Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.
Abstract
ראשי keratinocytes האנושי מבודד רקמות עור רענן, שלהם הרחבה במבחנה היה בשימוש נרחב עבור מחקר מעבדתי, יישומים קליניים. השיטה המקובלת בידוד keratinocytes האנושי כרוך הליך רציפים עיכול אנזימטי בן שני שלבים, אשר הוכח להיות יעיל ליצירת תאים העיקרי של רקמות בוגרות עקב קצב התאוששות התאים נמוך תא מופחת הכדאיות. לאחרונה דיווחנו שיטה מתקדמת כדי לבודד אנושי ראשוני עוריות ובתאים של רקמות העור אשר מנצל את מעכבי קינאז רו Y-27632 בטווח הבינוני. בהשוואה עם פרוטוקול מסורתיים, שיטה חדשה הוא יותר פשוט, קל יותר, פחות זמן רב, ו מגביר תאי אפיתל התשואה ומגבירה את המאפיינים תאי הגזע שלהם. יתר על כן, המתודולוגיה החדשה אינה דורשת את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, ומתאים, לכן, לבודד תאים מסוגים שונים של רקמות בוגרות. שיטה חדשה זו בידוד מתגבר את החסרונות העיקריים של שיטות קונבנציונליות, והוא מתאים יותר לייצר מספר גדול של תאים באפידרמיס עם האון גבוהה הן במעבדה והן עבור יישומים קליניים. כאן, אנו מתארים את השיטה החדשה בפירוט.
Introduction
המטרה הייתה לפתח פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לבודד keratinocytes אנושי ראשוני (HKCs) של רקמות בוגרות, במיוחד עבור יישומים קליניים. תאי גזע עוריות העור, מותאם לשכבת הבסיס של העור, בעלי פוטנציאל גבוה כדי להתרבות, להבדיל ולספק keratinocytes כדי לשמור על הפונקציות של העור1,2,3, 4. HKCs מבודד מן העור רקמות נמצאים בשימוש נרחב למטרות בעור רקמות הנדסה והתחדשות, במיוחד בתיקון של עור פגוע, ריפוי גנטי עבור יישומים קליניים5,6. הנושא המרכזי עבור יישומים מבוססי-HKC הוא ביעילות לבודד ולהרחיב מספרים גדולים של HKCs עם גבוהה פוטנציאל במבחנה7,8. למרות קבוצות מחקר שונות פיתחו שיטות כדי לייצר תרבויות של גזע דמוי HKCs, שיטות אלה הם לעיתים זמן רב ומורכב לבצע ויש מגבלות אחרות, כגון תא נמוך התשואות מוגבלים לפי סוג העור הדגימה שימוש9. למשל, השיטה המסורתית כדי לבודד HKCs רקמות העור כרוך עיכול אנזימטי של שני שלבים עם הפרדה של האפידרמיס הדרמיס6. בשיטה זו בדרך כלל עובד טוב בשביל לרקמות neonatal, אבל זה הופך להיות קשה מאוד, כאשר נעשה שימוש כדי לבודד תאים של רקמות בוגרות.
Y-27632, מעכב של רו-הקשורים חלבון (רוק), דווח לשפר באופן משמעותי את היעילות של תאי אפידרמיס בידוד והמושבה הצמיחה10,11,12. במחקר הקודם, גילינו כי Y-27632 מקלה על צמיחת תאים אפידרמיס המשובטים אך מפחית את התשואה של עורי תאים על-ידי שליטה באופן שונה את הביטוי של מולקולות אדהזיה13. הקמנו גם מדיום ממוזגים חיסון חדש, בשם G-בינוני, אשר תומך את הצמיחה ואת התשואה של ראשי תאים באפידרמיס. על ידי שילוב G-בינוני עם Y-27632, שיטה חדשנית זו יכול באופן ספונטני נפרד תאים באפידרמיס עורי לאחר אנזים עיכול, ובכך להסיר את השלב של האפידרמיס-הדרמיס ההפרדה13,14. על סמך דיווחים קודמים, נתאר עכשיו ההליך מפורט של שיטה חדשה כדי לבודד HKCs של רקמת עור מבוגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ברקמות אנושיות בשימוש פרוטוקול זה יטופל בהתאם לקווים המנחים של ועדת האתיקה האנושית המחקר של המוסד (NO.2015120401, תאריך: מאי 12, 2015).
