Summary
Her presenterer vi en protokoll for å effektivt isolere primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud vev. Denne metoden forenkler konvensjonelle prosedyren ved hjelp av ROCK hemmer Y-27632 i inoculation medium spontant skille epidermal celler fra dermal celler.
Abstract
Primære menneskelige keratinocytter isolert fra frisk hud vev og deres ekspansjon i vitro har vært mye brukt for laboratorieundersøkelser og kliniske applikasjoner. Metoden konvensjonelle isolasjon av menneskelig keratinocytter innebærer en to-trinns sekvensiell enzymatisk fordøyelsen prosedyren, som har vist seg for å være ineffektive generere primære celler fra voksen vev lav celle utvinningsgrad og redusert celle levedyktighet. Vi har nylig rapportert en avansert metode å isolere menneskelige primære epidermal progenitor celler fra huden vev som benytter den Rho kinase inhibitor Y-27632 i medium. Sammenlignet med tradisjonelle protokollen, denne nye metoden er enklere, enklere og mindre tidkrevende, og øker epithelial stamcelleforskningen avkastning og forbedrer karakteristikkene stilk cellen. Videre den nye metodikken krever ikke separasjon av overhuden fra huden, og er derfor egnet for isolere celler fra ulike typer voksen vev. Denne nye isolasjon metoden overvinner de store manglene av konvensjonelle metoder og er mer egnet for å produsere store mengder epidermal celler med høy styrke både for laboratorier og kliniske applikasjoner. Her beskriver vi den nye metoden i detalj.
Introduction
Målet var å utvikle en enkel og effektiv protokoll for å isolere primære menneskelige keratinocytter (HKCs) fra voksen vev, spesielt for klinisk bruk. Huden epidermal stamceller, lokalisert i basale laget av huden, har et stort potensial til å spre og differensiere og gi keratinocytter for å beholde funksjonene av huden1,2,3, 4. HKCs isolert fra huden vev brukes for huden vev engineering og gjenfødelse, spesielt i reparasjon av skadet hud og i genterapi for klinisk bruk5,6. Hovedspørsmålet for HKC-baserte programmer er effektivt isolere og utvide stort antall HKCs med høyt potensial i vitro7,8. Selv om forskjellige forskningsgrupper har utviklet metoder for å produsere kulturer av stilk-lignende HKCs, er disse metodene ofte tidkrevende og komplisert å utføre og har andre begrensninger, som lav celle avkastning og å være begrenset av huden prøven brukt9. For eksempel innebærer den tradisjonelle metoden å isolere HKCs fra hudvevet en Totrinns enzymatisk fordøyelsen med en separasjon av overhuden dermis6. Denne metoden fungerer vanligvis bra for neonatal vev, men det blir svært vanskelig når isolere celler fra voksen vev.
Y-27632, en inhibitor av Rho-assosiert protein kinase (ROCK), har blitt rapportert å betydelig forbedre effektiviteten av epidermal stamcelleforskningen isolasjon og kolonien vekst10,11,12. I en tidligere studie oppdaget vi at Y-27632 forenkler klonal veksten av epidermal celler, men reduserer avkastningen av dermal celler med ulikt kontrollere uttrykket av vedheft molekyler13. Vi har også etablert et nytt betinget inoculation medium, kalt G-medium, som støtter vekst og avkastning på primære epidermal celler. Ved å kombinere G-medium med Y-27632, kan denne romanen metoden spontant skille epidermal og dermal celler etter enzym fordøyelsen, dermed fjerne trinnet overhuden-dermis separasjon13,14. Basert på tidligere rapporter, beskrive vi nå den detaljert prosedyren av denne nye metoden å isolere HKCs fra voksen hud vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelig vev som er brukt i denne protokollen er håndtert i henhold til retningslinjene i institusjonens menneskelige forskning etikk (NO.2015120401, dato: 12 mai 2015).
1. forberedelser
- Samle friske voksne abdominal huden vev utrangert fra plastisk kirurgi på sykehuset i en 50-mL tube med 10 mL av iskalde Dulbecco modifiserte Eagle medium (DMEM). Prøven kan holdes på 4 ° C i opptil 72 h uten betydelig påvirker celle levedyktighet.
- Forberede reagenser og kultur medium som beskrevet nedenfor.
- Legge til 1 mL av penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 mg/L) 50 mL av fosfat-bufret løsning (PBS) å forberede vask løsningen.
