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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57784
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Abstract

Primários queratinócitos humanos isolados dos tecidos da pele fresca e sua expansão em vitro foram amplamente utilizados para pesquisas de laboratório e para aplicações clínicas. O método de isolamento convencional de queratinócitos humanos envolve um procedimento em duas fases sequenciais de digestão enzimática, que tem sido provado ser ineficiente na geração de células primárias de tecidos adultos devido à taxa de recuperação de baixo da célula e célula reduzida viabilidade. Nós recentemente relatou um método avançado para isolar humano primário epidérmico progenitoras de tecidos de pele que utiliza o inibidor de quinase Rho Y-27632 no meio. Comparado com o protocolo tradicional, este novo método é mais simples, mais fácil e menos demorado e aumenta o rendimento de células-tronco epiteliais e melhora suas características de células-tronco. Além disso, a nova metodologia não exige a separação da epiderme da derme e, portanto, é apropriada para isolar células de diferentes tipos de tecidos adultos. Este novo método de isolamento supera as principais deficiências dos métodos convencionais e é mais apropriado para produzir um grande número de células epidérmicas com alta potência para laboratório e para aplicações clínicas. Aqui, descrevemos o novo método em detalhe.

Introduction

O objetivo foi desenvolver um protocolo simples e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários (HKCs) de tecidos adultos, especialmente para aplicações clínicas. Células-tronco epidérmicas da pele, localizadas na camada basal da pele, possuem um alto potencial para proliferar e diferenciar e fornecer queratinócitos para manter as funções da pele1,2,3, 4. HKCs isoladas de pele, tecidos são amplamente utilizados para pele tecido engenharia e regeneração, especialmente na reparação da pele danificada e em terapia gênica para aplicações clínicas5,6. A questão-chave para aplicativos baseados em HKC é eficientemente isolar e expandir um grande número de HKCs com alto potencial em vitro7,8. Apesar de vários grupos de pesquisa, desenvolveram métodos para produzir culturas de haste-como HKCs, esses métodos são, por vezes, demorado e complicado para realizar e tem outras limitações, tais como a célula de baixo rendimento e sendo limitada pelo tipo de amostra de pele usado9. Por exemplo, o método tradicional para isolar a HKCs dos tecidos da pele envolve uma digestão enzimática em duas fases, com uma separação da epiderme da derme6. Esse método geralmente funciona bem para tecidos neonatais, mas torna-se muito difícil quando usado para isolar as células de tecidos adultos.

Y-27632, um inibidor de Rho-associada a proteína quinase (ROCK), tem sido relatado para melhorar significativamente a eficiência das células-tronco epidérmicas isolamento e colônia crescimento10,11,12. Em um estudo anterior, descobrimos que Y-27632 facilita o crescimento clonal das células epidérmicas, mas reduz o rendimento das células dérmicas controlando diferencialmente a expressão de moléculas de adesão13. Também estabelecemos um novo meio de inoculação condicionados, chamado G-médio, que suporta o crescimento e a produtividade das células epidérmicas primárias. Combinando G-médio com Y-27632, este novo método pode espontaneamente separar células epidérmicas e dérmicas após digestão enzimática, eliminando assim a etapa da epiderme-derme separação13,14. Agora com base em relatórios anteriores, descrevemos o procedimento detalhado deste novo método para isolar HKCs do tecido da pele adulta.

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Protocol

Tecidos humanos utilizados neste protocolo foram tratados de acordo com as diretrizes do Comitê de ética da instituição pesquisa humana (NO.2015120401, data: 12 de maio de 2015).