1. תכשירים
- רקמות לאסוף טריים בעור בטן למבוגרים שנמחקו מן לכירורגיה פלסטית בבית החולים, שפופרת 50-mL עם 10 מ"ל של Dulbecco קר כקרח המתואמת של הנשר בינוני (DMEM). ניתן לשמור את הדגימה ב 4 ° C עבור עד 72 שעות מבלי להשפיע באופן משמעותי את הכדאיות התא.
- להכין את ריאגנטים תרבות בינוני כפי שמתואר להלן.
- להוסיף 1 מ"ל של פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 מ ג/ליטר) 50 מ של פתרון באגירה פוספט (PBS) כדי להכין את הפתרון כביסה.
- להכין שני סטים של אנזים עיכול פתרונות: (1) להכין 50 מ של dispase (2.5 מ"ג/מ"ל ב- DMEM), 50 מ של סוג אני collagenase (2.5 מ"ג/מ"ל ב- DMEM) בנפרד עבור השיטה המקובלת; (2) להכין 50 מ של תערובת של dispase, מסוג collagenase (התמוססות 125 מ ג של אבקת dispase ו- 125 מ"ג של להקליד אני אבקת collagenase 50 מ של DMEM) על השיטה החדשה.
הערה: כל הפתרונות אנזים צריך להיות מסונן עם מסננת 0.22-מיקרומטר, המשיכה חברת at4 מעלות צלזיוס. - הכנת מערכת העיכול פתרונות עבור שתי שיטות: 0.05% טריפסין, 0.25% טריפסין נרכשו מסחרית. הכינו 10 mg/mL DNase אני הפתרון על ידי המסת 50 מ"ג של DNase אני לפדר ב 5 מ של PBS, תסנן את זה עם מסננת 0.22-מיקרומטר, ואחסן אותו ב-20 ° C.
- הכנת 500 מ"ל של מדיום כדי לנטרל. את עיכול אנזימטי: בינוני DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
- הכנת 500 מ"ל של חיסון בינוני (צמיחה פקטור-המכילות בינוני, בשם G-בינוני): DMEM/F12 בינונית (3:1) המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין, fungizone µg/mL 40, 40 ng/mL פיברובלסט גורם גידול 2 (FGF2), 20 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), ו תוספת 2% B27.
- Pretreat תרבית תאים מ מ 100 מנות עם 2 מ של ציפוי מטריצה המכילה סוג אני קולגן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. השיטה המקובלת
-
רעלני רקמת העור
- קח 1.5 ס מ2 של רקמת העור ולשטוף אותו x 1 עם 10 מ"ל של PBS; לאחר מכן, לשטוף אותו עם 10 מ"ל אתנול 70%-30 s דגירה זה 2 x עם 10 מ"ל לרחוץ את הפתרון (PBS המכיל 2% פניצילין, סטרפטומיצין), 5 דקות כל אחד.
הערה: כל שוטף מבוצעות במנות תרבות תא 100-מ מ בתוך תא למינארי. - חתוך את הרקמה במספריים סטרילי כדי להסיר את שכבת השומן התת עורית בצלחת תרבות תא 100-מ מ, ואז, שוקל רקמת העור (המשקל הוא 1 g בפרוטוקול זה).
הערה: זמירה מספקת חיונית מאוד ההפרדה יעיל של האפידרמיס של הדרמיס. שכבת השומן צהבהב ניתן בקלות להבחין ויזואלית. - להעביר הרקמה תבשיל סטרילי אחר של 100 מ מ עם הצד הדרמיס למטה וחותכים, ואז, רקמת העור לרצועות 3 ל 4-מ מכולו באמצעות להב סכין.