- Forberede to sett av enzymet fordøyelsen løsninger: (1) forberede 50 mL av dispase (2,5 mg/mL i DMEM) og 50 mL av type jeg collagenase (2,5 mg/mL i DMEM) separat for konvensjonelle metoden; og (2) forberede 50 mL av en blanding av dispase og skriver jeg collagenase (oppløses 125 mg av dispase pulver og 125 mg type jeg collagenase pulver i 50 mL av DMEM) for den nye metoden.
Merk: Alle enzym løsninger skal filtreres med en 0.22-µm sil og holdt at4 ° C. - Forberede fordøyelsen løsninger for begge metoder: 0,05% trypsin og 0,25% trypsin ble kommersielt kjøpt. Forberede en 10 mg/mL DNase jeg løsningen ved å løse opp 50 mg DNase jeg pulver i 5 mL av PBS, filtrere det med en 0.22-µm sil, og lagre den på 20 ° C.
- Forberede 500 mL medium å nøytralisere enzymatisk fordøyelsen: DMEM medium med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin.
- Forberede 500 mL inoculation medium (vekst faktor-inneholder medium, kalt G-medium): DMEM/F12 (3:1) medium som inneholder 1% penicillin/streptomycin, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2), 20 ng/mL til epidermal vekstfaktor (EGF), og 2% B27 supplement.
- Pretreat 100 mm cellekultur retter med 2 mL belegg matrise som inneholder typen jeg kollagen i 30 min ved romtemperatur.
2. tradisjonell metoden
-
Huden vev forbehandling
- 1,5 cm2 av hud vev og vaskes det 1 x med 10 mL PBS; deretter skylle den med 10 mL av 70% etanol for 30 s og Inkuber det 2 x med 10 mL vaske løsning (PBS som inneholder 2% penicillin og streptomycin), 5 minutter hver.
Merk: Alle vasker utføres 100 mm celle kultur retter i laminær strømning hette. - Trim vevet med sterilt saks å fjerne subkutant fett laget i en 100 mm celle kultur parabol, og deretter veie huden vev (vekten er 1 g i denne protokollen).
Merk: Tilstrekkelig trimming er svært avgjørende for effektiv separasjon av overhuden fra huden. Gulaktig fett laget kan lett skilles visuelt. - Overføre vev til en annen 100 mm sterilt rett med dermis side ned, og deretter klippet huden vev i 3-4 mm bred strimler ved hjelp av en skalpell blad.
Merk: Siden dermis med fett laget er lett gjenkjennelige visuelt. - Legg 10 mL 2,5 mg/mL dispase løsning på huden vev i en 100 mm kultur parabol og deretter ruge parabolen overnatting på 4 ° C (ikke mer enn 20 h).
Merk: Mengden dispase løsning kan beregnes ved hjelp av 10 mL dispase løsning for fordøyelsen av hvert gram vev.
- 1,5 cm2 av hud vev og vaskes det 1 x med 10 mL PBS; deretter skylle den med 10 mL av 70% etanol for 30 s og Inkuber det 2 x med 10 mL vaske løsning (PBS som inneholder 2% penicillin og streptomycin), 5 minutter hver.
-
Separasjon av overhuden fra huden vev
- På den andre dagen, løsner overhuden fra huden ved hjelp av fine pinsett.
Merk: Hvis det er vanskelig å skrelle av overhuden, dispase fordøyelsen ikke var tilstrekkelig, noe som vanligvis skyldes utilstrekkelig trimming av vev. I dette tilfellet trenger vevet lengre inkubasjon tid. - Hakke skrelles epidermis med 500 µL av celle kultur medium i en vev slurry med skalpell blad; deretter resuspend det med 10 mL 0,25% trypsin i en 50-mL tube og ruge det 20 min i et vannbad ved 37 ° C, med skjelvende.
- På den andre dagen, løsner overhuden fra huden ved hjelp av fine pinsett.
-
Innsamling og dyrking av primære celler
- Nøytralisere trypsin aktiviteten ved å legge til en lik mengde nøytralisering løsning (10 mL i denne protokollen).
- Dissociate epidermal cellene av pipettering løsningen opp og ned 20 x med en 10-mL serologisk pipette og celle løsningen passere en 100 µm celle sil for å fjerne eventuelle gjenværende vev rusk.