1. preparações

  1. Tecidos de pele abdominal adulto fresca coletar descartados da cirurgia plástica no hospital em um tubo de 50 mL com 10 mL de Dulbecco gelada é modificado médio águia (DMEM). A amostra pode ser mantida a 4 ° C por até 72 h sem significativamente afetar a viabilidade celular.
  2. Prepare os reagentes e o meio de cultura, conforme descrito abaixo.
    1. Adicione 1 mL de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/L) a 50 mL de solução tampão fosfato (PBS) para preparar a solução de lavagem.
    2. Prepare-se dois conjuntos de soluções de digestão enzimática: (1) preparar 50 mL de dispase (2,5 mg/mL em DMEM) e 50 mL de tipo I colagenase (2,5 mg/mL em DMEM) separadamente para o método convencional; e (2) preparar 50 mL de uma mistura de dispase e tipo I colagenase (dissolver 125 mg de pó de dispase e 125 mg de tipo I pó de colagenase em 50 mL de DMEM) para o novo método.
      Nota: Todas as soluções de enzima devem ser filtradas com um filtro de 0,22 µm e manteve at4 ° C.
    3. Preparar soluções de digestão para os dois métodos: tripsina 0,05% e 0,25% tripsina foram adquiridos comercialmente. Preparar um 10mg/mL DNase eu solução dissolvendo-se 50 mg de DNase eu pó em 5 mL de PBS, filtrá-la com um filtro de 0,22 µm e armazená-lo a-20 ° C.
    4. Preparar 500 mL de meio de neutralizar a digestão enzimática: suplementado DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.
    5. Preparar 500 mL de meio de inoculação (que contém o fator de crescimento médio, chamado G-médio): DMEM/F12 (3:1) médio contendo 1% penicilina/estreptomicina, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF2), ng/mL 20 fator de crescimento epidérmico (EGF), e Suplemento de 2% B27.
    6. Pré-tratamento de cultura celular de 100mm pratos com 2 mL de matriz de revestimento contendo tipo eu colágeno durante 30 min à temperatura ambiente.

2. convencional método

  1. Tratamento prévio de tecidos de pele
    1. Tome 1,5 cm2 dos tecidos da pele e lave-a 1 x 10 ml de PBS; em seguida, enxágue-o com 10 mL de etanol a 70% por 30 s e incube-2x com 10 mL de solução (PBS contendo 2% de penicilina e estreptomicina), de lavagem 5 min cada.
      Nota: Todas as lavagens são executadas em pratos de cultura celular de 100mm dentro de uma capa de fluxo laminar.
    2. Apare o tecido com tesoura estéril para remover a camada de gordura subcutânea em um prato de cultura celular de 100-mm e, em seguida, pesar o tecido da pele (o peso é 1 g neste protocolo).
      Nota: Aparamento suficiente é crucial para a eficiente separação da epiderme da derme. A camada de gordura amarelada pode ser facilmente distinguida visualmente.
    3. Transferir o tecido para um outro prato de 100mm estéril com o lado da derme para baixo e, em seguida, corte o tecido da pele em tiras de 3 a 4 mm de largura com uma lâmina de bisturi.
      Nota: O lado da derme com a camada de gordura é facilmente reconhecido visualmente.
    4. Adicionar 10 mL de solução de dispase de 2,5 mg/mL para os tecidos da pele em um prato de cultura de 100-mm e, em seguida, incubar o prato durante a noite a 4 ° C (não mais que 20 h).
      Nota: A quantidade de solução de dispase pode ser calculada usando-se 10 mL da solução de dispase para a digestão de cada grama de tecido.
  2. Separação da epiderme do tecido cutâneo
    1. No segundo dia, retire a epiderme da derme usando uma pinça fina.
      Nota: Se é difícil de descascar fora a epiderme, a digestão de dispase não era suficiente, que é geralmente devido à insuficiente aparamento do tecido. Neste caso, o tecido precisa de um tempo de incubação.
    2. Picar a epiderme descascada com 500 µ l do meio de cultura celular em uma pasta de tecido usando lâminas de bisturi; em seguida, resuspenda-lo com 10 mL de tripsina 0,25% em um tubo de 50 mL e incube-20 min em banho-maria a 37 ° C, com agitação.
  3. Coleta e cultivo de células primárias
    1. Neutralize a atividade da tripsina, adicionando um volume igual de solução de neutralização (10 mL no presente protocolo).
    2. Dissociar as células epidérmicas pipetando a solução acima e abaixo de 20 x com uma pipeta sorológica de 10 mL e transferir a solução de célula através de um filtro de célula de 100 µm para remover todos os restos de tecido residual.
    3. Centrifugue a solução de célula a 200 x g por 5 min após filtração; resuspenda o pellet de células em meio de neutralização para lavagem e, então, centrifugue ele novamente a 200 x g , para obter o centrifugado.
    4. Ressuspender as células em 10 mL do meio de baixo-cálcio, isento de soro queratinócito (SFM). Leve 10 µ l desta solução para contar o número total de células e, em seguida, cerca de 2 x 106 células da placa com 10 mL de SFM em pratos de cultura celular 100mm pré-tratados com matriz de revestimento (contendo colágeno tipo I).
      Nota: O revestimento é um passo necessário para o método convencional.
    5. Altere o meio de cultura cada 2 d.
      Nota: Verificar a adesão celular sob um microscópio, antes e depois de mudar o meio de cultura.
    6. Passagem das células quando eles alcançam cerca de 80% confluência.
      Nota: Todos os pratos de cultura são pré-tratados com a matriz de revestimento.