הערה: הצד הדרמיס עם שכבת השומן בקלות מזוהה מבחינה ויזואלית. - הוסף 10 מ"ל של 2.5 מ"ג/מ"ל dispase פתרון לרקמות העור בצלחת 100-מ מ תרבות ', לאחר מכן, דגירה המנה בין לילה ב 4 ° C (לא יותר מ- 20 h).
הערה: ניתן לחשב את כמות dispase פתרון באמצעות 10 מ"ל של dispase פתרון למערכת העיכול של כל גרם של רקמת.
- קח 1.5 ס מ2 של רקמת העור ולשטוף אותו x 1 עם 10 מ"ל של PBS; לאחר מכן, לשטוף אותו עם 10 מ"ל אתנול 70%-30 s דגירה זה 2 x עם 10 מ"ל לרחוץ את הפתרון (PBS המכיל 2% פניצילין, סטרפטומיצין), 5 דקות כל אחד.
-
ההפרדה של האפידרמיס של רקמת העור
- ביום השני, לקלף האפידרמיס של הדרמיס באמצעות פינצטה משובחים.
הערה: אם קשה לקלף את האפידרמיס, עיכול dispase לא הספיק, שהוא בדרך כלל עקב מחסור חיתוך של הרקמה. במקרה זה, הרקמה צריך זמן דגירה ארוך יותר. - מינצ האפידרמיס קלופים עם 500 µL תא תרבות בינוני לתוך slurry רקמות באמצעות להבים ומהדקים; לאחר מכן, resuspend זה עם 10 מ"ל של 0.25% טריפסין בשפופרת 50-mL, דגירה זה 20 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C, ברעידות.
- ביום השני, לקלף האפידרמיס של הדרמיס באמצעות פינצטה משובחים.
-
ואוסף culturing התאים הראשי
- לנטרל את פעילות טריפסין על-ידי הוספת אמצעי שווה של פתרון ניטרול (10 מ"ל ב פרוטוקול זה).
- מביצועם התאים באפידרמיס מאת pipetting הפתרון לכל אורך 20 x עם פיפטה סרולוגית 10-mL ולהעביר את הפתרון הסלולרי דרך מסננת תא 100-מיקרומטר כדי להסיר את כל פסולת רקמות שיורית.
- Centrifuge הפתרון תא ב x 200 גרם במשך 5 דקות לאחר סינון; resuspend בגדר תא במדיום ניטרול לרחצה, ואז, centrifuge אותו שוב ב x 200 גרם להשיג בגדר תא.
- Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של סידן נמוכה, ללא סרום תקין בינוני (SFM). לקחת 10 µL של פתרון זה כדי לספור את המספר בתא סכום, צלחת עם 2 x 106 תאים עם 10 מ"ל של SFM לתוך תא 100-מ מ תרבות מאכלים מיוחדים עם ציפוי מטריקס (המכיל מסוג קולגן).
הערה: ציפוי היא צעד הכרחי עבור השיטה המקובלת. - לשנות את המדיום תרבות כל d 2.
הערה: בדוק את הידבקות תאים במיקרוסקופ לפני ואחרי שינוי המדיום תרבות. - המעבר את התאים כאשר הם מגיעים כ- 80% הנהרות.
הערה: כל המנות תרבות הם מיוחדים עם המטריצה ציפוי.
3. השיטה החדשה
-
רעלני רקמת העור
- לאסוף את הרקמה כמפורט לעיל (שלב 2.1) עבור השיטה המקובלת.
- לשטוף את רקמת העור 1 x עם 10 מ"ל ל- PBS, ואז, שוקל אותה בתוך מיכל פלסטיק סטרילית מאת מידה אלקטרוניים (המשקל הוא בסביבות 1 g בפרוטוקול זה).