- Sentrifuge celle løsningen på 200 x g i 5 min etter filtrering; resuspend celle pellet i nøytralisering medium for vask og deretter virvel det igjen på 200 x g å få celle pellets.
- Resuspend celle pellet i 10 mL av lav-kalsium, serum-free keratinocyte medium (SFM). Ta 10 µL av løsningen skal beregne totalt-cellen, og deretter tallerkenen ca 2 x 106 celler med 10 mL SFM i 100 mm celle kultur retter forbehandlet med belegg matrix (som inneholder type jeg kollagen).
Merk: Belegg er et nødvendig skritt for det tradisjonelle metoden. - Endre kultur medium hver 2 d.
Merk: Se celle vedheft under et mikroskop før og etter bytte kultur medium. - Passasje cellene når de kommer rundt 80% samløpet.
Merk: Alle kultur-retter er forbehandlet med belegg matrix.
3. ny metode
-
Huden vev forbehandling
- Samle vev som beskrevet ovenfor (trinn 2.1) for det tradisjonelle metoden.
- Vask huden vev 1 x med 10 mL PBS og, deretter, veie den i en steril plast container ved en elektronisk skala (vekten er rundt 1 g i denne protokollen).
Merk: Minimum vekten av vev behov for denne protokollen er 0,1 g, siden det er vanskelig å få et tilstrekkelig antall celler hvis vev prøven brukt er for liten. Det er ingen maksimal vekt av vev for denne protokollen, som avhenger av håndtering kapasitet operatør. - Bruk tang til å rense huden vev med 10 mL 70% etanol for 30 s.
- Inkuber vev 2 x med 10 mL vaske løsning (forberedt i trinn 2.1.1), etter 5 min hver gang.
Merk: Alle vask trinnene ovenfor utføres 100 mm celle kultur retter i laminær strømning hette (vev kultur hette). - Overføre vev til en annen 100 mm celle kultur sterilt rett.
- Bruker skalpell blader, hakke vevet grundig inn i en vev slurry.
- Legge til 200 µL av PBS hver 5 minutter for å holde vev våt.
Merk: Ta ca 15 min for trinn 3.1.5 - 3.1.7. Alle punktene ovenfor utføres ved romtemperatur.
-
Fordøyelsen av hud vev
- Overføre homogenisert vev-løsning til en 50-mL tube. Legge til 10 mL av enzymet blandingen for hver 1 g hud vev. Bland enzymer grundig med homogenisert vev.
- Inkuber blandingen med risting i et vannbad ved 37 ° C i 1 time.
- Legg til et 1/5-volum av 0,25% trypsin (2.5 mL i denne protokollen) til fordøyelsen blanding for en annen 30 min i et vannbad på 37 ° C.
- Legge til DNase jeg løsningen enzym blandingen i 1: 100 (v/v) forholdet (250 µL i denne protokollen) og Inkuber det i 5 minutter ved romtemperatur.
-
Innsamling og dyrking av primære celler
- Stopp fordøyelsen prosessen ved å legge 12.5 mL nøytralisering medium i en 1:1 ratio. Pipetter løsningen opp og ned for om 20 x, med en 10-mL serologisk pipette for å distansere cellene.
- Filtrere dissosiert cellene gjennom en 100 µm celle sil for å fjerne vev rusk. Sentrifuge nedbryting på 200 x g for 5 min. observere pellet nederst på røret.
- Forkast nedbryting og vask celle pellets med 10 mL nøytralisering medium og sentrifuger igjen på 200 x g i 5 min å samle cellene.
- Resuspend celle pellet i 10 mL av vaksinering medium (G-medium fra trinn 1.2.5) med 10 µM av Y-27632.
- Ta 10 µL av løsningen å beregne total-cellen, og deretter plate ca 2 x 106 celler med 10 mL av G-medium i en 100 mm celle kultur parabol.
NOTE Det precoating trinnet er ikke nødvendig for den nye metoden, og ingen fjerning av dermal laget kreves enten. - Etter 3 d, erstatte inoculation mediet med lav-kalsium SFM medium. Endre kultur medium hver 2 d.
Merk: Se celle vedheft før og etter bytte medium. - Passasje cellene når de kommer rundt 80% samløpet.
Merk: Om nødvendig pretreat cellene med 0,05% trypsin i 2 minutter og vask cellene med PBS fjerne forurensende dermal celler før trypsinizing epidermal cellene.
4. cellen Passaging
- Fjerne mediet, vaske cellene med PBS, og legg deretter til 2 mL 0,05% trypsin (per hver 100 mm rett).