3. o novo método

  1. Tratamento prévio de tecidos de pele
    1. Colete o tecido como descrito acima (passo 2.1) para o método convencional.
    2. Lave o tecido da pele 1 x 10 ml de PBS e, em seguida, pesá-lo em um recipiente plástico estéril por uma balança electrónica (o peso é de cerca de 1 g no presente protocolo).
      Nota: O peso mínimo de tecido necessário para este protocolo é 0,1 g, uma vez que é difícil obter um número suficiente de células, se a amostra de tecido usada é muito pequena. Não há nenhum peso máximo de tecido para este protocolo, que em última análise, depende da capacidade de manipulação do operador.
    3. Usar fórceps para enxaguar o tecido da pele com 10 mL de etanol a 70% por 30 s.
    4. Incubar o tecido 2 x com 10 mL de solução (preparada na etapa 2.1.1), por 5 min de lavagem de cada vez.
      Nota: Todas as etapas de lavagem observadas acima são executadas em pratos de cultura celular de 100mm dentro de uma capa de fluxo laminar (um capuz de cultura de tecidos).
    5. Transferi o tecido para outro prato de cultura da célula de 100-mm estéril.
    6. Usando lâminas de bisturi, picar o tecido completamente em uma pasta de tecido.
    7. Adicione 200 µ l de PBS cada 5 min para manter os tecidos molhados.
      Nota: Leve em torno de 15 min para obter as etapas 3.1.5 - 3.1.7. Todas as etapas acima são executadas à temperatura ambiente.
  2. Digestão dos tecidos da pele
    1. Transferi a solução de tecido homogeneizado em um tubo de 50 mL. Adicione 10 mL de mistura de enzimas para cada 1 g de tecido da pele. Homogeneiza as enzimas com os tecidos homogeneizados.
    2. Incube a mistura com agitação em banho-maria a 37 ° C por 1h.
    3. Adicionar um volume de 1/5 de tripsina 0,25% (2,5 mL neste protocolo) para a mistura de digestão por outro 30 min em um banho-maria a 37 ° C.
    4. Adicionar DNase eu solução à mistura de enzima na proporção de 1: 100 (v/v) (250 µ l neste protocolo) e incube-lo por 5 min à temperatura ambiente.
  3. Coleta e cultivo de células primárias
    1. Pare o processo de digestão, adicionando 12,5 mL de meio de neutralização em uma proporção de 1:1. Pipete a solução acima e para baixo por cerca de 20 x, usando uma pipeta de 10 mL serológica para dissociar as células.
    2. Filtre as células dissociadas através de um filtro de célula de 100 µm para remover os restos de tecido. Centrifugue o sobrenadante com 200 x g durante 5 min. observar o sedimento no fundo do tubo.
    3. Desprezar o sobrenadante e lavar o centrifugado com 10 mL de meio de neutralização e centrifugar novamente a 200 x g por 5 min coletar as células.
    4. Ressuspender as células em 10 mL de meio de inoculação (G-médio da etapa 1.2.5) com 10 µM de Y-27632.
    5. Leve 10 µ l da solução para contar o número total de células e, então, cerca de 2 x 106 células da placa com 10 mL de G-médio em um prato de cultura celular de 100-mm.
      Nota: O precoating passo não é necessário para o novo método, e não há remoção da camada dérmica também é necessária.
    6. Depois de 3-d, substitua o meio de inoculação médio SFM baixo-cálcio. Altere o meio de cultura cada 2 d.
      Nota: Verificar a aderência de célula antes e depois de mudar o meio.
    7. Passagem das células quando eles alcançam cerca de 80% confluência.
      Nota: Se necessário, pré-tratamento das células com tripsina 0,05% por 2 min e lavar as células com PBS para remover contaminantes células dérmicas antes trypsinizing as células epidérmicas.

