Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att effektivt isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxna huden vävnader. Denna metod förenklar förfarandet för konventionella genom att spontant skilja epidermala celler från dermal celler med den ROCK hämmare Y-27632 inympning medium.
Abstract
Primära mänskliga keratinocyter isolerade från friska huden vävnader och deras expansion i vitro har använts för laboratorieforskning och kliniska tillämpningar. Metoden konventionell isolering av mänskliga keratinocyter innebär ett tvåstegsförfarande sekventiell enzymatisk nedbrytning, som har visat sig vara ineffektiva i att generera primära celler från vuxna vävnader på grund av den låga cell återvinningsgrad och minskad cell lönsamhet. Vi rapporterade nyligen en avancerad metod att isolera människans primära epidermal stamceller från hudvävnader som utnyttjar den Rho tyrosinkinashämmare Y-27632 medium. Jämfört med traditionella protokollet, denna nya metod är enklare, lättare och mindre tidskrävande, och ökar epitelial stamceller avkastning och ökar deras stamceller egenskaper. Dessutom den nya metoden kräver inte separation av överhuden från läderhuden, och, därför, är lämplig för att isolera cellerna från olika typer av vuxna vävnader. Denna nya metod för isolering övervinner de stora bristerna i konventionella metoder och är mer lämplig för att producera stora mängder epidermala celler med hög potens både laboratorium och kliniska tillämpningar. Här beskriver vi den nya metoden i detalj.
Introduction
Målet var att utveckla ett enkelt och effektivt protokoll för att isolera primära mänskliga keratinocyter (HKCs) från vuxna vävnader, särskilt för kliniska tillämpningar. Epidermal hudstamceller, lokaliserade i de basala lagret av huden, besitter en hög potential att föröka sig och differentiera och tillhandahålla keratinocyter för att bibehålla funktionerna av hud1,2,3, 4. HKCs isolerade från huden vävnader används allmänt för huden vävnad engineering och regenerering, särskilt i reparation av skadad hud och genterapi för kliniska tillämpningar5,6. Nyckelfrågan för HKC-baserade program är att effektivt isolera och expandera stort antal HKCs med hög potential in vitro7,8. Även om olika forskargrupper har utvecklat metoder för att producera kulturer av stem-liknande HKCs, är dessa metoder ibland tidskrävande och komplicerat att utföra och har andra begränsningar, såsom lågt avkastning och begränsas av typ av huden preparatet använde9. Till exempel innebär den traditionella metoden att isolera HKCs från hudvävnader en två-stegs enzymatisk nedbrytning med en separation av överhuden från läderhuden6. Metoden fungerar oftast bra för neonatal vävnader, men det blir mycket svårt när den används att isolera celler från vuxna vävnader.
Y-27632, en hämmare av Rho-associerade proteinkinas (ROCK), har rapporterats att väsentligt öka effektiviteten av epidermal stem cell isolering och kolonin tillväxt10,11,12. I en tidigare studie upptäckte vi att Y-27632 underlättar klonal tillväxt av epidermala celler men minskar avkastningen av dermal celler av differentially kontrollerar uttrycket av vidhäftning molekyler13. Vi har också etablerat ett nytt luftkonditionerade inympning medium, kallas G-medium, som stöder tillväxt och avkastning av primära epidermala celler. Genom att kombinera G-medium med Y-27632, kan denna nya metod spontant separera dermala och epidermala celler efter enzym matsmältningen, därmed undanröja steget epidermis-dermis separation13,14. Baserat på tidigare rapporter, beskriver vi nu detaljerade förfarandet för denna nya metod att isolera HKCs från vuxen hudvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga vävnader som används i detta protokoll har hanterats enligt riktlinjerna för institutionens mänskliga forskningsetisk kommitté (NO.2015120401, datum: 12 maj 2015).
1. förberedelser
- Samla friska vuxna bukhuden vävnader kasserad från plastikkirurgi på sjukhuset i en 50 mL tub med 10 mL iskallt Dulbecco ändrade Eagle medium (DMEM). Preparatet kan förvaras vid 4 ° C i upp till 72 h utan att signifikant påverka cellviabiliteten.
- Förbereda reagenser och odlingsmedium som beskrivs nedan.
- Tillsätt 1 mL av penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 mg/L) till 50 mL fosfatbuffrad lösning (PBS) att förbereda tvättlösningen.
