Summary
Здесь мы представляем протокол эффективно изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожных тканей. Этот метод упрощает обычные процедуры с использованием ингибитора Y-27632 рок в средне-прививка спонтанно отделить эпидермальных клеток от кожных клеток.
Abstract
Для лабораторных исследований и клинического применения основного человека кератиноцитов, изолированный от свежих кожных тканей и их расширение в пробирке широко использовались. Обычные изоляции метод человеческие кератиноциты включает в себя последовательное ферментативного пищеварения двухэтапная процедура, которая оказалась неэффективной в генерации начальных клетки от взрослых тканей из-за низкой сотовый скорость восстановления и сокращение клеток жизнеспособности. Недавно мы сообщили расширенный метод изолировать человека первичной эпидермальный прародитель клеток тканей кожи, использующий ингибитора киназы Ро Y-27632 в среде. По сравнению с традиционными протоколом, этот новый метод проще, легче и менее трудоемким и увеличивает урожайность эпителиальных стволовых клеток и усиливает их характеристики стволовых клеток. Кроме того новая методология не требует отделения эпидермис от дермы и, таким образом, подходит для изоляции клетки из различных видов тканей взрослого. Этот новый метод изоляции преодолевает основных недостатков традиционных методов и больше подходит для производства большого количества клеток эпидермиса с высокой потенции, как в лабораторных, так и для клинического применения. Здесь мы опишем новый метод в деталях.
Introduction
Целью было разработать простой и эффективный протокол изолировать первичной человеческие кератиноциты (HKCs) от взрослых тканях, особенно для клинического применения. Эпидермальный стволовых клеток кожи, локализованные в базального слоя кожи, обладают высоким потенциалом размножаться и дифференциации кератиноцитов для поддержания функций кожи1,2,3, 4. HKCs, изолированных от кожи, ткани широко используются для кожи ткани инженерии и регенерации целей, особенно в ремонт поврежденной кожи и генной терапии для клинического применения5,6. Ключевым вопросом для приложений на базе HKC является эффективно изолировать и расширить большое количество HKCs с высоким потенциальным в vitro7,8. Хотя различные исследовательские группы разработали методы для производства культур стволовых как HKCs, эти методы являются иногда длительным и сложным для выполнения и другие ограничения, например урожайность низкая клеток и ограничиваясь типом кожи образца используемые9. К примеру традиционный метод, чтобы изолировать HKCs от кожных тканей предполагает двухэтапный ферментативного пищеварения с разделением эпидермис дерма6. Этот метод обычно хорошо работает для новорожденных тканей, но она становится очень трудно, когда используется для изоляции клетки от взрослых тканях.
Y-27632, ингибитора киназы Ро связанные белком (рок), сообщалось значительно повысить эффективность эпидермальный стволовых клеток изоляции и колонии роста10,11,12. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что Y-27632 облегчает клоновых рост клеток эпидермиса, но уменьшает доходность кожных клеток, дифференциально контролируя экспрессию молекул адгезии13. Мы также создали новое средство кондиционером прививка, называется G-средний, который поддерживает рост и урожайность первичных клеток эпидермиса. Объединив G-средний с Y-27632, этот новый метод может спонтанно отдельных клеток эпидермиса и дермы после Пищеварение энзима, удалив таким образом шаг эпидермис дерма разделения13,14. Основываясь на предыдущих докладах, мы теперь описывают подробные процедуры этот новый метод, чтобы изолировать HKCs от взрослых кожной ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человеческие ткани, используемые в настоящем Протоколе, обрабатывались в соответствии с руководящими принципами Комитета этики Института исследований человеческого (NO.2015120401, Дата: 12 мая 2015).
1. Подготовка
- Собирать свежие взрослых брюшной кожных тканей, отказаться от пластической хирургии в госпитале в 50-мл тюбик 10 мл ледяной Дульбекко модифицированная Eagle среднего (DMEM). Образец может храниться при температуре 4 ° C до 72 ч без значительно влияющих на жизнеспособность клеток.
- Подготовка реагентов и питательной среды, как описано ниже.
- Добавьте 50 мл раствора фосфатного буфера (PBS) подготовить моющего раствора 1 мл пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мг/Л).