4. célula passagem

  1. Remover o meio, lavar as células com PBS e, em seguida, adicione 2 mL de tripsina 0,05% (por cada prato de 100-mm).
  2. Incube as células em uma incubadora (37 ° C com 5% CO2), por 5 min.
  3. Verifique as células usando um microscópio para certificar-se de que todas as células têm retirado o prato de cultura.
  4. Adicione 8 mL de DMEM com 10% FBS para neutralizar a reação enzimática e, em seguida, coletar as células em um tubo de 15 mL.
  5. Centrifugar a 200 x g por 5 min obter o centrifugado.
  6. Remover o sobrenadante lentamente e, em seguida, resuspenda o pellet celular com 10 mL de meio SFM e contar o número de células.
  7. Placa 1 x 106 células com 10 mL de SFM em cada prato de 100mm célula.
  8. Altere o meio de cada 2 d.

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Representative Results

Diagramas esquemáticos do novo método (figura 1A) e o método convencional (figura 1B) são apresentados na Figura 1. O método convencional é uma digestão de duas etapas, o que requer um procedimento de 2 dias. Por outro lado, o novo método é uma digestão de uma etapa, que leva cerca de 3 horas para executar. Importante, o novo método de uma etapa pode obter duas populações (células epidérmicas e dérmicas) ao mesmo tempo, que depende da presença de Y-27632 no meio de inoculação. Além disso, a inicial cultura tempo das células epidérmicas, para atingir cerca de 80% confluência normalmente demora pelo menos 3 dias, a menos que o método convencional se o mesmo número de células é inoculado após o isolamento.

O novo método produz células epidérmicas mais primárias, que crescem em uma morfologia de colônia. As HKCs isoladas da pele humana, os tecidos foram inoculados com G-médio que contém Y-27632. O mesmo número de células foram chapeado seguindo o método convencional, como o controle. Imagens representativas das células epidérmicas nos dias 3 e 5, após a inoculação inicial são mostradas na Figura 2A. As células obtidas a partir do novo método tendido a crescer como uma morfologia de colônia. A curva de crescimento após inoculação foi avaliada utilizando uma célula contando kit-8 (CCK-8) em pontos diferentes de tempo após a inoculação (Figura 2B), e o tempo de duplicação é de cerca de 3-4 dias para células elaborados pelo método novo, mas é de cerca de 6 a 8 dias para o método convencional. No dia 7, foram calculados os rendimentos das células. Os resultados são mostrados na Figura 2, que mostra que o novo método rendeu três vezes mais células do que o método convencional e que o tempo necessário para alcançar a confluência após a inoculação inicial foi de pelo menos 3 dias menos (Figura 2D). No dia 7, as células epidérmicas chegaram a confluência com o novo método, mas não com o método convencional (Figura 2D).