- Förbered två uppsättningar av enzymet matsmältningen lösningar: (1) förbereda 50 mL av dispase (2,5 mg/mL i DMEM) och 50 mL typ I kollagenas (2,5 mg/mL i DMEM) separat för den konventionella metoden; och (2) förbereda 50 mL av en blandning av dispase och typ I kollagenas (lös 125 mg dispase pulver och 125 mg typ I kollagenas pulver i 50 mL DMEM) för den nya metoden.
Obs: Alla enzym lösningar bör filtreras med en 0,22 µm sil och höll at4 ° C. - Förbereda matsmältningen lösningar för båda metoderna: 0,05% trypsin och 0,25% trypsin köptes kommersiellt. Förbereda en 10 mg/mL DNAS jag lösning genom att lösa upp 50 mg DNAS jag pulver i 5 mL PBS, filtrera det med en 0,22 µm sil och lagra den på-20 ° C.
- Förbereda 500 mL medium att neutralisera enzymatisk nedbrytning: DMEM medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin.
- Förbereda 500 mL inympning medium (tillväxt-faktor-innehållande medel, kallas G-medium): DMEM/F12 (3:1) medium som innehåller 1% penicillin/streptomycin, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast tillväxtfaktor 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermal tillväxtfaktor (EGF), och 2% B27 supplement.
- Förbehandla 100 mm cellkultur rätter med 2 mL beläggning matris som innehåller typ I kollagen i 30 min i rumstemperatur.
2. konventionell metod
-
Huden vävnad förbehandling
- Ta 1,5 cm2 av hudvävnad och tvätta det 1 x med 10 mL PBS; sedan skölj med 10 mL 70% etanol för 30 s och inkubera det 2 x med 10 mL tvättlösningen (PBS som innehåller 2% penicillin och streptomycin), 5 min varje.
Obs: Alla tvättar utförs i 100 mm cell kultur rätter inuti en LAF. - Trimma vävnaden med steril sax för att ta bort subkutana fettlagret i en 100 mm cell kultur maträtt och, sedan, väger i vävnaden (vikt är 1 g i detta protokoll).
Obs: Tillräcklig trimning är mycket avgörande för effektiv separation av överhuden från läderhuden. Gulaktigt fett lager kan lätt skiljas visuellt. - Överföra vävnad till en annan 100 mm steril maträtt med dermis sida ner och, sedan, strimlat hudvävnaden 3 - till 4-mm-wide med hjälp av en skalpell blad.
Obs: Dermis sidan med fett lager identifieras enkelt visuellt. - Tillsätt 10 mL 2,5 mg/mL dispase lösning till hudens vävnader i en 100 mm kultur maträtt och, sedan, inkubera skålen över natten vid 4 ° C (mer än 20 h).
Obs: Dispase lösning kan beräknas genom att använda 10 mL dispase lösning för rötning av varje gram vävnad.
- Ta 1,5 cm2 av hudvävnad och tvätta det 1 x med 10 mL PBS; sedan skölj med 10 mL 70% etanol för 30 s och inkubera det 2 x med 10 mL tvättlösningen (PBS som innehåller 2% penicillin och streptomycin), 5 min varje.
-
Separation av epidermis från huden vävnad
- Den andra dagen, lossna överhuden från läderhuden med fin pincett.
Obs: Om det är svårt att skala bort överhuden, dispase matsmältningen var inte tillräcklig, vilket oftast beror på otillräcklig trimning av vävnad. I det här fallet behöver vävnaden en längre inkubationstid. - Finhacka den skalade epidermisen med 500 µL av cellodlingsmedium i en vävnad slurry med skalpell blad; sedan blandas det med 10 mL i en 50 mL tub trypsin på 0,25% och inkubera det 20 min i ett vattenbad vid 37 ° C, med skakningar.
- Den andra dagen, lossna överhuden från läderhuden med fin pincett.
-
Insamling och odling av primära celler
- Neutralisera aktiviteten trypsin genom att lägga till en lika stor volym av neutralisering lösning (10 mL i detta protokoll).
- Separera de epidermala cellerna genom pipettering lösningen upp och ner 20 x med en 10 mL serologiska pipett och passera en 100 µm cell sil för att avlägsna eventuella kvarvarande vävnad skräp cell lösningen.
- Centrifugera cell lösningen vid 200 x g i 5 min efter filtrering; Återsuspendera cellpelleten i neutralisering medium för tvätt och sedan Centrifugera det igen 200 x g att få cellpelleten.