- Подготовить два комплекта фермента пищеварение решения: (1) подготовить dispase (2,5 мг/мл в среде DMEM) 50 мл и 50 мл тип I коллагеназы (2,5 мг/мл в среде DMEM) отдельно для обычного метода; и (2) подготовить 50 мл смеси dispase и типа коллагеназы (растворить 125 мг порошка dispase и 125 мг I тип коллагеназы порошок в 50 мл DMEM) для нового метода.
Примечание: Все фермента решения должны быть отфильтрованы с 0,22 мкм фильтром и держал at4 ° C. - Подготовить пищеварение решения для обоих методов: 0,05% трипсина и трипсин 0.25% коммерчески были приобретены. Подготовка 10 мг/мл DNase I решения путем растворения 50 мг DNase я порошка в 5 мл PBS, фильтрация с помощью стрейнер 0,22 мкм и хранить его при-20 ° C.
- Подготовка 500 мл среды для нейтрализации ферментативного пищеварения: средний DMEM, дополненная плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Подготовка 500 мл средства прививок (рост фактор содержащих средний, называется G-средний): DMEM/F12 (3:1) среде, содержащей 1% пенициллина/стрептомицина, fungizone 40 мкг/мл, 40 нг/мл фактор роста фибробластов 2 (FGF2), 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), и Дополнение 2% B27.
- Предварительной обработки 100-мм клеточной культуры блюда с 2 мл покрытие матрицы, содержащие тип коллагена для 30 мин при комнатной температуре.
2. обычный метод
-
Предварительная обработка ткани кожи
- Возьмите2 1,5 см ткани кожи и мыть его 1 x 10 мл PBS; затем промойте его с 10 мл, этанол 70% для 30 s и проинкубируйте его 2 x 10 мл моющего раствора (PBS, содержащий 2% пенициллина и стрептомицина), 5 мин.
Примечание: Все моет выполняются в 100-мм ячейку культуры блюда внутри Ламинарный шкаф. - Обрезка ткани с стерильные ножницы, чтобы удалить подкожный жировой слой в блюдо культуры 100-мм ячейку и затем, весят ткани кожи (вес составляет 1 g в этом протоколе).
Примечание: Достаточно триммирование является очень эффективной сепарации эпидермис от дермы. Желтоватый жирового слоя можно легко отличить визуально. - Передать другой 100-мм стерильные блюдо с стороны дермы ткани вниз и, затем, нарезать полосками 3 - до 4 мм широкий, с помощью скальпеля лезвие ткани кожи.
Примечание: Стороны дермы с жировой слой легко распознается визуально. - Добавить 10 мл 2,5 мг/мл dispase раствора на кожу тканей в 100-мм культуры блюдо и, затем, инкубировать блюдо на ночь при 4 ° C (не более 20 h).
Примечание: Количество dispase раствора может рассчитываться с помощью 10 мл dispase раствора для пищеварения каждый грамм ткани.
- Возьмите2 1,5 см ткани кожи и мыть его 1 x 10 мл PBS; затем промойте его с 10 мл, этанол 70% для 30 s и проинкубируйте его 2 x 10 мл моющего раствора (PBS, содержащий 2% пенициллина и стрептомицина), 5 мин.
-
Разделение эпидермис от ткани кожи
- На второй день шелушиться эпидермис от дермы с помощью тонкой пинцета.
Примечание: Если это трудно слезает эпидермиса, dispase пищеварение недостаточно, как это обычно из-за недостаточной обрезки ткани. В этом случае ткани нужно более длиннее время инкубации. - Фарш очищенные эпидермиса с 500 мкл клеток питательной среды в ткани пульпы с помощью лезвия скальпеля; затем Ресуспензируйте с 10 мл 0,25% трипсина в 50-мл пробирку и проинкубируйте его 20 мин на водяной бане при 37 ° C, при встряхивании.
- На второй день шелушиться эпидермис от дермы с помощью тонкой пинцета.
-
Сбор и культивирования клеток первичного
- Нейтрализовать действие трипсина, добавляя равным объемом нейтрализации раствора (10 мл в этом протоколе).
- Отделить эпидермальных клеток, закупорить решение вверх и вниз 20 x с Серологические Пипетки 10-мл и пройти ячейки решения через стрейнер ячейки 100 мкм для удаления любого мусора остаточной ткани.