O novo método aprimorado a expressão da integrina-α6 pelas células primárias. Α6-integrina tem demonstrado ser altamente expressa em células tronco epidérmicas15. Células isoladas pelo método novo mantém as características das células basais da pele após várias passagens. Crescimento da colônia é uma das características de células-tronco epidérmicas derivadas da camada basal da pele, e um alto nível de expressão α6-integrina é outra característica destas células tronco epidérmicas. Descobrimos que a adição de Y-27632 aumentou significativamente a expressão da integrina-α6 em células epidérmicas na passagem 3 (Figura 3A-B), e na passagem 3, células epidérmicas isoladas usando o novo método não mostram nenhuma contaminação por células dérmicas 13. é muito importante manter as características de célula basal após várias passagens durante a expansão em vitro . Análise de imunofluorescência (IF) de queratina marcador basocelular 5 e o marcador de diferenciação terminal loricrin16 foi realizada com essas células após três passagens. Nós achamos que 90% de todas as células eram K5-positivo, mas inferior a 10% deles expresso loricrin (Figura 3 - 3D). Estes resultados indicam que o HKCs primários isolados usando o novo método contêm uma população de células-tronco epidérmicas e podem manter suas características de células basais. Mas quanto mais que HKCs são passadas, quanto mais eles começam a se diferenciar. Pelo novo método, encontramos que células epidérmicas cultivadas em vitro poderia manter sua capacidade de proliferação até passagem 8. Finalmente, testamos a pureza das células epidérmicas isoladas usando o novo método, desde que uma mistura de células epidérmicas e dérmicas foi inoculada logo após o isolamento. Com um tratamento de curto prazo (2-3min) com tripsina, remover algumas células dérmicas contaminando a cultura inicial, obteve-se uma população relativamente pura das células epidérmicas após uma passagem (Figura 4).

Figure 1
Figura 1 : Comparação dos procedimentos convencionais e novo isolamento. (A), este painel mostra uma representação esquemática do novo método de isolamento. No dia 1, as células da pele dissociada são inoculadas no G-médio com ou sem Y-27632. Na presença de Y-27632 por 2 dias, as células epidérmicas expandem seletivamente. No próximo dia 6, as células atingir uma densidade suficiente para a passagem. (B), este painel mostra uma representação esquemática do método convencional de isolamento. A epiderme é separada da derme e as células epidérmicas são isoladas no dia 2, e geralmente, as células de alcangam uma densidade suficiente o bastante para passagem em cerca de 10 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : O novo método de isolamento aumenta o rendimento das células epidérmicas primárias. Imagens do (A), este painel mostra representante das células epidérmicas, preparadas pelo novo método (linha superior) e pelo método convencional (linha inferior), nos dias 3 e 5, após a inoculação inicial. As barras de escala = 200 µm. (B) primário HKCs preparado pelo novo e o convencional métodos foram coletados nos pontos de tempo indicado para a análise das células viáveis, utilizando uma célula contando kit-8 (CCK-8). (C) o número total de células elaborado pelo método novo e pelo método convencional foram contado no 7º dia após a inoculação. (D) o tempo médio para atingir a confluência das células epidérmicas primárias (passagem 0) é mostrado para o novo método de isolamento e o método convencional. Para os painéis B - D: Student t-teste foi usado; as barras de erro mostram a variação padrão; n = 4; p < 0,01, * p < 0,05 ao comparar o novo método com o método convencional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Células epidérmicas primárias, obtidas pelo método de novo são capazes de manter recursos basocelular durante em vitro expansão. (A) este painel mostra uma análise de FACS da expressão α6-integrina de células epidérmicas na passagem 3 tratada com Y-27632 (Y-27632, vermelho) ou sem Y-27632 (controle, cinza) por 48 h. (B) este painel mostra uma análise de quantificação de células com alta níveis de expressão da integrina-α6 do painel A; α6-integrina alta expressão é definida como um sinal > 103, * * p < 0,01. (C) este painel mostra imagens representativas da mancha da imunofluorescência de K5 (vermelho) e loricrin (vermelho); DAPI (azul) foi usado para manchar os núcleos. As barras de escala = 100 µm. (D), este painel mostra uma análise de quantificação de células loricrin e K5 --positivo. Um total de 400 células foram contados quantificar cada grupo, e os números médios das células loricrin e K5 --positivo são mostrados. O experimento independente foi repetido 4 vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Após a passagem inicial, células epidérmicas relativamente puras foram obtidas usando o novo método. (A), este painel mostra imagens representativas da mancha da imunofluorescência de vimentina (vermelha) para as células epidérmicas em passagens 0 (P0) e 3 (P3); DAPI (azul) foi usado para manchar os núcleos. As barras de escala = 50 µm. (B), este painel mostra uma análise de quantificação de células vimentina positivo em passagens 0 (P0) e 1 (P1). Um total de 400 células foram contados quantificar cada grupo, e o número médio de células vimentina positivo é mostrado. O experimento independente foi repetido 4 vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

