ile karşılaştırıldığında, yeni yöntemle üretilen hücre verimidir yaklaşık 3 kat daha yüksek ve epidermal hücre ilk geçiş izdiham en az 3 gün önce (Şekil 2) ulaştı. Son olarak, yeni yöntemi tüm türlerinden kıllı kafa derisi deri ve bir önceki rapor13' te test kalın bir yağ tabakası ile yetişkin cilt doku gibi cilt örneklerin epidermal hücrelerin izolasyonu için yararlı olabilir.
Laboratuvar araştırma ve klinik uygulamalar için yüksek potansiyel birincil HKCs yaygın olarak kullanılmıştır. Bu yeni yöntem kültürlü hücre potansiyeli epidermal kök hücre13özellikleri ile geliştirir. Y-27632 α6-integrin ifade HKCs ve üç pasajlar, %90 kültürlü epidermal hücrelerin Bazal Hücre işaretçisi keratin 5 ifade ve hücrelerin % 10'dan az farklılaşma işaretçisi olduğunu belirten Loricrin, ifade daha sonra artırır Bu hücreler cilt bazal hücre özellikleri sonra çeşitli pasajlar tutmak. Kültür-genişletilmiş epidermal hücrelerin cilt vivo içinde 13kültür genişleme sonra yenilenme potansiyel sahip düşündüren, aşılama sonra yeniden oluşturmak. Özellikle, yeni yöntem yukarıda da belirtildiği gibi yetişkin dokular, hücrelerden yalıtmak idealdir. Bu nedenle, epidermal hücrelerin bu yöntem tarafından hazırlanan vitro için kullanılabilir ve in vivo cilt hastalıkları çalışma modelleri ve otolog hücre tabanlı ürünlerde cilt yaraları tedavi gibi klinik uygulamalar için geliştirilmiştir.
Özetle, yeni protokol yalıtmak ve yetişkin cilt dokusundan birincil epidermal hücre genişletmek için basit ve etkili bir yordam sağlar. Bu yöntem gelişmiş yüksek potansiyel epidermal hücre için laboratuar ve klinik uygulamalar için çok sayıda üretmek için daha uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı Çin (2017YFA0104604), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, Çin'in (NSFC, 81772093), Genel Program tarafından desteklenmiştir bilim ve Suzhou teknoloji geliştirme programı (ZXL2015128), Jiangsu Eyaleti doğal Bilim Vakfı (BK20161241) ve Shandong Taishan Scholar Ödülü (tshw201502065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C.
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E.
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