- Inkuber cellene i en inkubator (37 ° C med 5% CO2) i 5 min.
- Sjekk celler ved hjelp av et mikroskop at alle celler har koblet fra kultur parabolen.
- Legge til 8 mL av DMEM med 10% FBS å nøytralisere den enzymatiske reaksjonen, og deretter samle cellene i en 15-mL tube.
- Sentrifuge 200 x g i 5 minutter å få det cellen pellet.
- Fjerne nedbryting sakte og deretter resuspend celle pellets med 10 mL SFM medium og telle antall celler.
- Plate 1 x 106 celler med 10 mL SFM i hver 100 mm cellen rett.
- Endre mediet hver 2 d.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjematisk diagrammer av den nye metoden (figur 1A) og det tradisjonelle metoden (figur 1B) presenteres i figur 1. Det tradisjonelle metoden er en totrinns fordøyelsen, som krever en 2-dagers prosedyre. Den nye metoden er derimot en ettrinns fordøyelsen, som tar rundt 3 timer utføre. Viktigere, kan ettrinns nye metoden få to bestander (epidermal og dermal celler) samtidig, som avhenger av tilstedeværelsen av Y-27632 i inoculation medium. Videre er første kultur tid epidermal celler å nå rundt 80% samløpet vanligvis tar minst 3 dager mindre enn det tradisjonelle metoden hvis samme antall celler er inokulert etter isolasjon.
Den nye metoden gir mer primære epidermal celler, som vokser i en koloni morfologi. De isolerte HKCs fra huden vev ble inokulert med G-medium som inneholder Y-27632. Samme antall celler var belagt etter det tradisjonelle metoden som kontrollen. Representant bilder av epidermal cellene på dager 3 og 5 etter første inoculation vises i figur 2A. Cellene fra den nye metoden tendens til å vokse som en koloni morfologi. Vekstkurven etter vaksinering ble vurdert at en celle teller kit-8 (CCK-8) på forskjellige tidspunkt etter vaksinering (figur 2B), og dobling tid er rundt 3-4 dager for cellene utarbeidet av den nye metoden, men er ca 6-8 dager for den tradisjonell metoden. På dag 7, ble avkastningen av celler beregnet. Resultatene vises i figur 2C, som viser at den nye metoden gitt tre ganger flere celler enn det tradisjonelle metoden, og at tiden det tar å nå samløpet etter første inoculation var minst 3 dager mindre (figur 2D). På dag 7 nådd epidermal cellene samløpet med den nye metoden, men ikke med det tradisjonelle metoden (figur 2D).
Den nye metoden forbedret uttrykk for α6-integrin av primære cellene. Α6-integrin har vist seg å være svært uttrykt av epidermal stamceller15. Celler isolert ved den nye metoden vedlikeholdes karakteristikkene av basal hudceller etter flere passasjer. Kolonien vekst er en av karakteristikkene av epidermal stamceller hentet fra det basale laget av huden, og høy α6-integrin uttrykk er en annen funksjon av disse epidermal stamceller. Vi fant at tillegg av Y-27632 betydelig økt uttrykk for α6-integrin i epidermal celler på passering 3 (Figur 3A-B), og på passering 3, epidermal celler isolert med den nye metoden viser ingen kontaminering av dermal celler 13. det er svært viktig å opprettholde funksjonene basal cellen etter flere passasjer under i vitro utvidelse. Immunofluorescence (hvis) analyse av basal celle markør keratin 5 og terminal differensiering markør loricrin16 ble utført med disse cellene etter tre passasjer. Vi fant at 90% av alle celler var K5-positiv, men mindre enn 10% av dem uttrykt loricrin (Figur 3 c - 3D). Disse resultatene indikerer at primære HKCs isolert med den nye metoden inneholder en epidermal stamcelleforskningen befolkning og kan opprettholde de karakteristiske trekk ved basal celler. Men jo lenger at HKCs er passaged, jo mer de begynner å skille. Ved den nye metoden fant vi at epidermal celler kulturperler i vitro kunne opprettholde deres evne til spredning til passering 8. Til slutt, vi testet renheten av epidermal celler isolert bruke den nye metoden, siden en blanding av epidermal og dermal celler ble inokulert rett etter isolasjon. En kort tid (2-3 min) ved behandling med trypsin å fjerne noen dermal celler forurensende første kulturen, ble ren innbyggere epidermal celler oppnådd etter en passasje (Figur 4).