הערה: המשקל המזערי של רקמות לצורך פרוטוקול זה הוא 0.1 g, שכן הוא קשה להשיג מספר מספיק של תאים אם הדגימה רקמות בשימוש הוא קטן מדי. אין שום משקל מקסימלי של רקמה עבור פרוטוקול זה, אשר בסופו של דבר תלוי יכולת טיפול של המפעיל. - להשתמש מלקחיים ולשטוף את רקמת העור עם 10 מ"ל אתנול 70%-30 s.
- דגירה הרקמה 2 x עם 10 מ"ל של כביסה לפתרון (להכין בשלב 2.1.1), 5 דקות בכל פעם.
הערה: כל השלבים כביסה שצוין לעיל מתבצעות ב- 100-מ מ תא מנות תרבות בתוך תא למינארי (ברדס תרביות רקמה). - להעביר את הרקמה תבשיל סטרילי תרבות 100-מ מ תא אחר.
- באמצעות להבים ומהדקים, מינצ הרקמה ביסודיות לתוך slurry רקמות.
- להוסיף 200 µL ל- PBS כל 5 דקות כדי לשמור על הרקמות רטוב.
הערה: לוקח בערך 15 דקות לקבלת צעדים 3.1.5 - 3.1.7. כל הצעדים הנ ל מתבצעים בטמפרטורת החדר.
-
העיכול של רקמת עור
- להעביר את פתרון הומוגני רקמה לתוך צינור 50-mL. להוסיף 10 מ של אנזים תערובת עבור כל 1 g של רקמת העור. מערבבים האנזימים ביסודיות עם הרקמות homogenized.
- דגירה התערובת ברעידות באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עבור 1 h.
- להוסיף נפח 1/5 של 0.25% טריפסין (2.5 מ ל פרוטוקול זה) לתערובת לעיכול עבור עוד 30 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
- להוסיף DNase אני הפתרון לתערובת האנזימים ביחס של 1: 100 (v/v) (250 µL ב פרוטוקול זה) דגירה זה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
-
ואוסף culturing התאים הראשי
- לעצור את תהליך העיכול על-ידי הוספת מ"ל של ניטרול בינוני על יחס 1:1. Pipette הפתרון למעלה ולמטה במשך 20 x, באמצעות פיפטה סרולוגית 10-mL מביצועם התאים.
- לסנן את התאים dissociated דרך מסננת תא 100-מיקרומטר לפנות את הפסולת רקמות. Centrifuge את תגובת שיקוע ב x 200 גרם במשך 5 דק להתבונן בגדר בתחתית הצינורית.
- למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר תא עם 10 מ"ל של ניטרול בינוני, צנטריפוגה שוב ב x 200 גרם במשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים.
- Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של חיסון בינוני (G-בינוני מהשלב 1.2.5) עם 10 מיקרומטר של Y-27632.
- קח 10 µL של הפתרון כדי לספור את המספר בתא סכום, צלחת עם 2 x 106 תאים עם 10 מ"ל של G-בינוני לתוך תבשיל תרבות תא 100-מ מ.
הערה: השלב precoating אינו הכרחי עבור השיטה החדשה, ללא הסרה של שכבת הדרמיס נדרש גם. - לאחר בתלת-ממד, החלף המדיום חיסון סידן נמוך SFM בינוני. לשנות את המדיום תרבות כל d 2.
הערה: בדוק את הידבקות תאים לפני ואחרי שינוי המדיום. - המעבר את התאים כאשר הם מגיעים כ- 80% הנהרות.
הערה: אם יש צורך, pretreat את התאים עם 0.05% טריפסין למשך 2 דקות ולשטוף את התאים עם PBS להסרת זיהום עורי תאים לפני trypsinizing את התאים באפידרמיס.
4. תא Passaging
- להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם PBS, ולהוסיף, ואז, 2 מ של טריפסין 0.05% (לפי כל מנה 100 מ מ).
- דגירה התאים בתוך אינקובטור (37 ° C עם 5% CO2) במשך 5 דקות.
- בדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי לוודא כי כל התאים יש מנותקת המנה תרבות.
- הוסף 8 מ של DMEM עם 10% FBS כדי לנטרל את התגובה אנזימטי, ואז, לאסוף את התאים בשפופרת 15-mL.
- צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות כדי להשיג בגדר התא.
- להסיר את תגובת שיקוע לאט, לאחר מכן, resuspend בגדר תא עם 10 מ"ל של SFM בינוני, לספור את מספר התאים.
- צלחת עונה 1 פרק 10 תאים6 עם 10 מ"ל של SFM לתוך כל מנה תא 100-מ מ.
- לשנות את המדיום כל d 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דיאגרמות סכמטית של השיטה החדשה (איור 1 א'), השיטה המקובלת (איור 1B) מוצגים באיור1. השיטה המקובלת היא עיכול בשני שלבים, המחייב הליך יומיים. לעומת זאת, השיטה החדשה היא עיכול בשלב אחד, אשר לוקח כ- 3 שעות לביצוע. חשוב, השיטה החדשה בשלב אחד ניתן להשיג שתי האוכלוסיות (תאים באפידרמיס, עורי) בו זמנית, אשר תלויה הנוכחות של Y-27632 בטווח הבינוני חיסון. יתר על כן, הראשונית תרבות זמן של תאים אפידרמיס כדי להגיע בסביבות 80% הנהרות בדרך כלל לוקח לפחות 3 ימים פחות מאשר השיטה המקובלת, אם אותו מספר של תאים הוא מחוסן לאחר בידוד.
השיטה החדשה מניב יותר ראשי תאים באפידרמיס, אשר צומחים מורפולוגיה המושבה. HKCs מבודדים מן העור האנושי רקמות חוסנו עם G-בינוני המכיל Y-27632. מספר זהה של תאים מצופים בעקבות השיטה המקובלת של הפקד. להחליפן בתמונות של תאי אפידרמיס ימים 3 ו- 5 לאחר חיסון ראשוני מוצגים באיור 2A. התאים המתקבל בשיטה החדשה נטתה לגדול עם מורפולוגיה המושבה. עקומת גדילה לאחר חיסון הוערכה באמצעות תא סופר קיט-8 (CCK-8) בנקודות זמן שונות לאחר חיסון (איור 2B) ולאחר זמן ההכפלה בסביבות 3-4 ימים עבור תאים שהוכנו על ידי השיטה החדשה אבל זה בסביבות 6-8 ימים השיטה המקובלת. יום 7, חושבו את התשואות של התאים. התוצאות מוצגות באיור איור 2C, אשר מראה כי השיטה החדשה הניב תאים שלוש פעמים יותר מאשר השיטה המקובלת וזה הזמן הנדרש כדי להגיע למפגש לאחר חיסון ראשוני היה לפחות 3 ימים פחות (איור דו-ממדי). יום 7, התאים באפידרמיס להגיע למפגש עם השיטה החדשה, אך לא עם השיטה המקובלת (איור דו-ממדי).