- Återsuspendera cellpelleten i 10 mL av låg-kalcium, serumfritt keratinocyter medium (SFM). Ta 10 µL av denna lösning att räkna den totala mobilnummer och, sedan, platta 2 x 106 celler med 10 mL av SFM i 100 mm cell kultur rätter förbehandlats med beläggning matrix (som innehåller typ I kollagen).
Obs: Beläggning är ett nödvändigt steg för den konventionella metoden. - Ändra odlingssubstratet varje 2 d.
Obs: Kontrollera celladhesion under ett Mikroskop före och efter byte odlingssubstratet. - Passagen cellerna när de når ca 80% sammanflödet.
Obs: Alla kultur rätter är förbehandlade med matrisen beläggning.
3. den nya metoden
-
Huden vävnad förbehandling
- Samla vävnaden som beskrivs ovan (steg 2.1) för den konventionella metoden.
- Tvätta huden vävnad 1 x med 10 mL PBS och, sedan, väger den i en steril plastbehållare av en elektronisk våg (vikten är cirka 1 g i detta protokoll).
Obs: Minsta vävnad som behövs för detta protokoll väger 0,1 g, eftersom det är svårt att få ett tillräckligt antal celler om vävnad preparatet används är för liten. Det finns ingen maximal vikt vävnad för detta protokoll, som i slutändan beror på operatören hantering kapacitet. - Använd tången för att skölja huden vävnad med 10 mL 70% etanol för 30 s.
- Inkubera vävnaden 2 x med 10 mL tvättlösningen (bereddes i steg 2.1.1), för 5 min varje gång.
Obs: Alla tvätt steg ovan utförs i 100 mm cell kultur rätter inuti en LAF (en vävnadskultur huva). - Överföra vävnad till en annan 100 mm cell kultur sterila maträtt.
- Med hjälp av skalpell blad, finhacka vävnaden grundligt i en vävnad slurry.
- Tillsätt 200 µL av PBS varje 5 min för att hålla vävnader våt.
Obs: Ta omkring 15 min för steg 3.1.5 - 3.1.7. Alla stegen ovan utförs i rumstemperatur.
-
Nedbrytning av hudvävnad
- Över homogeniserad vävnad lösningen till en 50 mL tub. Tillsätt 10 mL av enzymet blandning för varje 1 g av hudvävnad. Blanda enzymerna med homogeniserad vävnader.
- Inkubera blandningen med skakningar i vattenbad vid 37 ° C i 1 h.
- Tillsätt en 1/5 volym av 0,25% trypsin (2,5 mL i detta protokoll) till matsmältningen blandningen för en annan 30 min i ett vattenbad vid 37 ° C.
- Lägg till DNAS jag lösningen till enzymet blandningen i förhållandet 1: 100 (v/v) (250 µL i detta protokoll) och inkubera det för 5 min i rumstemperatur.
-
Insamling och odling av primära celler
- Stoppa rötningsprocessen genom att lägga till 12,5 mL neutralisering medium i förhållandet 1:1. Pipettera lösningen upp och ner för ca 20 x, med 10 mL serologiska pipett för att separera celler.
- Filtrera dissocierade cellerna genom en 100 µm cell SIL att ta bort vävnad skräp. Centrifugera supernatanten vid 200 x g för 5 min. Observera pelleten på botten av röret.
- Avlägsna supernatanten och tvätta cellpelleten med 10 mL neutralisering medium och centrifugera igen vid 200 x g i 5 min att samla cellerna.
- Återsuspendera cellpelleten i 10 mL av inympningen medium (G-medium från steg 1.2.5) med 10 µM av Y-27632.
- Ta 10 µL av lösningen för att räkna antalet totala cell och, sedan, platta 2 x 106 celler med 10 mL G-medium till en 100 mm cell kultur maträtt.
Obs: Det precoating steget är inte nödvändigt för den nya metoden, och ingen borttagning av dermal lager krävs antingen. - Efter 3 d, ersätta inympning medium med låg-kalcium SFM medium. Ändra odlingssubstratet varje 2 d.
Obs: Kontrollera celladhesion före och efter byte av medium. - Passagen cellerna när de når ca 80% sammanflödet.
Obs: Om det behövs, förbehandla cellerna med 0,05% trypsin i 2 min och tvätta cellerna med PBS ta bort kontaminerande dermal celler innan trypsinizing de epidermala cellerna.