HKCs primárias cultivadas têm sido amplamente utilizados para tratar feridas em clínicas por mais de três décadas e, desde então, tem sido sempre importante eficientemente obter um número suficiente de células para aplicações clínicas em tempo hábil. Portanto, na prática, o método de isolamento convencional, o que exige a separação da epiderme da derme, torna difícil atender a essas demandas, devido o baixo rendimento das células e a baixa capacidade de passagem de células adultas. Aqui, descrevemos um novo método simples que desenvolvemos para eficientemente obter HKCs de tecido adulto com base em anteriores relatórios13,14, que é mais adequado para o laboratório e para aplicações clínicas.

Deve ser dada atenção para os seguintes passos críticos para alcançar os melhores resultados para o novo método. Em primeiro lugar, o processo de homogeneização é um passo crucial; homogeneização insuficiente claramente afetará a eficiência da digestão enzimática e resultam em um baixo rendimento de células dissociadas. Em segundo lugar, a etapa de digestão de tripsina não deve tomar mais de 30 min; caso contrário, a viabilidade das células dissociadas diminuirá. Em terceiro lugar, para coletar eficientemente células dissociadas, o tamanho dos poros do filtro célula usado para filtragem deve ser de 100 µm, e um único filtro deve ser usado para filtrar não mais que 20 mL da solução celular. Em quarto lugar, a densidade do chapeamento inicial é um fator importante para minimizar a contaminação com células dérmicas, porque uma densidade elevada célula irá reduzir significativamente o efeito inibitório de Y-27632 em células dérmicas. Portanto, é fundamental contar com precisão o número total de células dissociadas no final do procedimento de isolamento antes de chapeamento.