- Центрифуга клетки решение на 200 x g 5 мин после фильтрации; Ресуспензируйте Пелле клеток в среде нейтрализации для мытья и, затем, центрифуга его снова на 200 x g для получения гранул ячейки.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл низким кальций, сыворотка бесплатно кератиноцитов среды (УЛП). Возьмите 10 мкл этого решения для подсчета числа общей ячейки и, затем, пластины около 2 х 106 клеток с 10 мл в 100-мм ячейку культуры блюда, предварительно обработанных с покрытие матрицы УЛП (содержащий тип I коллагена).
Примечание: Покрытие является необходимым шагом для обычного метода. - Изменение культуры среднего каждые 2 d.
Примечание: Проверьте адгезии клеток под микроскопом, до и после изменения питательной среды. - Проход клеток, когда они достигают около 80% слияния.
Примечание: Все блюда культуры являются предварительно обработанных с покрытие матрицы.
3 новый метод
-
Предварительная обработка ткани кожи
- Собирайте ткани как описано выше (шаг 2.1) для обычного метода.
- Вымойте ткань кожи 1 x 10 мл PBS и, затем, взвесить его в стерильных пластиковых контейнеров, электронные весы (вес составляет около 1 g в этом протоколе).
Примечание: Минимальный вес ткани, необходимые для этого протокола — 0,1 г, так как это трудно получить достаточное количество клеток, если используется образец ткани слишком мал. Существует не максимальный вес ткани для этого протокола, который в конечном счете зависит от пропускной способности оператора. - Используйте щипцы для полоскания тканей кожи с 10 мл 70% этанол 30 s.
- Инкубировать ткани 2 x 10 мл моющего раствора (подготовленных на шаге 2.1.1), 5 минут каждый раз.
Примечание: Все шаги Стиральная, отмечалось выше выполняются в 100-мм ячейку культуры блюда внутри Ламинарный шкаф (культуры ткани капот). - Передать другой 100-мм ячейку культуры стерильные блюдо ткани.
- С помощью лезвия скальпеля, фарш ткани тщательно в ткани пульпы.
- Добавьте 200 мкл PBS каждые 5 мин держать влажной ткани.
Примечание: Принимать шаги 3.1.5 - 3.1.7 около 15 мин. Все указанные выше действия выполняются при комнатной температуре.
-
Пищеварение ткани кожи
- Передача решения гомогенизированные ткани в 50-мл пробирку. Добавьте 10 мл смеси ферментов для каждого 1 г ткани кожи. Тщательно перемешать ферменты с усредненной тканей.
- Инкубируйте в смеси с тряски в водяной бане при 37 ° C в течение 1 ч.
- Добавить 1/5 объем трипсин 0.25% (2,5 мл в этом протоколе) пищеварение смесь для еще 30 мин на водяной бане при температуре 37 ° C.
- Добавить DNase я решение фермент смесь в соотношении 1: 100 (v/v) (250 мкл в этом протоколе) и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
-
Сбор и культивирования клеток первичного
- Остановите процесс пищеварения, добавив 12,5 мл нейтрализация среды в соотношении 1:1. Пипетка решение вверх и вниз для около 20 x, разбить ячейки с помощью Пипетки серологические 10-мл.
- Фильтр диссоциированных клетки через стрейнер ячейки 100 мкм для удаления мусора ткани. Центрифуга супернатант в 200 x g 5 мин наблюдать Пелле в нижней части трубки.
- Отменить супернатант и снова вымыть клетки лепешка с 10 мл нейтрализации средних и центрифуги на 200 x g 5 минут собрать клетки.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл средства прививок (G-средний шаг 1.2.5) с 10 мкм Y-27632.
- Возьмите 10 мкл раствора для подсчета числа общей ячейки и, затем, пластины около 2 х 106 клеток с 10 мл в 100-мм ячейку культуры блюдо G-среды.
Примечание: Намывных шаг не является необходимым для нового метода, а не удаление дермального слоя требуется либо. - После 3 d замените средства прививок с низким кальция УЛП среднего. Изменение культуры среднего каждые 2 d.
Примечание: Проверьте клеточной адгезии, до и после изменения среды. - Проход клеток, когда они достигают около 80% слияния.
Примечание: При необходимости предварительной обработки клеток с 0,05% трипсина на 2 мин и вымыть клетки с PBS для удаления загрязнения кожных клеток перед trypsinizing клеток эпидермиса.