Figur 1 : Sammenligning av nye og konvensjonelle isolering prosedyrer. (A) dette panelet viser en skjematisk fremstilling av metoden for nye isolasjon. På dag 1, er dissosiert hudceller inokulert i G-medium med eller uten Y-27632. I nærvær av Y-27632 for 2 dager utvide epidermal cellene selektivt. Rundt dag 6, nå cellene en tetthet tilstrekkelig nok for passaging. (B) dette panelet viser en skjematisk fremstilling av metoden konvensjonelle isolasjon. Overhuden er atskilt fra dermis epidermal cellene er isolert på dag 2, og vanligvis cellene nå en tetthet tilstrekkelig nok for passaging på rundt 10 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Den nye isolasjon metoden øker avkastningen av primære epidermal celler. (A) dette panelet viser representant bilder av epidermal celler forberedt ved den nye metoden (øverste rad) og av det tradisjonelle metoden (nederste rad) dager 3 og 5 etter første inoculation. Skala barer = 200 µm. (B) primære HKCs utarbeidet av den nye og den konvensjonelle metoder var samlet på angitt tidspunkt for analyse av levedyktig celler ved hjelp av en celle teller kit-8 (CCK-8). (C) antall celler utarbeidet av den nye metoden og av det tradisjonelle metoden ble talt på dagen 7 etter vaksinering. (D) gjennomsnittlig tid å nå samløpet av primære epidermal celler (passasje 0) vises for både nye isolasjon metoden og det tradisjonelle metoden. For paneler B - D: Student t-test ble brukt; de viser standardvariasjon; n = 4; p < 0,01, * p < 0.05 når du sammenligner den nye metoden med det tradisjonelle metoden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Primære epidermal celler ved den nye metoden er kjøpedyktig vedlikeholde basal celle funksjoner under i vitro utvidelse. (A) dette panelet viser en FACS analyse av α6-integrin uttrykk for epidermal celler ved passering 3 behandlet med Y-27632 (Y-27632, rød) eller uten Y-27632 (kontroll, grå) for 48 h. (B) dette panelet viser en kvantifisering analyse av celler med høy uttrykket nivåer av α6-integrin panelet A; høy α6-integrin uttrykk er definert som en signal > 103, ** p < 0,01. (C) dette panelet viser representant bilder av immunofluorescence flekker K5 (rød) og loricrin (rød); DAPI (blå) ble brukt stain kjerner. Skala barer = 100 µm. (D) dette panelet viser en kvantifisering analyse av K5 - og loricrin-positiv celler. Totalt 400 celler ble regnet for å kvantifisere hver gruppe, og gjennomsnittlig antall K5 - og loricrin-positiv celler vises. Eksperimentet ble uavhengig gjentatt 4 ganger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Etter første passering, ren epidermal celler ble hentet ved hjelp av den nye metoden. (A) dette panelet viser representant bilder av immunofluorescence farging av vimentin (rød) for epidermal celler på passasjer 0 (P0) og 3 (P3); DAPI (blå) ble brukt stain kjerner. Skala barer = 50 µm. (B) dette panelet viser en kvantifisering analyse av vimentin-positive cellene på passasjer 0 (P0) og 1 (P1). Totalt 400 celler ble regnet for å kvantifisere hver gruppe, og gjennomsnittlig antall vimentin-positive celler vises. Eksperimentet ble uavhengig gjentatt 4 ganger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kultivert primære HKCs har blitt mye utnyttet for å behandle sår i klinikker i mer enn tre tiår, og siden den gangen, det er alltid viktig å effektivt få tilstrekkelig antall celler for klinisk bruk i tide. Derfor, i praksis metoden konvensjonelle isolasjon som krever separasjon av overhuden fra huden, gjør det vanskelig å møte disse kravene, på grunn av lav avkastningen av celler og lav evnen å passasje voksen celler. Her beskriver vi en ny enkel metode vi utviklet å effektivt hente HKCs fra voksen vev basert på tidligere rapporter13,14, som er mer egnet både for laboratorier og kliniske applikasjoner.