Em primeiro lugar, o novo método simplifica o processo de isolamento: o procedimento de isolamento convencional em duas fases, normalmente demora 2 dias para executar, e o procedimento de remoção é crucial para remover completamente o tecido adiposo da pele, especialmente para tecidos adultos ( Figura 1); caso contrário, haverá uma separação ineficiente da epiderme da derme após a digestão durante a noite, com dispase. Aproveitando o Y-27632, que inibe o crescimento de células dérmicas após inoculação13, o novo método não precisa separar a epiderme da derme e, portanto, o procedimento de remoção para remover o tecido adiposo não é necessário para o novo método, que precisa apenas de metade de um dia para ser executada. Em segundo lugar, o novo método também simplifica o processo de cultura desde que, com o método tradicional, as células dissociadas geralmente são cultivadas em uma camada de alimentador de fibroblastos de rato irradiados em meio contendo 10% FBS ou em um prato de colágeno-revestidos. Componentes de origem animal são sempre fatores de risco que devem ser evitados para aplicações clínicas. Desenvolvemos um meio de inoculação condicionado isento de soro (G-médio), que não requer um passo precoating para pratos de cultura e também melhora o rendimento de queratinócitos primários13 porque combinado com Y-27632 G-médio promove a fixação de células epidérmicas para a cultura do prato13,17,18. Portanto, o novo método facilita o processo de cultura e também é um procedimento relativamente seguro para aplicações clínicas sem a adição de componentes de origem animal. Em terceiro lugar, o novo método melhora o rendimento das células epidérmicas primárias e diminui o tempo de cultura inicial necessário até a confluência. Comparado com o método tradicional, o rendimento das células produzidas pelo novo método é cerca de 3 vezes maior, e a passagem inicial das células epidérmicas atingiu confluência de pelo menos 3 dias antes (Figura 2). Finalmente, o novo método pode ser utilizado para o isolamento de células epidérmicas de todos os tipos de amostras de pele, tais como a pele do couro cabeludo cabeludo e tecidos de pele de adultos com uma espessa camada de gordura, que tenham sido testados em um anterior relatório13.

HKCs primárias de elevado potencial foram amplamente utilizados para pesquisas de laboratório e para aplicações clínicas. Este novo método aumenta o potencial de culturas de células com características de células-tronco epidérmicas13. Y-27632 aumenta a expressão de α6-integrina por HKCs e depois de três passagens, mais de 90% das células epidérmicas cultivadas expressa a queratina do marcador de célula basal 5, e menos de 10% das células expressa o marcador de diferenciação Loricrin, indicando que Estas células mantém as características das células basais da pele após várias passagens. As células epidérmicas cultura-expandida podem reconstituir pele na vivo após a enxertia13, sugerindo que eles possuem o potencial de regeneração após a expansão da cultura. Notavelmente, o novo método é ideal para isolar as células de tecidos adultos, como mencionado acima. Portanto, as células epidérmicas preparadas por este método podem ser usadas para in vitro e in vivo modelos para estudar doenças de pele e pode ser desenvolvido em autólogos produtos baseados em células para aplicações clínicas, tais como o tratamento de feridas de pele.

Em resumo, o novo protocolo fornece um procedimento simplificado e eficaz para isolar e expandir células epidérmicas primárias do tecido da pele adulta. Este método avançado é mais apropriado para produzir um grande número de células epidérmicas de alto potencial para laboratório e para aplicações clínicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo nacional chave de pesquisa e desenvolvimento programa de China (2017YFA0104604), o programa geral da Fundação Nacional de ciências naturais da China (NSFC, 81772093), a ciência e tecnologia programa de desenvolvimento de Suzhou (ZXL2015128), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (BK20161241) e um prêmio de estudioso de Taishan de Shandong (tshw201502065).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting 
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker Shanghai Boxun 150036 For water bath
Electronic Scale Harbin Zhonghui 1171193 For tissue weighing
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifuge
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science  P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HKC dissociation
0.25% Trypsin  Beijing Solarbio Science & Technology T1350-100 For HKC dissociation
Coating Matrix Kit Life Technologies R-011-K For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HKC isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HKC isolation
Deoxyribonuclease I Sigma 9003-98-9 For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Thermo Scientific NC9864731 cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 Hewlett-Packard Development Company MA-20142 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin Covance PRB-145p For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3) Santa Cruz  SC-19622 flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC Santa Cruz  SC-2831 negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

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References

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Biologia do desenvolvimento questão 138 queratinócitos humanos células-tronco epidérmicas células dérmicas isolamento de célula primária da pele cultura de queratinócitos inibidor quinase Y-27632 Rho-associado regeneração da pele
Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos
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Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou, Q., Zhou, C., Zhao, H., Wu, X. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57784, doi:10.3791/57784 (2018).

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