4. клетки пассированый
- Удалите носитель, вымыть клетки с PBS и, затем, добавить 2 мл 0,05% трипсина (за каждое блюдо 100-мм).
- Инкубируйте клетки в инкубаторе (37 ° C с 5% CO2) 5 мин.
- Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки отделен от культуры блюдо.
- Добавить 8 мл DMEM с 10% FBS для нейтрализации ферментативной реакции и, затем, собрать клетки в 15 мл.
- Центрифуга на 200 x g 5 минут для получения гранул ячейки.
- Удалить супернатант медленно и, затем, Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл среды УЛП и подсчитать количество ячеек.
- Пластина 1 х 106 клеток с 10 мл в каждую ячейку 100-мм блюдо УЛП.
- Изменение среднего каждые 2 d.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1представлены схемы нового метода (рис. 1A) и традиционным методом (рис. 1B). Традиционным методом является двухэтапный пищеварение, которая требует 2-день процедуры. Напротив новый метод это Одношаговая пищеварения, который занимает около 3 часов для выполнения. Важно отметить, что одношаговый метод new можно получить две популяции (клетки эпидермиса и дермы) в то же время, которое зависит от наличия Y-27632 в средства прививок. Кроме того, первоначальный культура время эпидермальных клеток достичь около 80% слияния обычно занимает по крайней мере 3 дней меньше, чем обычный метод, если такое же количество клеток привиты после изоляции.
Новый метод дает более первичных клеток эпидермиса, которые растут в колонии морфологии. Изолированные HKCs из человеческой кожи, тканей были привиты с G-средний содержащие Y-27632. Такое же количество клеток были позолоченными после обычного метода элемента управления. Представитель изображения эпидермальных клеток в дни 3 и 5 после первоначального прививка показаны на рисунке 2A. Клетки, полученные из нового метода, склонны расти как морфология колонии. Кривая роста после того, как прививка была оценена с помощью клеток подсчета комплект-8 (CCK-8) в разное время точках после прививки (рис. 2B), и время удвоения около 3-4 дней для клеток, подготовленный нового метода, но около 6-8 дней для обычный метод. На 7 день доходность клетки были рассчитаны. Результаты показаны на рис. 2 c, который показывает, что новый метод принесли три раза больше клеток, чем обычный метод и что время, необходимое для достижения слияния после первоначального прививка была по крайней мере 3 дней меньше (Рисунок 2D). На 7 день эпидермальные клетки достигли слияния с новым методом, но не с обычным методом (Рисунок 2D).
Новый метод усиливается проявление α6-Интегрин Главные ячейки. Α6-Интегрин было показано, быть сильно выраженные стволовых клеток эпидермиса15. Клетки, изолированные, новый метод поддерживается характеристики базальных клеток кожи после нескольких проходов. Колонии рост является одной из характеристик эпидермальный стволовых клеток базального слоя кожи, и высокий уровень α6-Интегрин выражение является еще одной особенностью этих стволовых клеток эпидермиса. Мы обнаружили, что добавление Y-27632 значительно увеличили выражение α6-Интегрин в эпидермальных клеток при прохождении 3 (Рисунок 3А-B), и при прохождении 3, эпидермальные клетки изолированы при помощи нового метода показать не загрязнение кожных клеток 13. это очень важно для поддержания функции базальной клетки после нескольких проходов при расширении в пробирке . После трех проходов с этими клетками был проведен анализ иммунофлюоресценции (если) Базальные маркер кератин 5 и терминала дифференциации маркер loricrin16 . Мы обнаружили, что 90% от всех клеток были K5-положительных, но меньше, чем 10% из них выразили loricrin (рис. 3 c - 3D). Эти результаты показывают, что первичной HKCs изоляции с помощью метода new содержат эпидермальный стволовых клеток населения и может поддерживать характерные черты базальных клеток. Но больше что пассированной HKCs, тем больше они начинают различать. Новый метод мы обнаружили, что эпидермальные клетки культивировали в пробирке может поддерживать их способность распространения до прохода 8. Наконец мы протестировали чистоту эпидермальных клеток, изолированы при помощи нового метода, поскольку сразу после изоляции был засеян смесь клеток эпидермиса и дермы. С короткое время (2-3 мин) лечение с трипсином, чтобы удалить несколько кожных клеток, загрязняя первоначальной культуры относительно чистый населения эпидермальных клеток был получен после одного прохода (рис. 4).