Oppmerksomhet må betales til følgende viktige trinn å oppnå de beste resultatene for den nye metoden. Først er homogenisering prosedyren et viktig skritt; utilstrekkelig homogenisering påvirker tydelig effektiviteten av enzymatisk fordøyelsen og resultere i en lav avkastning dissosiert celler. Andre bør trypsin fordøyelsen trinn ikke ta mer enn 30 min; ellers reduseres levedyktigheten til dissosiert cellene. Tredje, for å effektivt samle dissosiert cellene, porestørrelse av cellen silen brukes for filtrering skal 100 µm, og en enkelt sil bør brukes til å filtrere mer enn 20 mL av cellen løsningen. Fjerde er tettheten av den første plating en viktig faktor å redusere forurensning med dermal celler, fordi en høyt tetthet vil redusere den hemmende effekten av Y-27632 på dermal celler. Derfor er det avgjørende for å telle antall dissosiert celler på slutten av isolasjon prosedyren før plating.
Først, den nye metoden forenkler isolasjon prosedyren: totrinns konvensjonelle isolasjon prosedyren tar vanligvis 2 dager å utføre, og trimming prosedyren er avgjørende å fjerne fett vev fra huden, spesielt for voksen vev ( Figur 1); ellers vil det være en ineffektiv separasjon av overhuden fra dermis etter overnatting fordøyelsen med dispase. Ved hjelp av Y-27632, som hemmer veksten av dermal celler etter vaksinering13, den nye metoden trenger ikke skille overhuden fra dermis og derfor trimming prosedyren for å fjerne fett vev er ikke nødvendig for den nye metoden, som trenger bare en halv dag skal utføres. Andre, den nye metoden også forenkler kulturen prosedyren siden, med den tradisjonelle metoden, dissosiert cellene er vanligvis kultivert på et mater lag av bestrålt musen fibroblaster medium som inneholder 10% FBS eller i en kollagen-precoated rett. Animalske komponenter er alltid risikofaktorer som bør unngås for klinisk bruk. Vi utviklet et serum-free betinget inoculation medium (G-medium), som ikke krever et precoating skritt for kultur retter og forbedrer også avkastningen av primære keratinocytter13 fordi G-medium kombinert med Y-27632 fremmer feste epidermal celler til kultur parabol13,17,18. Derfor den nye metoden muliggjør kulturen prosedyren og er også en relativt trygg prosedyre for klinisk bruk uten tilsetning av animalske komponenter. Tredje, den nye metoden forbedrer avkastningen av primære epidermal celler og forkorter første kultur tiden det tar å nå samløpet. Sammenlignet med den tradisjonelle metoden, avkastningen av celler produsert ved den nye metoden er rundt 3 ganger høyere, og første passering av epidermal celler nådd samløpet minst 3 dager tidligere (figur 2). Til slutt, den nye metoden kan benyttes for isolering av epidermal celler fra alle typer hud prøver, som hårete hodebunnen hud og voksen hud vev med et tykt fett lag, som har blitt testet i en tidligere rapport13.
Høyt potensial primære HKCs har vært mye brukt for laboratorieundersøkelser og kliniske applikasjoner. Denne nye metoden øker potensialet i kulturperler celler med karakteristikker av epidermal stamceller13. Y-27632 forbedrer α6-integrin uttrykket HKCs, og etter tre ganger, mer enn 90% av kultivert epidermal cellene uttrykte basal celle markør keratin 5, og mindre enn 10% av cellene uttrykte differensiering markøren Loricrin, som indikerer at disse cellene beholde egenskapene til basal hudceller etter flere passasjer. Kultur-utvidet epidermal cellene kan gjeninnføre huden i vivo etter pode13, tyder på at de har gjenfødelse potensielle etter utvidelse i kultur. Spesielt er den nye metoden ideelt å isolere celler fra voksen vev, som nevnt ovenfor. Derfor epidermal celler utarbeidet av denne metoden kan brukes for i vitro og i vivo modeller for å studere hudsykdommer og kan bli utviklet til autologous celle-baserte produkter for klinisk bruk som behandling av sår på huden.
I sammendraget inneholder den nye protokollen en forenklet og effektiv fremgangsmåte for å isolere og utvide primære epidermal celler fra voksen hud vev. Denne avanserte metoden er mer egnet for å produsere et stort antall høyt potensial epidermal celler både for laboratorier og kliniske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (2017YFA0104604), General programmet av National Natural Science Foundation i Kina (NSFC, 81772093), vitenskap og teknologi utvikling programmet Suzhou (ZXL2015128), Natural Science Foundation av Jiangsu provinsen (BK20161241), og en Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C.
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E.
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