4. cell Passaging
- Ta bort mediet, tvätta cellerna med PBS och, sedan, tillsätt 2 mL av 0,05% trypsin (per varje 100 mm maträtt).
- Inkubera cellerna i en inkubator (37 ° C med 5% CO2) i 5 min.
- Kolla cellerna med Mikroskop för att kontrollera att alla celler har lossnat från kultur skålen.
- Tillsätt 8 mL DMEM med 10% FBS att neutralisera den enzymatiska reaktionen och, sedan, samla cellerna i en 15 mL tub.
- Centrifugera vid 200 x g för 5 min att få cellpelleten.
- Avlägsna supernatanten långsamt och, sedan Återsuspendera cellpelleten med 10 mL av SFM medium och räkna antalet celler.
- Tallrik 1 x 106 celler med 10 mL SFM i varje 100 mm cell skålen.
- Ändra på medellång varje 2 d.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schematiskt diagram av den nya metoden (figur 1A) och den konventionella metoden (figur 1B) presenteras i figur 1. Den konventionella metoden är en två-stegs matsmältningen, vilket kräver en 2-dagars procedur. Den nya metoden är däremot en one-step matsmältningen, vilket tar cirka 3 timmar för att utföra. Ännu viktigare, kan one-step nya metoden få två populationer (epidermal och dermal celler) samtidigt, vilket beror på förekomsten av Y-27632 i inympning medium. Dessutom ursprungliga kultur tid av epidermala celler att nå runt 80% sammanflödet vanligtvis tar minst 3 dagar mindre än den konventionella metoden om samma antal celler inokuleras efter isolering.
Den nya metoden ger flera primära epidermala celler, som växer i en koloni morfologi. De isolerade HKCs från mänsklig hud vävnader var inokuleras med G-medium som innehåller Y-27632. Samma antal celler var klädd den konventionella metod som kontroll. Representativa bilder av de epidermala cellerna på dag 3 och 5 efter den inledande inympningen visas i figur 2A. De celler som erhållits från den nya metoden som tenderade att växa som en koloni morfologi. Tillväxtkurvan efter inympningen bedömdes med hjälp av en cell som räknar kit-8 (CCK-8) vid olika tidpunkter efter inympningen (figur 2B), och den fördubbling tid är cirka 3-4 dagar för celler som utarbetats av den nya metoden men är cirka 6-8 dagar för den konventionell metod. Dag 7 beräknades avkastningarna av cellerna. Resultaten visas i figur 2 c, som visar att den nya metoden gav tre gånger fler celler än den konventionella metoden och att den tid som behövs för att nå sammanflödet efter första inympningen var minst 3 dagar mindre (figur 2D). Dag 7 nådde de epidermala cellerna sammanflödet med den nya metoden, men inte med den konventionella metoden (figur 2D).
Den nya metoden förbättras uttrycket av α6-integrin av de primära cellerna. Α6-integrin har visat att uttryckas mycket av epidermal stamceller15. Celler som isolerats av den nya metoden underhålls kännetecknen av hudens basala celler efter flera passager. Kolonin tillväxt är ett av kännetecknen av epidermal stamceller som härrör från de basala lagret av huden, och en hög nivå av α6-integrin uttryck är en annan funktion av dessa epidermal stamceller. Vi hittade att tillägg av Y-27632 avsevärt ökat uttryck av α6-integrin i epidermala celler på passage 3 (Figur 3A-B), och vid passagen 3, epidermala celler isolerade med nya metoden visar ingen förorening av dermal celler 13. det är mycket viktigt att bibehålla funktionerna som basalcellscancer efter flera passager under in vitro- expansionen. Immunofluorescens (om) analysen av basalcellscancer markör keratin 5 och terminal differentiering markör loricrin16 utfördes med dessa celler efter tre passager. Vi funnit att 90% av alla celler var K5-positiva men mindre än 10% av dem uttryckte loricrin (figur 3 c - 3D). Dessa resultat indikerar att primär HKCs isolerade med hjälp av den nya metoden innehåller en epidermal stamceller befolkning och kan behålla de karakteristiska dragen i basala celler. Men ju längre att HKCs är anpassade, desto mer börjar de differentiera. Av den nya metoden hittade vi den epidermala celler odlade i vitro kunde bibehålla deras spridning förmåga till passagen 8. Slutligen, vi testade renheten av epidermala celler isolerade med den nya metoden, eftersom en blandning av epidermal och dermal celler var inokuleras direkt efter isolering. Med en kort tid (2-3 min) behandling med trypsin att avlägsna några dermal celler kontaminerande den ursprungliga kulturen, erhölls en relativt ren population av epidermala celler efter en passage (figur 4).