Рисунок 1 : Сравнение изоляции новых и традиционных процедур. (A) Эта группа показывает схематическое представление нового метода изоляции. В день 1 клетки диссоциированных кожи являются прививки в G-средний, с или без Y-27632. При наличии Y-27632 за 2 дней клетки эпидермиса выборочно расширить. В вокруг дней 6, клетки достичь плотности, достаточным для пассированый. (B) Эта группа показывает схематическое представление метода обычных изоляции. Эпидермис отделен от дермы и эпидермальные клетки изолированы на 2 день, и как правило, клетки достичь плотности, достаточным для пассированый около 10 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Новый метод изоляции увеличивает доходность первичного эпидермальных клеток. (A) Этот представитель шоу группа изображений эпидермальных клеток, подготовленных новый метод (верхняя строка) и традиционным методом (Нижняя строка) на 3 и 5 дней после первоначального прививка. Масштаб баров = 200 µm. (Б) основной HKCs подготовленных новых и традиционных методов были собраны в назначенное время точках для анализа жизнеспособных клеток с использованием клеток подсчета комплект-8 (CCK-8). (C) общее количество клеток подготовленный нового метода и обычным методом были подсчитаны на 7 день после прививки. (D) для нового метода изоляции и традиционным методом отображается среднее время достичь слияния первичных эпидермальных клеток (проход 0). Для панелей B - D: Студенческая t-тест был использован; планки погрешностей показывают стандартное отклонение; n = 4; p < 0.01, * p < 0,05 при сравнении нового метода с традиционным методом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Основной эпидермальных клеток, полученные методом новых способны поддерживать Базальные функции во время в пробирке расширение. (A) группа показывает анализ СУИМ выражения α6-Интегрин эпидермальных клеток при прохождении 3 лечение с Y-27632 (Y-27632, красный) или без Y-27632 (контроль, серый) за 48 ч. (B) этой панели отображается количественная оценка анализа клеток с высоким уровни выражения α6-Интегрин от группы A; высокая α6-Интегрин выражение определяется как сигнал > 103, ** p < 0.01. (C) Эта группа показывает представитель изображения иммунофлюоресценции окрашивания K5 (красный) и loricrin (красный); DAPI (синий) был использован для пятно ядер. Масштаб баров = 100 µm. (D) Эта группа показывает анализ количественной K5 - и loricrin положительных клеток. В общей сложности 400 клеток были подсчитаны для количественного определения каждой группы, и показано среднее количество K5 - и loricrin положительных клеток. Эксперимент был самостоятельно повторяется 4 раза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : После первоначального прохождения, относительно чистый эпидермальных клеток были получены с помощью метода new. (A) Эта группа показывает представитель образы иммунофлюоресценции окрашивание виментин (красный) для эпидермальных клеток на проходы 0 (P0) и 3 (P3); DAPI (синий) был использован для пятно ядер. Масштаб баров = 50 µm. (B) Эта группа показывает анализ количественной виментин положительных клеток на проходы 0 (P0) и 1 (P1). В общей сложности 400 клеток были подсчитаны для количественного определения каждой группы, и показано среднее количество виментин положительных клеток. Эксперимент был самостоятельно повторяется 4 раза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Культивированный первичной HKCs широко использовались для лечения ран в клиниках для более чем трех десятилетий, и с того времени, он был всегда важно эффективно получить достаточное количество клеток для клинического применения своевременно. Таким образом на практике, обычные изоляции метод, который требует разделения эпидермис от дермы, делает его трудно удовлетворить эти требования, из-за низкой урожайностью клеток и низкая способность проход взрослых клеток. Здесь мы опишем новый простой метод, который мы разработали для эффективного получения HKCs от взрослых ткани, основанных на предыдущих докладах13,14, который является более подходящим, как в лабораторных, так и для клинического применения.