השיטה החדשה משופרת הביטוי של α6-אינטגרין על ידי התאים הראשי. Α6-אינטגרין הוכח להתבטא מאוד על ידי תאי גזע עוריות15. תאים מבודדים על ידי השיטה החדשה קיימו את המאפיינים של התאים הבזליים של העור לאחר כמה מעברים. המושבה הצמיחה הוא אחד המאפיינים של אפידרמיס תאי גזע שמקורם לשכבת הבסיס של העור, רמה גבוהה של α6-אינטגרין הביטוי הוא תכונה נוספת של אלה בתאי גזע באפידרמיס. מצאנו כי התוספת של Y-27632 הגדילה משמעותית את הביטוי של α6-אינטגרין תאים באפידרמיס-פסקה 3 (איור 3 א-ב) ו- קטע 3, תאים אפידרמיס מבודדים בשיטה החדשה להראות שום זיהום על ידי תאים עורי 13. זה מאוד חשוב לשמור על התכונות הבזליים לאחר כמה מעברים במהלך הרחבת במבחנה . Immunofluorescence (אם) ניתוח של קרטין סמן את התאים הבזליים 5 ו ה loricrin מרקר התמיינות סופנית16 בוצעה עם תאים אלה לאחר שלושה מעברים. מצאנו כי 90% של כל התאים היו K5-חיובית אך פחות מ 10% מהם מבוטא loricrin (איור 3C - 3D). תוצאות אלו מצביעים על כך ראשי HKCs מבודדים בשיטה החדשה מכילה אוכלוסיה תאי אפידרמיס באפשרותך לשמר את התכונות האופייניות של התאים הבזליים. אבל ככל HKCs הם passaged, יותר הם מתחילים להבדיל. לפי השיטה החדשה, מצאנו כי תאים אפידרמיס בתרבית במבחנה יוכל לשמור על יכולתם התפשטות עד המעבר 8. לבסוף, בדקנו את הטוהר של תאים אפידרמיס מבודדים בשיטה החדשה, מאז תערובת של תאי אפידרמיס ועורי מחוסנת מיד לאחר בידוד. עם טיפול זמן קצר (2-3 דקות) עם טריפסין להסיר כמה תאים עורי שמזהם את התרבות הראשונית, אוכלוסיה יחסית טהורה של תאים אפידרמיס הושג לאחר פסקה אחת (איור 4).
איור 1 : השוואה של נהלים חדשים, המקובלת בידוד. (א) לוח זה מציג ייצוג סכמטי של השיטה החדשה של בידוד. יום 1, תאי העור הפומבית מחוסנים ב- G-בינוני עם או בלי Y-27632. בנוכחות Y-27632 במשך יומיים, התאים באפידרמיס באופן סלקטיבי הרחב. -יום 6, התאים להגיע צפיפות מספיקה עבור passaging. (B) לוח זה מציג ייצוג סכמטי של השיטה המקובלת בידוד. מופרד האפידרמיס הדרמיס התאים באפידרמיס מבודדים ביום 2 ו בדרך כלל, התאים להגיע צפיפות מספיקה עבור passaging-כ 10 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : השיטה החדשה בידוד מגביר את התשואה של תאים באפידרמיס העיקרית. (א) נציג מראה זה לוח תמונות של תאים אפידרמיס שהוכנו לפי השיטה החדשה (שורה עליונה) ולפי השיטה המקובלת (שורה תחתונה) ימים 3 ו- 5 לאחר חיסון ראשוני. פסי בקנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) ראשי HKCs שהוכנו על ידי החדש, המקובלת על שיטות נאספו בנקודות הזמן המצוין על הניתוח של התאים קיימא באמצעות תא סופר קיט-8 (CCK-8). (ג) המספר הכולל של תאים שהוכנו על ידי השיטה החדשה, בשיטה המקובלת נספרו ביום 7 לאחר חיסון. (ד) הזמן הממוצע להגיע למפגש של תאים אפידרמיס הראשי (מעבר 0) מוצג עבור השיטה בידוד החדשה והן השיטה המקובלת. עבור לוחות B - D: הסטודנט t-מבחן שימש; קווי השגיאה להראות את הווריאציה רגיל; n = 4; p < 0.01, * p < 0.05 בהשוואת השיטה החדשה בשיטה המקובלת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : תאים באפידרמיס העיקרי מתקבל על ידי השיטה החדשה הם מסוגלים לשמור על תכונות התאים הבזליים במהלך במבחנה הרחבה. (א) לוח זה מציג ניתוח FACS α6-אינטגרין הביטוי של תאים באפידרמיס על המעבר 3 מטופלים עם Y-27632 (Y-27632, אדום) או ללא Y-27632 (פקד, אפור) עבור ה 48 (B) לוח זה מציג ניתוח כימות של תאים עם גבוה רמות הביטוי של α6-אינטגרין מהחלונית A; α6 גבוהה-אינטגרין הביטוי מוגדר > 10 אות3, * * p < 0.01. (ג) לוח זה מציג תמונות נציג של immunofluorescence מכתים של K5 (אדום) ו loricrin (אדום); דאפי (כחול) שימש כדי להכתים את הגרעינים. פסי בקנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) לוח זה מציג ניתוח כימות של תאים K5 ו loricrin-חיובי. סך של 400 תאים נספרו לכמת כל קבוצה, המספרים הממוצע של תאים K5 ו loricrin-חיובי מוצגים. הניסוי באופן עצמאי חזר על עצמו 4 פעמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : לאחר המעבר הראשונית, תאים אפידרמיס יחסית טהור התקבלו בשיטה החדשה- (א) לוח זה מראה להחליפן בתמונות של immunofluorescence כתמים vimentin (אדום) עבור תאים באפידרמיס-קטעים 0 (P0) ו- 3 (P3); דאפי (כחול) שימש כדי להכתים את הגרעינים. פסי בקנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) לוח זה מציג ניתוח כימות של תאים vimentin-חיוביות על מעברים 0 (P0) ו-1 (P1). סך של 400 תאים נספרו לכמת כל קבוצה, מוצג המספר הממוצע של תאים vimentin-חיוביות. הניסוי באופן עצמאי חזר על עצמו 4 פעמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בתרבית HKCs העיקרי היה להיות מנוצל באופן נרחב לטיפול פצעי במרפאות במשך יותר משלושה עשורים, מאז, זה היה תמיד חשוב ביעילות להשיג מספר מספיק של תאים עבור יישומים קליניים מבעוד. לפיכך, בפועל, השיטה המקובלת בידוד, הדורש את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, מקשה לעמוד בדרישות אלה, בשל התשואה נמוכה של התאים ואת היכולת נמוכה מעבר תאים בוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה החדש שפיתחנו להשיג ביעילות HKCs מרקמות למבוגרים המבוסס על13,הקודם דוחות14, אשר מתאים יותר הן במעבדה והן עבור יישומים קליניים.
תשומת לב יש לשלם את השלבים הקריטיים הבאים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עבור השיטה החדשה. ראשית, ההליך המגון הוא צעד חיוני; המגון לא מספיקות תשפיע את יעילות עיכול אנזימטי ולהוביל תשואה נמוכה של תאים חלופה מועדפת. שנית, הצעד עיכול טריפסין לא אמור לקחת יותר מ 30 דקות; אחרת, הכדאיות של התאים dissociated יקטן. שלישית, לאסוף ביעילות את התאים dissociated, גודל הנקבוביות של מסננת התא המשמש עבור סינון צריך להיות 100 מיקרומטר, מסננת יחיד אמור לשמש כדי לסנן יותר מ 20 מ"ל של הפתרון הסלולרי. רביעית, צפיפות ציפוי הראשונית היא גורם חשוב כדי למזער את הזיהום עם תאי עורי, כי צפיפות גבוהה תא תפחית באופן משמעותי את ההשפעה המעכבת של Y-27632 על עורי תאים. לכן, זה הכרחי לספור במדויק את המספר הכולל של חלופה מועדפת תאים בסוף ההליך בידוד לפני ציפוי.