Figur 1 : Jämförelse av förfaranden som ny och konventionell isolering. (A) denna panel visar en schematisk representation av den nya metoden som isolering. På dag 1 inokuleras dissocierade hudceller i G-medium med eller utan Y-27632. I närvaro av Y-27632 för 2 dagar expandera de epidermala cellerna selektivt. Runt dag 6, nå cellerna en densitet som är tillräckligt nog för passaging. (B) denna panel visar en schematisk representation av metoden konventionell isolering. Epidermis avskiljs från dermis och de epidermala cellerna isoleras på dag 2, och vanligtvis cellerna nå en densitet som är tillräckligt nog för passaging på cirka 10 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Den nya isolering-metoden ökar avkastningen av primära epidermala celler. (A) denna panel visar representativa bilder av epidermala celler som utarbetats av den nya metoden (översta raden) och av den konventionella metoden (nedersta raden) på dag 3 och 5 efter den inledande inympningen. Skala barer = 200 µm. (B) primära HKCs utarbetats av den nya och den konventionella metoder samlades vid angivna tidpunkter för analys av viabla celler med hjälp av en cell som räknar kit-8 (CCK-8). (C) det totala antalet celler som utarbetats av den nya metoden och av den konventionella metoden räknades dag 7 efter inympningen. (D) Genomsnittlig tid för att nå sammanflödet av primära epidermala celler (passage 0) visas för både metoden ny isolering och den konventionella metoden. För paneler B - D: Student's t-test användes; felstaplar visar den standard variationen; n = 4; p < 0,01, * p < 0,05 när man jämför den nya metoden med den konventionella metoden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Primära epidermala celler som erhållits genom den nya metoden ska kunna upprätthålla basalcellscancer funktioner under in vitro- expansion. (A) i denna panel visas en FACS analys av α6-integrin uttryck av epidermala celler på passage 3 behandlas med Y-27632 (Y-27632, röd) eller utan Y-27632 (kontroll, grå) för 48 h. (B) i denna panel visas en kvantifiering analys av celler med hög uttrycksnivåerna för α6-integrin från panel A; hög α6-integrin uttryck definieras som en signal > 103, ** p < 0,01. (C) i denna panel visas representativa bilder av immunofluorescens färgning av K5 (röd) och loricrin (röd); DAPI (blå) användes för att färga atomkärnor. Skala barer = 100 µm. (D), denna panel visar en kvantifiering analys av K5 - och loricrin-positiva celler. Totalt 400 celler räknades för att kvantifiera varje grupp, och det genomsnittliga antalet K5 - och loricrin-positiva celler visas. Experimentet upprepades självständigt 4 gånger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Efter den inledande passagen, erhölls relativt ren epidermala celler med hjälp av den nya metoden. (A) denna panel visar representativa bilder av immunofluorescens färgning av vimentin (röd) för epidermala celler på passager 0 (P0) och 3 (P3); DAPI (blå) användes för att färga atomkärnor. Skala barer = 50 µm. (B) denna panel visar en kvantifiering analys av vimentin-positiva celler vid passager 0 (P0) och 1 (P1). Totalt 400 celler räknades för att kvantifiera varje grupp, och det genomsnittliga antalet vimentin-positiva celler visas. Experimentet upprepades självständigt 4 gånger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Odlade primära HKCs allmänt har använts för att behandla sår i kliniker för mer än tre decennier och, sedan den tiden, det har alltid varit viktigt att effektivt skaffa tillräckligt antal celler för kliniska tillämpningar i tid. Därför i praktiken gör metoden konventionell isolering, som kräver separation av överhuden från läderhuden, det svårt att uppfylla dessa krav, på grund av den låga avkastningen av celler och låg förmåga att passage vuxna celler. Här beskriver vi en ny enkel metod vi utvecklat för att effektivt få HKCs från adult vävnad baserat på tidigare rapporter13,14, som är mer lämplig både för laboratorium och för kliniska tillämpningar.