Внимание должно уделяться следующих важнейших шагов для достижения лучших результатов для нового метода. Во-первых процедура гомогенизации представляет собой решающий шаг; недостаточно гомогенизации явно будут влиять на эффективность ферментативного пищеварения и приводят к низкой урожайности диссоциированных клеток. Во-вторых шаг Пищеварение трипсина не следует принимать более чем 30 мин; в противном случае жизнеспособность клеток диссоциированных будет уменьшаться. В-третьих эффективно собирать диссоциированных клетки, поры размер ячейки фильтра используется для фильтрации должна быть 100 мкм, и единый сетчатый фильтр должен использоваться для фильтрации не более чем 20 мл раствора ячейки. В-четвертых плотность первоначального покрытия является важным фактором для сведения к минимуму загрязнения с кожных клеток, потому что плотность высокая клеток значительно снизит ингибирующее влияние Y-27632 на кожных клеток. Таким образом важно точно подсчитать общее количество диссоциированных клеток в конце процедуры изоляции до покрытия.
Во-первых, новый метод упрощает процедуры изоляции: обычных изоляции двухэтапная процедура обычно занимает 2 дня для выполнения, и процедура усечения имеет решающее значение для полного удаления жировой ткани из кожи, особенно для взрослых тканях ( Рисунок 1); в противном случае будет неэффективным разделение эпидермиса от дермы после ночи пищеварение с dispase. Воспользовавшись Y-27632, который подавляет рост кожных клеток после прививки13, новый метод не нужно отделить эпидермис от дермы и, таким образом, процедура усечения для удаления жировой ткани не является необходимым для нового метод, который требуется только полдня, чтобы выполняться. Во-вторых, новый метод также упрощает процедуру культуры, поскольку, с традиционным методом, диссоциированных клетки обычно выращиваются на фидер слой мыши облученных фибробластов в среде, содержащей 10% FBS или в блюдо коллаген ветротурбин. Животное производные компоненты, всегда факторы риска, которые следует избегать для клинического применения. Мы разработали сыворотки бесплатный кондиционером прививка среднего (G-средний), который не требует намывных шаг для культуры блюд и также повышает доходность первичного кератиноцитов13 , потому что G-средний, в сочетании с Y-27632 способствует крепления Эпидермальные клетки к культуре блюдо13,17,18. Таким образом новый метод облегчает процедуру культуры и также является относительно безопасной процедурой для клинических приложений без добавлением животного производных компонентов. В-третьих новый метод повышает доходность первичных клеток эпидермиса и сокращает время первоначальной культуры, необходимо достичь слияния. По сравнению с традиционным методом, доходность клеток, изготовленные методом новый примерно в 3 раза выше, и первоначальный проход эпидермальных клеток достигли слияния по крайней мере 3 дней раньше (рис. 2). Наконец новый метод может использоваться для изоляции эпидермальных клеток от всех типов образцов кожи, такие, как кожи волосатые головы и взрослых кожных тканей с толстым слоем жира, которые были протестированы в предыдущем докладе13.
Высоким потенциалом первичного HKCs широко использовались для лабораторных исследований и клинического применения. Этот новый метод повышает потенциал культивируемых клеток с характеристиками стволовых клеток эпидермиса13. Y-27632 повышает α6-Интегрин выражение HKCs и после трех проходов, больше чем 90% культивируемых клеток эпидермиса выразил Базальные маркер кератин 5, и менее 10% клеток выразил дифференциации маркер Loricrin, показывая, что Эти клетки держать характеристики базальных клеток кожи после нескольких проходов. Культура Расширенная эпидермальных клеток можно восстановить кожу в естественных условиях после прививки13, предполагая, что они обладают потенциальным регенерации после расширения в культуре. В частности новый метод идеально подходит для изоляции клетки от взрослых тканях, как упоминалось выше. Таким образом клетки эпидермиса, подготовленный этот метод может быть использован для в пробирке и в естественных условиях моделей для изучения заболеваний кожи и могут быть разработаны в аутологичной продуктов на основе клеток для клинического применения таких лечения ран кожи.
В целом новый протокол обеспечивает упрощенного и эффективного порядка изолировать и расширять первичных клеток эпидермиса от взрослых кожной ткани. Это расширенный метод больше подходит для производства большого количества клеток эпидермиса высоким потенциалом как в лабораторных, так и для клинического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национальной ключ научных исследований и развития программа Китая (2017YFA0104604), Генеральный программы национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 81772093), Наука и технологии развития программа Сучжоу (ZXL2015128), Естественные науки фонд провинции Цзянсу (BK20161241) и премию ученый Taishan Шаньдун (tshw201502065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C.
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E.
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