ראשית, השיטה החדשה ומפשט את תהליך בידוד: ההליך בידוד קונבנציונאלי שני שלבים בדרך כלל לוקח יומיים כדי לבצע ולאחר ההליך זמירה חיוני להסיר לחלוטין את רקמת השומן מהעור, במיוחד עבור רקמות בוגרות ( איור 1); אחרת, יהיו לא יעיל פרידתה של האפידרמיס הדרמיס לאחר לילה עיכול עם dispase. על ידי ניצול של Y-27632, אשר מעכב את התפתחותם של תאים עורי לאחר חיסון13, השיטה החדשה לא צריך להפריד את האפידרמיס הדרמיס, לכן, ההליך זמירה להסיר את רקמת השומן אינו נחוץ לצורך החדש שיטה, אשר רק צריך חצי יום שיש לבצע. שנית, השיטה החדשה גם מפשט את ההליך התרבות מאז, עם השיטה המסורתית, התאים dissociated בדרך כלל מתורבתים בשכבה מזין של העכבר לקרינה fibroblasts בינוני המכיל 10% FBS או בקערה קולגן-precoated. רכיבים מהחי, הם תמיד גורמי סיכון שיש להימנע עבור יישומים קליניים. פיתחנו מדיום נטול נסיוב חיסון ממוזגים (G-בינוני), אשר אינה דורשת צעד precoating עבור מנות תרבות גם משפר את התשואה של ראשי keratinocytes13 כי G-בינוני בשילוב עם Y-27632 מקדם ההחזקה של תאים אפידרמיס לתרבות מגישים13,17,18. לכן, השיטה החדשה מקלה על ההליך תרבות, היא גם הליך בטוח יחסית עבור יישומים קליניים ללא התוספת של רכיבים מהחי. שלישית, השיטה החדשה משפר את התשואה של ראשי תאים באפידרמיס, מקצר את הזמן הראשוני תרבות צריכה להגיע למפגש. לעומת השיטה המסורתית, התשואה של תאים המיוצר על ידי השיטה החדשה היא בסביבות 3 פעמים גבוה יותר, מעבר הראשונית של תאים אפידרמיס הגיעו למפגש לפחות 3 ימים קודם לכן (איור 2). לבסוף, השיטה החדשה יכול להיות מנוצל עבור הבידוד של תאים אפידרמיס מכל הסוגים של דגימות העור, כמו עור הקרקפת שעיר רקמות העור למבוגרים עם שכבת שומן עבה, אשר נבדקו הדו ח הקודם13.
בעלי פוטנציאל HKCs העיקרי היה בשימוש נרחב עבור מחקר מעבדתי, יישומים קליניים. שיטה חדשה מגבירה את הפוטנציאל של תאים בתרבית עם מאפיינים של תאי גזע עוריות13. Y-27632 משפר את הביטוי α6-אינטגרין מאת HKCs, ואחרי שלושה מעברים, יותר מ 90% של תאי אפידרמיס בתרבית הביע קרטין סמן את התאים הבזליים 5, פחות מ-10% של תאי ביטא דה מרקר התמיינות Loricrin, המציין תאים אלה לשמור על המאפיינים של התאים הבזליים של העור לאחר כמה מעברים. התאים באפידרמיס מלאי תרבות יכולים לשקם העור ויוו לאחר הרכבה13, רומז שהם בעלי פוטנציאל התחדשות לאחר הרחבת בתרבות. ראוי לציין, השיטה החדשה הינו אידיאלי לבודד תאים של רקמות בוגרות, כאמור לעיל. לכן, תאים אפידרמיס שהוכנו על ידי שיטה זו יכול לשמש עבור במבחנה , ויוו מודלים ללמוד מחלות עור, ניתן לפתח לתוך מוצרים מבוססי תאים עצמיים ליישומים קליניים כגון לטיפול פצעי עור.
לסיכום, פרוטוקול חדש מספק הליך פשוטה ויעילה לבודד ולהרחיב את ראשי תאים אפידרמיס מרקמות העור למבוגרים. שיטה מתקדמת זו מתאימה יותר לייצר מספר גדול של תאים באפידרמיס בעלי פוטנציאל הן במעבדה והן עבור יישומים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המחקר מפתח הלאומי ועל פיתוח תוכנית של סין (2017YFA0104604), התוכנית הכללית של נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (NSFC, 81772093), מדע, טכנולוגיה פיתוח תוכנית של סאזהאו (ZXL2015128), את מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20161241), ופרס של שאנדונג טאישאן מלומד (tshw201502065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C.
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E.
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