Uppmärksamhet måste ägnas följande kritiska steg att uppnå bästa resultat för den nya metoden. Det första är förfarandet homogenisering ett avgörande steg. otillräcklig homogenisering tydligt påverkar effektiviteten av enzymatisk nedbrytning och resultatet i en låg avkastning av dissocierade celler. Det andra bör steget trypsin matsmältning inte ta mer än 30 min; annars minskar lönsamheten för de dissocierade cellerna. För det tredje, för att effektivt samla dissocierade cellerna, porstorlek av cell silen används för filtrering bör 100 µm, och en enda SIL bör användas för att filtrera mer än 20 mL cell lösning. Fjärde, tätheten av inledande plätering är en viktig faktor för att minimera kontaminering med dermal celler, eftersom en hög cell densiteten minskar avsevärt den hämmande effekten av Y-27632 på dermal celler. Därför är det avgörande att noggrant räkna antalet dissocierade celler i slutet av isolering förfarandet vid plätering.
Först, den nya metoden förenklar förfarandet isolering: konventionell isolering tvåstegsförfarandet tar oftast 2 dagar att utföra, och förfarandet för trimning är avgörande för att helt ta bort fettvävnad från huden, speciellt för vuxna vävnader ( Figur 1); annars finns det en ineffektiv separation av epidermis från dermis efter övernattning matsmältningen med dispase. Genom att utnyttja Y-27632, som hämmar tillväxten av dermal celler efter inympningen13, den nya metoden behöver inte skiljer överhuden från läderhuden och, trimning förfarandet att avlägsna fettvävnad är därför inte nödvändigt för den nya metoden, som bara behöver en halvdag ska utföras. För det andra, den nya metoden också förenklar kultur eftersom, med den traditionella metoden, de dissocierade cellerna odlas oftast på ett feeder lager av bestrålade mus fibroblaster i medium innehållande 10% FBS eller i en kollagen-förbelagts maträtt. Animaliska komponenter är alltid riskfaktorer som bör undvikas för kliniska tillämpningar. Vi utvecklat ett serumfritt luftkonditionerade inympning medium (G-medium), som inte kräver ett precoating steg för kultur rätter och även förbättrar avkastningen av primära keratinocyter13 eftersom G-medium kombinerat med Y-27632 främjar fastsättning av epidermala celler till kulturen fat13,17,18. Därför, den nya metoden underlättar förfarandet kultur och är också en relativt säker procedur för kliniska tillämpningar utan tillsats av animaliska komponenter. Tredje, den nya metoden förbättrar avkastningen av primära epidermala celler och förkortar inledande kultur tiden behövs för att nå sammanflödet. Jämfört med den traditionella metoden, utbytet av celler som produceras av den nya metoden är ungefär 3 gånger högre, och den första passagen av epidermala celler nådde sammanflödet minst 3 dagar tidigare (figur 2). Slutligen, den nya metoden kan utnyttjas för isolering av epidermala celler från alla typer av hud prover, såsom hårig hårbotten huden och vuxen huden vävnader med ett tjockt fettlager, som har testats i en tidigare rapport13.
Hög potential primära HKCs har använts för laboratorieforskning och kliniska tillämpningar. Denna nya metod ökar potentialen i odlade celler med kännetecken för epidermal stamceller13. Y-27632 förbättrar α6-integrin uttrycket av HKCs och efter tre passager, mer än 90% av de odlade epidermala cellerna uttryckt basalcellscancer markör keratin 5 och färre än 10% av cellerna uttryckt differentiering markören Loricrin, vilket tyder på att dessa celler hålla kännetecknen av hudens basala celler efter flera passager. Kultur-utökade epidermala cellerna kan rekonstruera hud i vivo efter ympning13, vilket tyder på att de besitter regenerering potentiella efter expansion i kultur. Framför allt, är den nya metoden idealisk för att isolera celler från vuxna vävnader, som nämnts ovan. Därför epidermala celler som utarbetats av denna metod kan användas för in vitro- och in-vivo modeller för att studera hudsjukdomar och kan utvecklas till autolog cellbaserade produkter för kliniska tillämpningar såsom behandling av hudsår.
Sammanfattningsvis ger det nya protokollet ett förenklat och effektivt förfarande för att isolera och expandera primära epidermala celler från vuxna hudens vävnad. Denna avancerade metod är mer lämplig för att producera stora mängder hög potential epidermala celler både laboratorium och kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds av nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (2017YFA0104604), General programet av National Natural Science Foundation Kina (NSFC, 81772093), vetenskap och teknik Development Program av Suzhou (ZXL2015128), Naturvetenskap Foundation i Jiangsuprovinsen (BK20161241), och en Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C.
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E.
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
